AIM: The manner in which a cell responds to and influences its environment is ultimately determined by the genes that are expressed. To better understand cellular functions, the isolation of single cells and subsequen...AIM: The manner in which a cell responds to and influences its environment is ultimately determined by the genes that are expressed. To better understand cellular functions, the isolation of single cells and subsequent quantification of the expressed genes is essential. METHODS: Normal liver tissue was obtained from operation, snap-frozen in liquid nitrogen and sectioned in crystat. Individual hepatocytes were microdissected. RNA was extracted, then reverse transcribed and amplified using real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR). RESULTS: Single hepatocytes were dissected by laser beam and catapulted to the microcentrifuge cap which was put above the slide. In this way, cells were collected, RNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and used for analysis of RNA expression by real-time quantitative PCR. The amplification results showed that quantitation of the RNA inside the cell was compatible with the number of cells. CONCLUSION: The expression of RNA in single cells can be quantitated successfully by using laser microdissection and real-time PCR. These techniques provide an opportunity to monitor in vivo gene expression levels in single hepatocytes.展开更多
为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombina...为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。展开更多
随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法...随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法这2种不同预处理方法下,使用2种广泛采用的DNA提取方法(FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒、天根Magnetic Soil and Stool DNA Kit磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒),对水样中的DNA进行提取,然后建立qPCR方法进一步对12种抗生素抗性基因和1类整合子进行定量检测。本研究拟从菌体富集效率、DNA提取效果和定量质控等方面优化预处理、DNA提取和qPCR定量检测等步骤。结果发现,直接过膜的前处理方法使得DNA提取浓度和菌体富集效率更高。FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒提取的DNA浓度更高。同时,建议在定量过程中添加以超纯水为基质的空白对照来避免引物二聚体的干扰。为了减少qPCR测量的变异性并提高精密度,每次qPCR运行包括一式三份的标准曲线的样品,并添加阳性对照。使用认证的标准品验证qPCR所得结果的正确度,以提高准确性并支持实验室间的均一性。本研究旨在提供一种可靠高效的抗生素ARGs的qPCR检测技术,为构建水环境中抗生素ARGs检测的质量控制体系提供了参考。展开更多
目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-...目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-Ti me PCR方法有很好的特异性与敏感性,所检测沙门菌结果均为阳性,而非沙门菌均为阴性;标准曲线相关系数为R2=0.993,其敏感性为5CFU。运用该方法对108份鸡粪便、50份鸡肉以及58份水样进行检测,阳性率分别为3.7%(6/108)、4%(2/50)和3.4%(2/58),与传统细菌分离检测结果相符。结论结果表明该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点,此研究为环境及疾病诊断中沙门菌快速检测提供了新方法。展开更多
目的沙眼衣原体感染是最常见的性传播疾病,本文拟建立一种准确快速、标准化的感染动物组织衣原体载量检测体系。方法体外扩增感染用沙眼衣原体血清E型,克隆衣原体特异基因OMP1基因片段作为标准品,用Real time PCR法测定衣原体基因组拷...目的沙眼衣原体感染是最常见的性传播疾病,本文拟建立一种准确快速、标准化的感染动物组织衣原体载量检测体系。方法体外扩增感染用沙眼衣原体血清E型,克隆衣原体特异基因OMP1基因片段作为标准品,用Real time PCR法测定衣原体基因组拷贝数进行衣原体定量。结果 Real time PCR在OMP1基因片段200至2×108拷贝检测结果成线性,在模板中加入小鼠基因组未出现非特异扩增,同时未影响扩增效率。结论针对衣原体特异基因OMP1的实时定量PCR方法可以较为灵敏的特异的定量检测感染动物样本中的衣原体。展开更多
文摘AIM: The manner in which a cell responds to and influences its environment is ultimately determined by the genes that are expressed. To better understand cellular functions, the isolation of single cells and subsequent quantification of the expressed genes is essential. METHODS: Normal liver tissue was obtained from operation, snap-frozen in liquid nitrogen and sectioned in crystat. Individual hepatocytes were microdissected. RNA was extracted, then reverse transcribed and amplified using real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR). RESULTS: Single hepatocytes were dissected by laser beam and catapulted to the microcentrifuge cap which was put above the slide. In this way, cells were collected, RNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and used for analysis of RNA expression by real-time quantitative PCR. The amplification results showed that quantitation of the RNA inside the cell was compatible with the number of cells. CONCLUSION: The expression of RNA in single cells can be quantitated successfully by using laser microdissection and real-time PCR. These techniques provide an opportunity to monitor in vivo gene expression levels in single hepatocytes.
文摘为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。
文摘随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法这2种不同预处理方法下,使用2种广泛采用的DNA提取方法(FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒、天根Magnetic Soil and Stool DNA Kit磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒),对水样中的DNA进行提取,然后建立qPCR方法进一步对12种抗生素抗性基因和1类整合子进行定量检测。本研究拟从菌体富集效率、DNA提取效果和定量质控等方面优化预处理、DNA提取和qPCR定量检测等步骤。结果发现,直接过膜的前处理方法使得DNA提取浓度和菌体富集效率更高。FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒提取的DNA浓度更高。同时,建议在定量过程中添加以超纯水为基质的空白对照来避免引物二聚体的干扰。为了减少qPCR测量的变异性并提高精密度,每次qPCR运行包括一式三份的标准曲线的样品,并添加阳性对照。使用认证的标准品验证qPCR所得结果的正确度,以提高准确性并支持实验室间的均一性。本研究旨在提供一种可靠高效的抗生素ARGs的qPCR检测技术,为构建水环境中抗生素ARGs检测的质量控制体系提供了参考。
文摘目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-Ti me PCR方法有很好的特异性与敏感性,所检测沙门菌结果均为阳性,而非沙门菌均为阴性;标准曲线相关系数为R2=0.993,其敏感性为5CFU。运用该方法对108份鸡粪便、50份鸡肉以及58份水样进行检测,阳性率分别为3.7%(6/108)、4%(2/50)和3.4%(2/58),与传统细菌分离检测结果相符。结论结果表明该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点,此研究为环境及疾病诊断中沙门菌快速检测提供了新方法。
文摘目的沙眼衣原体感染是最常见的性传播疾病,本文拟建立一种准确快速、标准化的感染动物组织衣原体载量检测体系。方法体外扩增感染用沙眼衣原体血清E型,克隆衣原体特异基因OMP1基因片段作为标准品,用Real time PCR法测定衣原体基因组拷贝数进行衣原体定量。结果 Real time PCR在OMP1基因片段200至2×108拷贝检测结果成线性,在模板中加入小鼠基因组未出现非特异扩增,同时未影响扩增效率。结论针对衣原体特异基因OMP1的实时定量PCR方法可以较为灵敏的特异的定量检测感染动物样本中的衣原体。
