目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-...目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-Ti me PCR方法有很好的特异性与敏感性,所检测沙门菌结果均为阳性,而非沙门菌均为阴性;标准曲线相关系数为R2=0.993,其敏感性为5CFU。运用该方法对108份鸡粪便、50份鸡肉以及58份水样进行检测,阳性率分别为3.7%(6/108)、4%(2/50)和3.4%(2/58),与传统细菌分离检测结果相符。结论结果表明该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点,此研究为环境及疾病诊断中沙门菌快速检测提供了新方法。展开更多
仙人掌X病毒(cactuSviruSX,CVX)严重威胁世界火龙果产业的发展。为实现对该病毒的定量检测,本研究根据CVX外壳蛋白(CP)的保守序列设计特异性引物CVX-F/-R,建立了引物浓度150 nmol/L,退火温度62℃的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法...仙人掌X病毒(cactuSviruSX,CVX)严重威胁世界火龙果产业的发展。为实现对该病毒的定量检测,本研究根据CVX外壳蛋白(CP)的保守序列设计特异性引物CVX-F/-R,建立了引物浓度150 nmol/L,退火温度62℃的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该引物扩增效率为97.38%,R^(2)为0.9965,对标准品的检测极限浓度为8×10^(2)拷贝/μL,其灵敏度是普通PCR的100倍。对火龙果不同组织中CVX的相对表达量进行检测发现,病毒在花丝中的含量最高,之后依次为花萼、花瓣、嫩枝、老枝和根。对采自贵州黔南州的40份火龙果样品进行检测,共检测出32份阳性样品。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR特异性强、灵敏度高,为今后CVX的检测提供了重要的技术补充。展开更多
为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombina...为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。展开更多
文摘目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-Ti me PCR方法有很好的特异性与敏感性,所检测沙门菌结果均为阳性,而非沙门菌均为阴性;标准曲线相关系数为R2=0.993,其敏感性为5CFU。运用该方法对108份鸡粪便、50份鸡肉以及58份水样进行检测,阳性率分别为3.7%(6/108)、4%(2/50)和3.4%(2/58),与传统细菌分离检测结果相符。结论结果表明该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点,此研究为环境及疾病诊断中沙门菌快速检测提供了新方法。
文摘仙人掌X病毒(cactuSviruSX,CVX)严重威胁世界火龙果产业的发展。为实现对该病毒的定量检测,本研究根据CVX外壳蛋白(CP)的保守序列设计特异性引物CVX-F/-R,建立了引物浓度150 nmol/L,退火温度62℃的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该引物扩增效率为97.38%,R^(2)为0.9965,对标准品的检测极限浓度为8×10^(2)拷贝/μL,其灵敏度是普通PCR的100倍。对火龙果不同组织中CVX的相对表达量进行检测发现,病毒在花丝中的含量最高,之后依次为花萼、花瓣、嫩枝、老枝和根。对采自贵州黔南州的40份火龙果样品进行检测,共检测出32份阳性样品。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR特异性强、灵敏度高,为今后CVX的检测提供了重要的技术补充。
文摘为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。
