猫杯状病毒实时荧光定量逆转录PCR检测方法的建立

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作者 李静怡 熊雷 +4 位作者 黄莉璎 刘晓鹏 杨盛奋 金京勋 王弋 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第12期64-72,共9页

为了建立可快速检测猫杯状病毒(FCV)的方法,本试验采用肽核酸(PNA)设计分子信标荧光探针,优化反应体系和条件,建立了FCV实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测方法,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,并进行临床样本检测。结果显... 为了建立可快速检测猫杯状病毒(FCV)的方法,本试验采用肽核酸(PNA)设计分子信标荧光探针,优化反应体系和条件,建立了FCV实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测方法,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,并进行临床样本检测。结果显示,建立的RT-qPCR检测FCV参考株具有良好的线性关系(R^(2)=0.9995),最低检测限为1×10^(2)TCID_(50)/mL,对其他相关病毒无有效响应,组内变异系数和组间变异系数均小于1%。应用该方法检测33份临床样本,阳性率为51.5%。由此可见,本试验建立的RT-qPCR敏感性、特异性和重复性均良好,可为FCV的早期快速诊断和疫病防控等提供检测手段。 展开更多

关键词 猫杯状病毒(FCV) 肽核酸(PNA) 分子信标荧光探针 实时荧光定量逆转录pcr(RT-qpcr) 开放阅读框(ORF)

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一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立 被引量：38

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作者 包静月 李林 +3 位作者 王志亮 李金明 刘春菊 肖肖 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第8期21-23,共3页

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反... 建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 一步法实时定量RT—pcr 检测

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实时荧光定量RT-PCR分析非小细胞肺癌SATB1的表达和临床病理意义 被引量：32

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作者 周来勇 刘芳 +3 位作者 童健 陈群请 张福伟 郭琳琅 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期534-537,共4页

目的检测非小细胞肺癌组织中SATB1 mRNA的表达,探讨SATB1表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床病理意义。方法用TRIZOL提取非小细胞肺癌组织和正常肺组织总RNA后,将其反转录为cDNA,以实时荧光定量RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组... 目的检测非小细胞肺癌组织中SATB1 mRNA的表达,探讨SATB1表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床病理意义。方法用TRIZOL提取非小细胞肺癌组织和正常肺组织总RNA后,将其反转录为cDNA,以实时荧光定量RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组织及正常肺组织中SATB1 mRNA的表达,分析SATB1基因表达与临床病理参数的相关性。结果癌组织中SATB1 mRNA表达量为正常组织13倍,两者差异显著(P<0.001),其中有、无转移组分别为正常组织23.63倍和5.57倍。结论SATB1 mRNA的表达水平可能与非小细胞肺癌发生发展及淋巴转移有关,有望成为判断非小细胞肺癌预后的一个指标。 展开更多

关键词 非小细胞肺癌 SATB1 mRNA 实时荧光定量RT-pcr

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含尼帕病毒N基因和L基因的假病毒构建及其应用

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作者 崔超杰 张慧 +7 位作者 刘春菊 魏荣 张永强 崔进 戈胜强 李金明 蔡玉梅 王志亮 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第7期56-62,共7页

尼帕病毒(NiV)作为高致死率的人兽共患病病原,受到世界各国广泛关注。为了获得快速灵敏的检测方法和安全稳定的阳性标准品,本试验将NiV N和L基因同时插入假病毒转移质粒PLJM-GFP中,与包装质粒共转染人胚胎肾(HEK293T)细胞,收集并浓缩病... 尼帕病毒(NiV)作为高致死率的人兽共患病病原,受到世界各国广泛关注。为了获得快速灵敏的检测方法和安全稳定的阳性标准品,本试验将NiV N和L基因同时插入假病毒转移质粒PLJM-GFP中,与包装质粒共转染人胚胎肾(HEK293T)细胞,收集并浓缩病毒液,测定转染后48和72 h收集的假病毒滴度,于透射电子显微镜下观察假病毒形态,并进行PCR扩增和测序鉴定。以世界动物卫生组织推荐的NiV检测引物对包装的假病毒进行验证,应用实时荧光定量PCR(q PCR)技术对不同标准和文献中的4对NiV检测引物进行特异性和敏感性分析,并对构建的NiV假病毒进行均一性试验、短期稳定性试验和抗RNase A降解试验。结果显示,转染后48和72 h收集的假病毒滴度分别可达2.72×10^(5)和3.47×10^(4)IU/m L,电子显微镜下假病毒呈圆形、有囊膜的颗粒。测序结果显示,NiV假病毒核酸中成功插入N和L基因片段;4对NiV检测引物特异性良好,均可用于NiV检测,其中,在研国家标准检测方法中引物的灵敏性更高,病毒的检测下限为10^(0)IU/m L;NiV假病毒均一性良好,可在4℃条件下稳定保存至少7 d,且能够抵抗一定量的RNase A降解。本试验成功包装含有NiV N基因和L基因的假病毒,并对其进行初步应用和稳定性研究,为尼帕病毒性脑炎的防控提供物质储备。 展开更多

关键词 尼帕病毒(NiV) 假病毒构建 实时荧光定量逆转录pcr(qRT-pcr) 敏感性试验

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‘琯溪蜜柚’荧光定量PCR内参基因的筛选 被引量：16

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作者 王梨嬛 潘永娟 +2 位作者 杨莉 蔡盛华 黄新忠 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期48-54,共7页

【目的】为了克隆‘琯溪蜜柚’的管家基因,并筛选合适的管家基因作为内参,【方法】以‘琯溪蜜柚’盛花期后5个不同时期的果实汁胞,以及根﹑茎﹑叶为材料,采用实时荧光定量PCR技术,分析actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α和Ubiquitin ... 【目的】为了克隆‘琯溪蜜柚’的管家基因,并筛选合适的管家基因作为内参,【方法】以‘琯溪蜜柚’盛花期后5个不同时期的果实汁胞,以及根﹑茎﹑叶为材料,采用实时荧光定量PCR技术,分析actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α和Ubiquitin 5个管家基因在不同材料中的表达情况,并结合geNorm、NormFinder﹑comparative Delta-CT和BestKeeper 4种评估方法进行稳定性分析。【结果】结果表明,actin1和β-tubulin是‘琯溪蜜柚’果实发育进程中较为稳定的内参基因,而EF1-α和β-tubulin则是研究不同组织特定靶基因表达中稳定的内参基因。【结论】筛选出了‘琯溪蜜柚’最佳的内参基因β-tubulin,为今后目的基因的表达分析奠定了基础。 展开更多

关键词 '琯溪蜜柚’ 荧光定量pcr 内参基因

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应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性 被引量：3

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作者 许炎 张晨 +5 位作者 徐庆文 黄江平 刘亚楠 邹凯南 平原 周怀谷 《法医学杂志》 CAS CSCD 2013年第4期259-262,共4页

目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse tr... 目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。 展开更多

关键词 法医遗传学 反转录pcr 实时荧光定量pcr 血液 唾液 精液

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体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板 被引量：4

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作者 孙军峰 刘华雷 +1 位作者 张维 王志亮 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第4期43-46,共4页

本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性... 本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性范围和特异性,模板稀释度为2.95×104～2.95×108拷贝/L时,相关系数为0.998。该模板稳定性好,-80℃保存30 d后无显著变化。浓度为2.95×104～2.95×108拷贝/μL的标准品的变异系数分别为0.20%、0.28%、1.00%、0.54%、0.52%,表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。 展开更多

关键词 新城疫病毒 体外转录 一步法荧光定量RT-pcr

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采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨 被引量：6

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作者 汤贤英 孙永苹 +4 位作者 马锐 朱红倩 田祖国 孙万邦 姚新生 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期727-730,共4页

目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上... 目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRalpha胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果:正常人外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCRalpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。 展开更多

关键词 T淋巴细胞受体 互补决定区3 荧光定量pcr 溶解曲线

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樱桃病毒A实时荧光定量PCR检测技术的建立与应用 被引量：1

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作者 刘欢 刘格 李锐 《湖北农业科学》 2023年第7期163-169,共7页

在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特... 在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特异性强的引物(CVA-dF2、CVA-dR2),基于SYBR Green I荧光染料建立反转录实时荧光定量PCR检测CVA的方法。该方法重复性好、灵敏度高,无需借助内参基因即可准确检测目的病毒载量,绝对定量标准曲线斜率为-3.5746,决定系数R2为0.9986,扩增效率为0.9044,比常规RT-PCR检测灵敏度高10倍。该方法的建立为CVA定量研究提供了有力工具,可用于果树中CVA批量检测或低丰度病毒样品检测。 展开更多

关键词 樱桃病毒A(CVA) 反转录实时荧光定量pcr 快速检测

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不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

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作者 徐凤霞 孙万里 +3 位作者 张亚文 常爽 王一新 赵鹏 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第4期11-17,共7页

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感... 为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示:(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21~70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊感染同居组的10只SPF鸡在感染后第7天时即检测到2只鸡呈病毒血症阳性,腹腔感染同居组SPF鸡在感染后第21天时检测到1只鸡呈阳性;(4)3种检测方法中,RT-qPCR和IFA检出REV效果更好。本试验通过分析不同途径感染REV后鸡群血浆中的带毒状态,为REV感染的科学防控和净化提供参考数据。 展开更多

关键词 禽网状内皮组织增殖病病毒(REV) 排毒规律 反转录pcr(RT-pcr) 实时荧光定量pcr(RT-qpcr) 间接免疫荧光试验(IFA)

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长链非编码RNA MEG3在胃癌中的表达及其与预后的关系 被引量：13

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作者 孟菲菲 司君利 +3 位作者 刘璐 崔京远 亓玉琴 吕梅 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2016年第15期659-662,共4页

目的:研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)在胃癌组织中的表达及其与预后的关系,并进一步探讨MEG3与凋亡相关蛋白P53、鼠双微基因2(murine double minute 2,MDM2)的相关性... 目的:研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)在胃癌组织中的表达及其与预后的关系,并进一步探讨MEG3与凋亡相关蛋白P53、鼠双微基因2(murine double minute 2,MDM2)的相关性。方法:收集2012年9月至2013年6月青岛大学附属青岛市市立医院55例行手术治疗的胃癌切除标本(包括癌组织及对应的远端正常组织),实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测胃癌组织中MEG3的表达,并分析其与临床病理参数的关系;应用免疫蛋白印迹法(Western blot)检测胃癌中P53、MDM2蛋白的表达水平,并分析其与MEG3的相关性。结果:lnc RNA MEG3在胃癌组织的相对表达水平(7.98±0.19)低于所对应的正常组织(9.47±0.18,P<0.05);在胃癌组织(r=-0.627,P<0.001)及远端正常组织(r=-0.807,P<0.001)中,P53与MDM2的表达呈负相关;P53与MEG3的表达呈正相关(r=0.591,P<0.05),MDM2与MEG3的表达呈负相关(r=-0.346,P<0.05);MEG3高表达者较低表达者中位生存期明显延长。结论:MEG3在胃癌发生发展过程中起抑癌基因的作用;MEG3与P53、MDM2在胃癌发生发展的生物学机制上有重要联系;检测MEG3的表达水平对胃癌预后有潜在价值。 展开更多

关键词 胃癌 长链非编码RNA 母系表达基因3 实时荧光定量pcr

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博尔纳病毒在宁夏的人和动物感染的检测 被引量：3

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作者 刘建 马彦 +2 位作者 张颖 王振海 谢鹏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期389-393,共5页

目的对临床VE患者以及其本人接触动物的检测,探讨BDV在宁夏地区的感染状况及感染机制,并分析BDV核酸和转化后的氨基酸序列,构建病毒种系发生的来源。方法应用巢式逆转录酶聚合酶链反应结合荧光定量PCR检测患者及其接触的动物的外周血单... 目的对临床VE患者以及其本人接触动物的检测,探讨BDV在宁夏地区的感染状况及感染机制,并分析BDV核酸和转化后的氨基酸序列,构建病毒种系发生的来源。方法应用巢式逆转录酶聚合酶链反应结合荧光定量PCR检测患者及其接触的动物的外周血单核细胞的p24和p40基因片段。对检测阳性标本进行连接测序,应用MEGA和DnaSP4.0软件对测序结果同国外的标准株HE80、H1766、strainV等进行核酸和氨基酸序列对比分析,并构建病毒基因的系统发生树。结果在60例VE患者及其接触的710绵羊中,PCR检测发现有3例阳性,阳性检出率5%;9头绵羊阳性,阳性检出率为1.27%。基因聚合分析显示人和动物BDV的核酸序列和编码氨基酸序列与德国马源性的HE80株同源性高达100%,重构基因系统发生树可见宁夏VE患者和牛羊BDV核苷酸序列与国外的标准株形成宁夏-德国-日本的混合支系,同时宁夏绵羊BDV序列也形成了一个独立的支系。结论宁夏地区人和牛羊存在BDV的自然感染,并且人的感染存在动物源性,其传染途径很可能是呼吸道的传播可能引起脑炎的非特异性的临床症状,病毒在种系发生中与德国马源性HE80株有极高的同源性,病毒可能由国外引入本土,不排除病毒株变异的可能,人和绵羊之间存在相互传染的可能。 展开更多

关键词 博尔纳病毒 感染 巢式逆转录实时荧光定量pcr

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纳米羟磷灰石/聚酰胺66对成骨细胞生物学作用的实验研究 被引量：6

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作者 叶玲 苏勤 周学东 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期142-144,共3页

目的研究新型纳米根管充填材料纳米羟磷灰石/聚酰胺66(nHA_PA66)对成骨细胞的生物学作用。方法以含nHA_PA66的细胞培养基(DMEM)浸提液作用于实验组细胞,DMEM培养基作用于对照组细胞,采用MTT比色法检测nHA_PA66对成骨细胞生长的影响;酶... 目的研究新型纳米根管充填材料纳米羟磷灰石/聚酰胺66(nHA_PA66)对成骨细胞的生物学作用。方法以含nHA_PA66的细胞培养基(DMEM)浸提液作用于实验组细胞,DMEM培养基作用于对照组细胞,采用MTT比色法检测nHA_PA66对成骨细胞生长的影响;酶联法检测细胞ALP活性的变化;QRT_PCR测量细胞骨钙素基因表达的变化。结果实验组细胞的相对增殖率在98%～106%之间,且无量效关系,实验组与对照组间无显著性差异(P>0.05);实验组和对照组细胞的ALP活性及骨钙素基因表达相似,皆无显著性差异(P>0.05)。结论nHA_PA66对成骨细胞的生长和功能无不良影响,具有骨细胞相容性。 展开更多

关键词 纳米羟磷灰石/聚酰胺66 实时定量pcr 成骨细胞

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共轭亚油酸对脂肪代谢相关基因表达的影响 被引量：3

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作者 李杰梅 徐娟娟 +1 位作者 杨得坡 陈家树 《天然产物研究与开发》 CAS CSCD 2011年第4期704-708,共5页

本文利用实时定量PCR的测定方法,分析了两种共轭亚油酸(CLA)异构体对3T3-L1小鼠前脂肪细胞脂肪代谢相关基因表达的影响。本研究CLA异构体的处理浓度和时间为75.4μmol/L,8 d,测定了与能量代谢、细胞凋亡、脂肪酸氧化作用和脂解作用相关... 本文利用实时定量PCR的测定方法,分析了两种共轭亚油酸(CLA)异构体对3T3-L1小鼠前脂肪细胞脂肪代谢相关基因表达的影响。本研究CLA异构体的处理浓度和时间为75.4μmol/L,8 d,测定了与能量代谢、细胞凋亡、脂肪酸氧化作用和脂解作用相关的多种基因的mRNA水平。结果显示:两种异构体均能够显著提高UCP1、UCP3、Perilipin和PPARα的mRNA水平,而抑制UCP2的表达水平(P<0.01)。与cis-9t,rans-11CLA相比t,rans-10c,is-12 CLA显著提高PKA(P<0.05)、CPT-1和TNF-α(P<0.01)的mRNA水平。与对照组相比,两种CLA异构体处理组均对HSL、ATGL、ACO和Leptin的基因表达无显著影响。 展开更多

关键词 共轭亚油酸 异构体 荧光定量pcr 3T3-L1

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SALL4在肝癌中的表达及其对预后的影响 被引量：5

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作者 王亚婷 何彩霞 +3 位作者 卢振辉 王琦 杨少奇 李洋 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期113-117,共5页

目的 检测人类婆罗双树样基因4（SALL4）在肝癌中的表达情况,探讨SALL4表达与原发性肝细胞癌（HCC）患者预后的相关性。方法 应用免疫组织化学法检测60例石蜡HCC标本及其中32例癌旁组织标本SALL4蛋白的表达,分析其与HCC患者临床病理学... 目的 检测人类婆罗双树样基因4（SALL4）在肝癌中的表达情况,探讨SALL4表达与原发性肝细胞癌（HCC）患者预后的相关性。方法 应用免疫组织化学法检测60例石蜡HCC标本及其中32例癌旁组织标本SALL4蛋白的表达,分析其与HCC患者临床病理学资料及预后的关系;采用荧光定量RT-PCR、Western blot法,分别检测23例新鲜HCC及癌旁肝组织中SALL4mRNA和蛋白的相对含量。结果 HCC组织中SALL4蛋白的表达率（81.67%,49/60）显著高于癌旁组织（6.25%,2/32）,差异有统计学意义（χ~2=48.047,P〈0.01）;SALL4蛋白在HCC中的表达与甲胎蛋白水平有关（P〈0.05）;SALL4高表达和低表达组患者的平均生存时间分别为（26.20±2.37、34.05±1.26）个月,SALL4高表达组患者的1、3年生存率（75.9%、55.2%）显著低于SALL4低表达组1、3年生存率（95.0%、85.0%,χ~2=5.044,P〈0.05）。肝癌及癌旁组织的SALL4mRNA的相对量分别为14.80±8.62、0.17±0.13,两组比较差异有统计学意义（t=8.14,P〈0.01）。Western blot检测结果显示,SALL4蛋白在HCC中的相对量为0.354±0.103。癌旁组织中几乎不表达。结论 SALL4表达与肝癌患者预后密切相关,可作为肝癌患者判断预后的预测指标。 展开更多

关键词 肝癌 SALL4基因 免疫组织化学 WESTERN BLOT 实时荧光定量pcr

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米蛾β-actin基因cDNA片段的克隆及表达量检测

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作者 丛斌 张明珠 +4 位作者 胡志凤 段立佳 王晓静 张统书 董辉 《沈阳农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期24-28,共5页

为克隆米蛾[Corcyra cephalonica(Stainton)]β-actin基因cDNA片段,建立米蛾β-actin基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得米蛾β-actin基因cDNA片段... 为克隆米蛾[Corcyra cephalonica(Stainton)]β-actin基因cDNA片段,建立米蛾β-actin基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得米蛾β-actin基因cDNA片段,采用SYBR GreenⅠ染料法建立qRT-PCR方法,检测在米蛾卵、幼虫、蛹和成虫4个虫态中β-actin基因的表达量。获得了长为822bp的米蛾β-actin基因片段(Gen Bank accession:KJ599569),编码273个氨基酸残基;荧光定量标准曲线的Ct值检测范围为13~28,扩增效率为90.1%,相关系数R^2=0.992,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm值为(84±0.5)℃,符合定量要求;实时荧光定量结果表明,β-actin基因在米蛾不同发育历期中的表达水平无显著性差异(p>0.05)。成功建立了米蛾β-actin基因qRT-PCR方法 ,β-actin基因可以作为米蛾基因表达定量研究中的可靠内参基因。研究结果为β-actin作内参基因进行米蛾功能基因表达差异研究奠定了分子基础。 展开更多

关键词 米蛾 Β-ACTIN基因 反转录pcr 实时荧光定量pcr

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反义hTERT体外抑制白血病细胞增殖的研究

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作者 孙来保 李成荣 +4 位作者 文剑明 王国兵 张萌 杨军 李若馨 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第5期521-524,共4页

目的研究反义hTERT基因对白血病细胞体外增殖的抑制作用。方法体外通过SuperFect将已构建好的正、反义hTERT真核表达载体转染HL60白血病细胞,再经过G418及PCR筛选鉴定分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞HL60-s和HL60-as。随后... 目的研究反义hTERT基因对白血病细胞体外增殖的抑制作用。方法体外通过SuperFect将已构建好的正、反义hTERT真核表达载体转染HL60白血病细胞,再经过G418及PCR筛选鉴定分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞HL60-s和HL60-as。随后运用实时荧光定量RT-PCR技术及TRAP-银染法对各组细胞内源性hTERT mRNA的表达情况及端粒酶的活性进行检测。同时还采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析反义hTERT对白血病细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡。结果与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低HL60细胞内源性hTERT mRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。当各组细胞传至第25代后,与HL60、HL60-s比较,HL60-as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加。结论反义hTERT在体外能抑制白血病细胞的生长增殖能力,其潜在、广谱的抗肿瘤作用的分子生物学机制可能是首先通过抑制和下调hTERT表达(端粒酶活性)而最终引发瘤细胞衰亡的途径来实现的。 展开更多

关键词 反义HTERT 白血病 细胞增殖 分子生物学 治疗

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鼻咽癌患者外周血端粒酶hTERT mRNA的定量检测及其临床意义 被引量：5

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作者 付新洒 申聪香 +2 位作者 李冠雪 张鑫雨 文忠 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期894-897,共4页

目的定量检测鼻咽癌患者外周血中端粒酶逆转录酶催化亚单位(h TERT)m RNA的表达,并探讨其在鼻咽癌中的诊断及治疗意义。方法采用实时荧光定量PCR技术(QPCR)检测33例鼻咽癌患者治疗(放疗或化疗)前后血浆中h TERT m RNA的表达,并分析其与... 目的定量检测鼻咽癌患者外周血中端粒酶逆转录酶催化亚单位(h TERT)m RNA的表达,并探讨其在鼻咽癌中的诊断及治疗意义。方法采用实时荧光定量PCR技术(QPCR)检测33例鼻咽癌患者治疗(放疗或化疗)前后血浆中h TERT m RNA的表达,并分析其与临床病理因素的关联,以24例健康志愿者作为对照。结果结果显示,健康志愿者血浆中h TERT m RNA相对表达量为0.95±0.37,鼻咽癌患者血浆中h TERT m RNA含量达到10.75±4.29(P<0.05)。鼻咽癌患者血浆中h TERT m RNA的表达与年龄、性别无统计学差异(P>0.05),而与临床分期、T分期及N分期有显著性差异(P<0.05)。早期患者(Ⅰ、Ⅱ期),放疗后其表达量3.43±1.42较治疗前5.60±2.33明显下降;晚期患者(Ⅲ、Ⅳ期)诱导化疗及放疗后其表达量较治疗前12.68±3.08分别降为10.68±2.48、3.13±1.69(P<0.05)。结论鼻咽癌患者血浆中h TERT m RNA的表达明显升高,放化疗能够有效抑制该基因的表达,而且该基因的含量与肿瘤的临床分期、大小及淋巴结浸润范围等临床病理因素密切相关,从而提示检测鼻咽癌患者外周血中h TERT m RNA的含量,有可能为鼻咽癌患者早期诊断及疗效判断提供重要信息。 展开更多

关键词 鼻咽癌 血浆 实时荧光定量 HTERT MRNA

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