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4种植物源性成分多重real-time PCR检测方法的建立及其在食用淀粉中的应用 被引量：3
1
作者 范维 高晓月 +4 位作者 董雨馨 刘虹宇 李贺楠 赵文涛 郭文萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第1期210-216,共7页
建立一种可同时快速检测红薯、木薯、马铃薯、玉米源性成分的多重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。分别以红薯g3pdh基因、木薯g3pdh基因、马铃薯UGPase基因、玉米zSSIIb基因为靶基因设计... 建立一种可同时快速检测红薯、木薯、马铃薯、玉米源性成分的多重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。分别以红薯g3pdh基因、木薯g3pdh基因、马铃薯UGPase基因、玉米zSSIIb基因为靶基因设计特异性引物和TaqMan探针,以18S rRNA基因为内参基因,建立多重real-time PCR方法,开展方法学验证,并对不同掺入比例模拟样品和实际淀粉样品进行检测。结果显示,该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高等优点。与15种非目标源性均无交叉反应;对目标DNA的检测灵敏度可达到3×10^(-3) ng/μL,且具有良好的线性关系和扩增效率;对淀粉样品的检出限可达0.1%,对50份实际样品进行检测,结果与参比方法一致,说明建立的多重real-time PCR法可用于食用淀粉种类掺假鉴别检测。 展开更多
关键词 多重实时聚合酶链式反应 食用淀粉 木薯 红薯 马铃薯 玉米
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马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种real-time PCR检测方法的建立与应用 被引量：1
2
作者 吕厚姣 李欣媛 +3 位作者 白小佳 贾龙刚 耿伟涛 王艳萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第9期102-108,共7页
本研究建立了一种特异性实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,根据模式菌株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的16S rDNA序列和全基因组序列设计筛选特异性引物,采用SYBR Green I荧光染料建立r... 本研究建立了一种特异性实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,根据模式菌株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的16S rDNA序列和全基因组序列设计筛选特异性引物,采用SYBR Green I荧光染料建立real-time PCR方法,并对方法的特异性、灵敏度、重复性和混合体系等进行检测。结果表明,本研究所建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,建立real-time PCR的标准曲线,其决定系数R2为0.965,具有良好的线性关系,且在马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种及混合体系中可以特异性检出。综上,本研究建立的real-time PCR法可以快速、准确地检测马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种,为马乳酒样乳杆菌的特异性定性定量检测提供了一种新的方法。 展开更多
关键词 马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种 实时聚合酶链式反应 特异性引物
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垂体后叶粉中3种动物源性成分多重real-time PCR检测方法的建立及应用
3
作者 邵长春 潘秀丽 +2 位作者 魏艳芸 王月玲 王蕙 《畜禽业》 2024年第8期1-6,共6页
目的基于三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)技术同时快速检测垂体后叶粉中的猪、牛、羊性动物源性成分。方法采用CTAB法提取样品及对照品DNA,以线粒体基因为靶基因设计并合成三重real-time PC... 目的基于三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)技术同时快速检测垂体后叶粉中的猪、牛、羊性动物源性成分。方法采用CTAB法提取样品及对照品DNA,以线粒体基因为靶基因设计并合成三重real-time PCR的引物探针,并对建立方法进行验证,用于检测垂体后叶粉样品是否与标识一致。结果猪、牛、羊源性成分的最低检测浓度为10 pg/μL,采用建立的方法检测3批垂体后叶粉样品,均只检测出猪源性成分。结论建立的方法可用于同时检测垂体后叶粉中的猪、牛、羊源性成分,可为相关工作提供技术支持。 展开更多
关键词 垂体后叶粉 多重实时聚合酶链反应 种属鉴定
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4种动物源性成分多重real-time PCR检测方法的建立及其在驴肉制品检测中的应用 被引量：10
4
作者 范维 高晓月 +4 位作者 李贺楠 董雨馨 刘虹宇 李宇轩 郭文萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第8期317-323,共7页
建立一种同时快速检测驴、马、猪及鸭源性成分的四重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。分别以4种源性成分的Nad5、ATpase6、ATP8、cytb基因为靶基因设计特异性引物和TaqMan探针,以18S rRNA... 建立一种同时快速检测驴、马、猪及鸭源性成分的四重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。分别以4种源性成分的Nad5、ATpase6、ATP8、cytb基因为靶基因设计特异性引物和TaqMan探针,以18S rRNA基因为内参基因,建立多重real-time PCR方法,并对该方法进行方法学验证,同时对不同掺入比例模拟样品、不同加工工艺模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高等优点。当Ct值≤35.0时,方法对16种非目标源性具有良好特异性;灵敏度可检测到质量浓度为2×10^(-4)ng/μL的模板DNA;对生肉的检出限为肉含量的0.001%,对熟肉制品的检出限为肉含量的0.01%;对100份实际样品进行检测,结果与标准方法一致,说明建立的多重real-time PCR法可用于肉及肉制品中常见掺假源性成分的检测。 展开更多
关键词 多重实时聚合酶链式反应 掺假鉴别 驴肉 马肉 猪肉 鸭肉
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一种5重real-time PCR筛查转基因水稻方法的建立 被引量：6
5
作者 董立明 杨帆 +4 位作者 邢珍娟 李葱葱 闫伟 龙丽坤 李飞武 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第24期329-334,共6页
以转基因水稻中最常用的CaMV35S启动子、NOS终止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因及SPS水稻内标基因为研究对象,利用5种不同的荧光信号(FAM、HEX、Taxas Red、Cy5、Cy5.5)进行多重实时聚合酶链式反应(realtime polymerase chain reaction,rea... 以转基因水稻中最常用的CaMV35S启动子、NOS终止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因及SPS水稻内标基因为研究对象,利用5种不同的荧光信号(FAM、HEX、Taxas Red、Cy5、Cy5.5)进行多重实时聚合酶链式反应(realtime polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法的研究。通过引物组合筛选、反应体系优化、特异性测试、灵敏度测试、适用性测试等一系列实验,建立了5重real-time PCR方法,灵敏度可达0.032%。此方法具有灵敏度高、结果准确、通量大等优点,可实现水稻中转基因成分的快速、高效检测。 展开更多
关键词 转基因水稻 筛查元件 单一实时聚合酶链式反应 5重实时聚合酶链式反应 高通量检测方法
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3种致病菌多重real-time PCR检测方法的建立及其在散装即食肉制品中的应用 被引量：16
6
作者 范维 高晓月 +4 位作者 李贺楠 董雨馨 李宇轩 刘虹宇 郭文萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第2期332-338,共7页
建立一种同时快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的三重实时聚合酶链式反应(realtime polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌Sa442基因和蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因为靶... 建立一种同时快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的三重实时聚合酶链式反应(realtime polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌Sa442基因和蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因为靶基因设计引物和TaqMan探针,建立多重real-time PCR方法,对该方法进行方法学验证,并对实际的散装即食肉制品样品进行检测。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。对15株非目标菌进行检测,结果均为阴性;3种致病菌的定量线性浓度范围为10^(2)~10^(8) CFU/mL,且定量检测批内和批间的变异系数均小于2%;沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌在未增菌的即食肉制品样品中检出限分别为3.8×10^(2)、4.9×10^(2) CFU/mL和5.7×10^(2) CFU/mL,经增菌5 h后,检出限提高到3.8、4.9 CFU/mL和5.7 CFU/mL。对100份实际样品进行检测,结果与标准方法一致,说明建立的多重real-time PCR法可以用于散装即食肉制品中3种致病菌的检测。 展开更多
关键词 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 蜡样芽孢杆菌 多重实时聚合酶链式反应 即食肉制品
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多重real-time PCR技术快速鉴别特种乳中的乳源动物成分 被引量：12
7
作者 杨艳歌 李莉 +4 位作者 王丹丹 李唯熙 王洪越 刘鸣畅 吴亚君 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第16期312-321,共10页
建立一种特种乳中乳源动物成分快速鉴别多重实时聚合酶链式反应技术。通过筛选建立8种不同乳源物种检测的多重实时聚合酶链式反应方法,在一个反应体系里可同时检测4种乳源的特异性靶基因,绝对灵敏度达0.1~5 pg/μL,检出限可达0.1%。同时... 建立一种特种乳中乳源动物成分快速鉴别多重实时聚合酶链式反应技术。通过筛选建立8种不同乳源物种检测的多重实时聚合酶链式反应方法,在一个反应体系里可同时检测4种乳源的特异性靶基因,绝对灵敏度达0.1~5 pg/μL,检出限可达0.1%。同时,建立了高效的DNA提取方法,样品裂解后可在12 min左右完成96个样品的DNA提取,大大缩短了样品前处理时间。采用该方法对市售特色乳产品进行调查,结果显示标识不准确的产品比例达36.36%。 展开更多
关键词 多重实时聚合酶链式反应 特种乳 乳源动物 掺伪 鉴别
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全基因组测序和real-time PCR法检测食源性沙门氏菌parC、gyrA基因突变特征 被引量：10
8
作者 毕旺来 赵巍薇 +2 位作者 马达 李睿 周敏 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第12期296-302,共7页
以45株食源性沙门氏菌喹诺酮耐药株为对象,采取全基因组测序和实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)法检测parC、gyrA基因突变位点,并对检测方法可靠性、耐药基因突变特征进行评估和分析。首先将4株... 以45株食源性沙门氏菌喹诺酮耐药株为对象,采取全基因组测序和实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)法检测parC、gyrA基因突变位点,并对检测方法可靠性、耐药基因突变特征进行评估和分析。首先将4株沙门氏菌进行二代全基因组测序,根据测序数据分析结果,建立了一种real-time PCR法检测gyrA Asp87Tyr、gyrA Asp87Asn、parC Thr57Ser和parC Ser80Ile这4个突变位点。将沙门氏菌进行qnrS、qnrA、qnrB的real-time PCR检测,发现有31株菌未检出qnr基因。以这31株菌为对象,采取real-time PCR法筛查基因突变位点,结果发现parC Thr57Ser和gyrA Asp87Asn型突变最常见。将real-time PCR阳性的10株菌扩增parC、gyrA基因全长并测序,real-time PCR检测和测序结果完全吻合,说明了real-time PCR检测的可靠性。全基因组测序和real-time PCR法相结合的方法用于耐药基因突变筛查,既可以发现新的基因突变,又可以快速筛查大样本的主要突变类型,可作为沙门氏菌耐药性研究的一种可靠手段。 展开更多
关键词 沙门氏菌 全基因组测序 实时聚合酶链式反应 喹诺酮 耐药基因
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三重real-time PCR检测副溶血弧菌主要毒力基因 被引量：4
9
作者 陈松 雷舒文 +2 位作者 上官文丹 刘丹 钟青萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第22期298-304,共7页
针对编码副溶血弧菌的特异性基因和主要毒力基因tlh、tdh、ureR进行引物及探针设计,通过优化反应条件,建立基于Taqman探针快速检测副溶血弧菌毒力基因的三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方... 针对编码副溶血弧菌的特异性基因和主要毒力基因tlh、tdh、ureR进行引物及探针设计,通过优化反应条件,建立基于Taqman探针快速检测副溶血弧菌毒力基因的三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。利用10株副溶血弧菌和22株非副溶血弧菌对设计的引物及探针进行特异性验证,结果表明设计的引物及探针具有很高的特异性;优化后的引物浓度分别为tdh 0.15μmol/L、tlh 0.15μmol/L、ureR 0.80μmol/L,探针浓度分别为HEX 0.50μmol/L、FAM 0.50μmol/L;该方法即使在高浓度的背景细菌存在下,DNA浓度与Ct值均呈良好的线性关系,检出限为1.8×10^(2)拷贝/mL;以完整菌细胞的悬液为模板时,预变性时间为30 min,扩增检测效果与以基因组DNA(gDNA)为模板相当(ΔCt<1)。本研究建立的三重real-time PCR方法能实现快速定量检测副溶血弧菌,并能有效区分致病性及非致病性副溶血弧菌,为副溶血弧菌的快速定量检测和风险评估提供快速、灵敏、准确的方法。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 多重实时聚合酶链式反应 快速检测 毒力基因
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Real-time PCR法检测水产品中异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭源性成分 被引量：6
10
作者 信红梅 姚琳 +5 位作者 陆键萍 曲梦 江艳华 李风铃 郭莹莹 王联珠 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第24期273-280,共8页
目的:建立异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法。方法:对比异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭、大西洋鳕等18种鳕鱼及易掺假品种的线粒体细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subuni... 目的:建立异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法。方法:对比异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭、大西洋鳕等18种鳕鱼及易掺假品种的线粒体细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subunit I,COI)基因,设计异鳞蛇鲭、棘鳞蛇鲭物种特异性引物/探针,建立两种鱼的real-time PCR检测方法,评估其特异性、绝对灵敏度和相对灵敏度;用该方法对50份市售标称“鳕鱼”制品进行检测,评估其实际使用效果。结果:两种检测方法特异性强,绝对灵敏度为0.002 ng/μL(异鳞蛇鲭)和0.0002 ng/μL(棘鳞蛇鲭),相对灵敏度均达0.01%,满足实际检测需求。在50份市售样品中检出1份含异鳞蛇鲭成分,1份含棘鳞蛇鲭成分,与测序比对结果一致。结论:本研究建立的异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭源性成分的检测方法特异性强、灵敏度高,为保护消费者权益和水产品掺杂使假的检测提供技术支持。 展开更多
关键词 异鳞蛇鲭 棘鳞蛇鲭 油鱼 实时聚合酶链式反应 COI基因
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Real-time PCR和双向电泳联合鉴别婴幼儿配方羊乳粉的乳源成分 被引量：3
11
作者 侯艳梅 杨艳歌 +4 位作者 吴桐 刘鸣畅 王洪越 王丹丹 吴亚君 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第8期324-333,共10页
为实现对婴幼儿配方羊乳粉中乳源成分的准确判别,将基因检测作为初筛方法,以蛋白质双向电泳作为确证方法,研究该技术路线下对乳源成分检测的灵敏度、准确性等指标。优化建立的基于嗜热蛋白酶的一步式DNA提取法,仅需通过温控反应在17 mi... 为实现对婴幼儿配方羊乳粉中乳源成分的准确判别,将基因检测作为初筛方法,以蛋白质双向电泳作为确证方法,研究该技术路线下对乳源成分检测的灵敏度、准确性等指标。优化建立的基于嗜热蛋白酶的一步式DNA提取法,仅需通过温控反应在17 min内完成DNA步骤,极大缩短了样品前处理时间;建立的快速实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)程序仅需28 min 26 s即可完成检测。通过牛(家牛、水牛、牦牛)、羊(山羊和绵羊)、山羊、绵羊单一乳源成分,以及哺乳动物内参照检测体系,可以实现对低至10~100 pg/μL DNA的检测,对混合样品中牛源性成分检测的灵敏度可达1%(m/m)。然后结合双向电泳技术进一步确证产品的蛋白成分来源,可以判定牛基因检测阳性的样品是否含有来源于牛乳酪蛋白或乳清蛋白,进而对样品的真实性进行判定。real-time PCR法和双向电泳技术联合检测解决了以往婴幼儿配方乳粉检测中因配料复杂乳源判别困难的瓶颈问题。 展开更多
关键词 婴幼儿配方羊乳粉 实时聚合酶链式反应 双向电泳 乳源检测
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转录介导的扩增技术与real-time RT-PCR在人类免疫缺陷病毒检测中的应用
12
作者 吴大先 陶淑慧 +3 位作者 刘水平 周杰斌 谭德明 侯周华 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期776-782,共7页
目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚... 目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚合酶及PCR底物等建立TMA扩增体系。通过扩增一组10倍梯度稀释的HIV RNA转录标准品,评价TMA体系的灵敏性。收集60例HIV感染患者的血浆,同时采用TMA试剂与Cobas Amplicor HIV-1 Monitor 1.5版试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用线性回归和Bland-Altman法分析两种技术的相关性和一致性。结果:成功建立了TMA扩增体系,这种技术可以检测低至10 copies/m L的HIV转录标准品。60份HIV感染者血浆样本中,TMA及Cobas均检测到阳性46份,均阴性12份,TMA检测阴性而Cobas检测阳性样本2份,检测一致率为96.7%。两种技术阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中46份TMA检测和Cobas检测均有定量结果的血浆进行线性回归分析,两种技术有非常好的相关性(r=0.997,P<0.001)。Bland-Altman分析显示两种检测方法定量Lg差值平均值为0.02,44份(95.7%)样本在95%的一致性界限内。结论:TMA技术具有高灵敏性潜能。TMA与real-time RT-PCR检测血浆中HIV RNA具有非常好的相关性与一致性。 展开更多
关键词 转录介导的扩增技术 人类免疫缺陷病毒 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 线性回归
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三重real-time PCR同步检测黄牛、水牛和牦牛成分 被引量：4
13
作者 吴姗 张明哲 +7 位作者 方云 陈哲 张荃 孙超 沈旭芳 虞惠贞 尹文秀 张晓峰 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第20期280-285,共6页
为准确快速地鉴定黄牛、水牛和牦牛的成分,研发具有这3种牛特异性的引物和探针,并建立单重、双重和三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法,同步检测上述3种牛的成分。单重real-time PCR检测... 为准确快速地鉴定黄牛、水牛和牦牛的成分,研发具有这3种牛特异性的引物和探针,并建立单重、双重和三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法,同步检测上述3种牛的成分。单重real-time PCR检测时,3种牛的检测灵敏度均为0.025 ng/μL;双重real-time PCR检测时,两两组合的引物探针含量比例为1∶1时,黄牛的检测灵敏度降低至0.1 ng/μL,而水牛和牦牛仍为0.025 ng/μL;对三重real-time PCR检测体系进行优化,当黄牛、水牛和牦牛3组引物探针的含量比例为3∶3∶2时,检测灵敏度最佳,黄牛和水牛的检测灵敏度可达到0.1 ng/μL,而牦牛的灵敏度仍可达到0.025 ng/μL。但上述双重和三重real-time PCR检测的灵敏度,是建立在3种牛的含量比例为1∶1∶1的情况下,若3种牛的比例差异较大,特别是黄牛和牦牛的含量比例差异较大时,如比例为9∶1时,含量低的成分会存在漏检。因此,在对整块肉的样品进行检测时,可采用三重real-time PCR的方法同步检测3种牛的成分;若样品可能为上述3种肉的为混合物,如肉糜、肉松等,则建议采用单重real-time PCR检测。 展开更多
关键词 黄牛 水牛 牦牛 三重real-time PCR
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松材线虫自噬基因的克隆及蒎烯胁迫对其的影响
14
作者 汪勇 薛旗 +4 位作者 陈乃勋 孙宣 闵莉静 张琳沅 张立钦 《东北林业大学学报》 北大核心 2025年第5期122-129,共8页
为了探究自噬在松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)抵御松树分泌的蒎烯胁迫过程中的作用,用不同质量浓度的α-蒎烯和β-蒎烯混合液体外处理线虫,模拟树体胁迫,观察蒎烯胁迫对线虫取食和繁殖的影响,克隆松材线虫自噬基因BxATG6、BxAT... 为了探究自噬在松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)抵御松树分泌的蒎烯胁迫过程中的作用,用不同质量浓度的α-蒎烯和β-蒎烯混合液体外处理线虫,模拟树体胁迫,观察蒎烯胁迫对线虫取食和繁殖的影响,克隆松材线虫自噬基因BxATG6、BxATG10和BxATG12,检测胁迫后这3个基因的表达情况,分析松材线虫自噬基因在抵御蒎烯胁迫中的作用。结果显示:松材线虫自噬基因BxATG6、BxATG10和BxATG12编码的蛋白与稻叶牙滑刃线虫(Aphelenchoides besseyi)相关自噬蛋白的亲缘关系较近。低质量浓度蒎烯混合液(32.1 g·L^(-1))会显著抑制线虫的取食和繁殖,胁迫3 h以上,线虫3个自噬基因的表达量显著上调。由此表明,松材线虫自噬基因BxATG6、BxATG10和BxATG12在抵御蒎烯胁迫中起着一定的作用。 展开更多
关键词 松材线虫 自噬基因 实时荧光定量聚合酶链式反应 Α-蒎烯 Β-蒎烯
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基于qPCR的VGM-R02b定量检测方法建立及其在食蟹猴组织分布特征
15
作者 高彩虹 任欣怡 +2 位作者 洛文靖 张雨飞 程远国 《中国药理学与毒理学杂志》 北大核心 2025年第2期100-108,共9页
目的建立基于实时定量聚合酶链式反应(qPCR)的高灵敏度检测方法,定量分析基因治疗药物VGM-R02b(腺相关病毒9载体)在食蟹猴体内组织分布特征。方法利用VGM-R02b质粒标准品构建qPCR标准曲线,优化扩增程序等关键参数并验证方法的定量范围... 目的建立基于实时定量聚合酶链式反应(qPCR)的高灵敏度检测方法,定量分析基因治疗药物VGM-R02b(腺相关病毒9载体)在食蟹猴体内组织分布特征。方法利用VGM-R02b质粒标准品构建qPCR标准曲线,优化扩增程序等关键参数并验证方法的定量范围、精密度、准确度、稀释线性、选择性、特异性及样本稳定性。单次单侧脑室注射VGM-R02b后,于给药后第29天(D29)和第92天(D92)采集食蟹猴全血及多组织样本,检测目的基因含量并分析其组织分布特点。结果建立了定量检测食蟹猴体内VGM-R02b目的基因的qPCR方法并完成了方法学验证。该方法定量范围为5.00×10^(9)~5.00×10^(1)copies·μg^(-1)DNA,R2≥0.9989,精密度、准确性、稀释线性、选择性和特异性均良好。目的基因在食蟹猴组织(以肝为例)中经室温放置4 h、-15~-25℃放置9 d、反复冻融5次、-60~-80℃放置90 d,在食蟹猴全血中经室温放置4 h、-15~-25℃放置9 d,反复冻融5次、-60~-80℃放置93 d及提取的核酸样本经室温放置4.25 h、2~8℃放置24.16 h、反复冻融5次、-60~-80℃放置109 d均保持稳定。基于qPCR定量检测结果显示,给药后D29和D92,对照组均未检测出目的基因,给药组目的基因分布于所有组织,其中脑、肝、脾和脊髓分布较高。与D29相比,D92所有组织中目的基因含量均无显著变化。结论建立的qPCR方法稳健可靠,可用于定量检测食蟹猴体内VGM-R02b目的基因含量。VGM-R02b给药后D29和D92目的基因分布于所有组织,其中脑、肝、脾和脊髓中分布较高。 展开更多
关键词 基因治疗 实时定量聚合酶链式反应 方法学 验证 生物分析
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RT-qPCR检测人IL-6 mRNA的方法建立与运用
16
作者 邹立林 吕建新 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期470-472,共3页
目的:建立实时定量检测人IL-6mRNA的方法并加以应用。方法:抽取人外周静脉血,EDTA抗凝,用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,用Trizol裂解液提取总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,然后用IL-6引物进行实时荧光定量PCR扩增,扩增体系中加入SYBR... 目的:建立实时定量检测人IL-6mRNA的方法并加以应用。方法:抽取人外周静脉血,EDTA抗凝,用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,用Trizol裂解液提取总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,然后用IL-6引物进行实时荧光定量PCR扩增,扩增体系中加入SYBRGreenⅠ。结果:该法检测IL-6mRNA线性范围广,灵敏度高,特异性好,重复性好,方法简单。结论:该法可较为精确地定量IL-6mRNA。 展开更多
关键词 白细胞介素-6 核糖核酸 信使 逆转录-聚合酶链反应 实时 定量
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基于实时聚合酶链式反应检测特种乳中牛乳的掺伪
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作者 李威 孙国栋 +2 位作者 鹿嘉榕 赵仲凯 杨洁 《食品科学》 北大核心 2025年第6期263-274,共12页
分别基于SYBR Green实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)和Taq Manreal-timePCR技术检测特种乳及其热处理加工产品中掺假的牛乳成分,同时探讨不同热处理方式对掺假检测的影响,以满足不同商品化特种... 分别基于SYBR Green实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)和Taq Manreal-timePCR技术检测特种乳及其热处理加工产品中掺假的牛乳成分,同时探讨不同热处理方式对掺假检测的影响,以满足不同商品化特种乳制品的检测要求。结果表明,所设计的牛特异性引物可以扩增牛乳中的DNA,与非目标动物无交叉反应性,具有较高的特异性。两种real-time PCR方法对于牛乳DNA的检测限分别为1 pg(SYBR Green)和10 pg(Taq Man),且均可以最低检测出特种乳混合物中0.1%(m/m)牛乳成分掺伪。为评估掺假模拟的重现性,在3 d内共进行了9次重复实验,验证了方法具有较高的重复性。同时,为检测本研究中所建立实验方法的可用性,对20种商业加工特种乳制品进行了真实性分析,其中在7种产品中检测出牛乳成分,显示出所建立的检测方法具有较高的分辨率和实际应用价值。 展开更多
关键词 特种乳 实时聚合酶链式反应 食品掺假 真实性分析
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广东某规模化猪场PCV2感染情况及免疫效果评估
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作者 魏晓琪 许诺 +5 位作者 尧建辉 钟玮霖 颜广智 陈盛楠 刘明杰 黄良宗 《广东畜牧兽医科技》 2025年第1期105-109,共5页
为评估广东某规模化猪场猪圆环病毒2型(PCV2)感染情况及免疫效果,应用荧光定量PCR(qPCR)和ELISA对猪场采集的140份血液样本进行检测。结果显示仔猪14日龄免疫后,在21日龄时PCV2 Cap蛋白抗体S/P平均值最高可达1.093,抗体阳性率最高可达92... 为评估广东某规模化猪场猪圆环病毒2型(PCV2)感染情况及免疫效果,应用荧光定量PCR(qPCR)和ELISA对猪场采集的140份血液样本进行检测。结果显示仔猪14日龄免疫后,在21日龄时PCV2 Cap蛋白抗体S/P平均值最高可达1.093,抗体阳性率最高可达92%;90-198日龄猪群Cap蛋白抗体S/P值由0.764下降至0.418,抗体阳性率由80%下降至35%,显示90日龄后抗体水平呈下降趋势;133-198日龄猪群PCV2 Rep蛋白抗体阳性率由10%升高至45%,PCV2核酸阳性率由10%升高至95%,且42.1%(8/19)阳性样品的PCV2核酸拷贝数>107拷贝/mL,病毒载量高,提示该猪场育肥猪群PCV2发生感染。本试验检测结果表明该猪场猪群于133日龄前后出现PCV2感染,病原学和血清学检测结果为优化免疫程序提供参考依据。 展开更多
关键词 猪2型圆环病毒 荧光定量PCR ELISA Cap蛋白抗体 Rep蛋白抗体
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RT-qPCR检测CPC对中重度慢性牙周炎患者口内环境中红色复合体的影响 被引量：1
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作者 叶兴如 徐燕 +5 位作者 庞罡 王莹 周莉莉 蒋鹏 沈继龙 王荣海 《口腔医学研究》 CAS 北大核心 2018年第8期852-856,共5页
目的:利用RT-qPCR检测CPC对中重度慢性牙周炎患者口内环境中红色复合体构成比的影响。方法:临床选择40例中重度慢性牙周炎患者,随机分成CPC(试验)组、溶媒(对照)组,牙周基础治疗后分别使用该药品含漱+袋内冲洗。记录患者基线和用药4周... 目的:利用RT-qPCR检测CPC对中重度慢性牙周炎患者口内环境中红色复合体构成比的影响。方法:临床选择40例中重度慢性牙周炎患者,随机分成CPC(试验)组、溶媒(对照)组,牙周基础治疗后分别使用该药品含漱+袋内冲洗。记录患者基线和用药4周后的临床指标;采集龈下菌斑、龈沟液和唾液样本,BANA试验检测胰蛋白酶样酶含量,RT-qPCR检测P.gingivalis、T.forsythia、T.denticola在总菌量中的构成比。结果:治疗后:1)试验组AL、BOP、PLI显著改善(P<0.01),对照组仅AL改善(P<0.01);2)两组龈下菌斑和龈沟液样本中胰蛋白酶样酶含量均显著下降(P<0.05);3)两组P.gingivalis构成比均显著下降(P<0.01),T.forsythia在试验组构成比显著下降(P<0.01),而T.denticola治疗前后无变化;4)P.gingivalis、T.forsythia、T.denticola两两之间构成比均显著相关(P<0.01)。结论:CPC可抑制牙菌斑形成,改善患者的临床症状,并对龈下菌斑中的P.gingivalis有一定的抑制作用,临床上可用于辅助治疗中重度慢性牙周炎。 展开更多
关键词 牙龈卟啉单胞菌 福塞坦氏菌 齿垢密螺旋体 实时荧光定量PCR
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RT-qPCR分析拷贝数及mRNA转录水平对表达左聚糖蔗糖酶的影响
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作者 陈硕昌 仝秋平 +3 位作者 郭晓磊 朱萍 蒙健宗 杨辉 《中国酿造》 CAS 北大核心 2022年第4期80-86,共7页
采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术对重组毕赤酵母基因组中左聚糖蔗糖酶基因(SacB)的拷贝数及信使核糖核酸(mRNA)转录水平进行检测分析,并用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定菌株不同诱导时间下左聚糖蔗糖酶水解活力。结果表明,... 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术对重组毕赤酵母基因组中左聚糖蔗糖酶基因(SacB)的拷贝数及信使核糖核酸(mRNA)转录水平进行检测分析,并用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定菌株不同诱导时间下左聚糖蔗糖酶水解活力。结果表明,在BMMY液体培养基中经甲醇诱导24 h时,样品转录水平皆达到最大值,此时多拷贝菌株转录水平(2.13)为单拷贝菌株(0.42)的5.1倍;左聚糖蔗糖酶活力在甲醇诱导24 h后均随诱导时间不断上升,多拷贝菌株酶活(13.96 U/mL)较单拷贝菌株(5.48 U/mL)提高1.5倍。重组毕赤酵母整合的左聚糖蔗糖酶基因在1~3个拷贝范围内,随着拷贝数增加,多拷贝菌株较单拷贝菌株的mRNA转录水平及相应的蛋白表达量均显著增加(P<0.05),说明毕赤酵母是表达基因SacB的良好宿主。 展开更多
关键词 实时荧光定量聚合酶链式反应 毕赤酵母 左聚糖蔗糖酶 拷贝数 转录水平
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