定量RT-PCR及其在植物学研究中的应用 被引量：15

1

作者 胡丹丹 顾金刚 +1 位作者 姜瑞波 董金皋 《植物营养与肥料学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期520-525,共6页

定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan-titative RT-... 定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan-titative RT-PCR)、比较定量RT-PCR(Comparative quantitative RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real time quantitative RT-PCR)四种。目前定量RT-PCR在植物学研究中的应用越来越广泛,如植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测等方面。本文综述了定量RT-PCR的原理及在植物学中的应用。 展开更多

关键词 相对定量RT—pcr 竞争性定量RT-pcr 比较定量RT-pcr 实时定量RT-pcr 植物学

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检测猪圆环病毒DNA的竞争定量PCR方法的建立及初步应用 被引量：21

2

作者 崔尚金 蔡阳 陈欣 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期347-351,共5页

建立了定量检测猪圆环病毒DNA的竞争PCR方法.应用PCR扩增PCV-2 ORF2上490 bp片段P3P4,克隆到pMD 18-T载体获得目标模板.构建含692 bp的c-P3P4 DNA片段的竞争模板,其携带与目标DNA和靶DNA相同的引物结合区.以定量的竞争模板同一系列稀释... 建立了定量检测猪圆环病毒DNA的竞争PCR方法.应用PCR扩增PCV-2 ORF2上490 bp片段P3P4,克隆到pMD 18-T载体获得目标模板.构建含692 bp的c-P3P4 DNA片段的竞争模板,其携带与目标DNA和靶DNA相同的引物结合区.以定量的竞争模板同一系列稀释的竞争模板进行竞争PCR扩增,以产物的荧光强度(IOD)绘制标准曲线,结果当反应体系中起始模板的量为1.0×107 cop/μL,循环次数小于或等于30时,原始模板数以指数增长.由此确定目标模板和竞争模板的最适工作浓度并用该方法检测感染细胞内的PCV-2基因组的拷贝数和临床样品中的PCV-2 DNA含量,结果发现临床样品中的PCV-2 DNA含量达到一定程度(肺中1.0145×108 copies/mL,血中0.8×107 copies/mL,淋巴中9.698×108 copies/mL),猪表现临床症状,而病毒在感染细胞内的复制在80 h基因的拷贝数达到最高,这为今后的研究奠定了基础. 展开更多

关键词 检测技术 猪圆环病毒 DNA 竞争定量 pcr方法

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宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法建立 被引量：4

3

作者 王恒波 郭晋隆 +3 位作者 陈平华 阙友雄 陈如凯 许莉萍 《热带作物学报》 CSCD 2009年第10期1511-1516,共6页

利用宿根矮化病菌的特异检测引物,构建竞争定量PCR检测的非同源模板,建立宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法。实验中非同源模板(竞争模板)构建是采用PCR方法对大肠杆菌基因组进行低严谨度扩增,回收合适的DNA片段并将其构建到T-esay载体... 利用宿根矮化病菌的特异检测引物,构建竞争定量PCR检测的非同源模板,建立宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法。实验中非同源模板(竞争模板)构建是采用PCR方法对大肠杆菌基因组进行低严谨度扩增,回收合适的DNA片段并将其构建到T-esay载体上,通过测序和序列比对,除两端引物序列完全相似外,其余部分没有同源性,因此可以作为定量检测的非同源模板。通过计算非同源模板的拷贝数,进行竞争定量PCR检测宿根矮化病,建立宿根矮化病菌的标准竞争曲线和直线回归方程。本研究建立的竞争定量PCR检测方法操作简单、特异性和敏感性高,适合于宿根矮化病菌的检测,并可为其它病菌竞争定量PCR检测方法的建立提供参考。 展开更多

关键词 甘蔗 宿根矮化病菌 非同源模板 竞争定量pcr 检测

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鹅圆环病毒竞争PCR检测方法的建立 被引量：3

4

作者 林蕾 袁海霞 +4 位作者 田敬 郭婧 刘晓宁 孙红霞 余旭平 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第2期365-369,共5页

建立了基层临床定量检测鹅圆环病毒DNA的竞争PCR方法。以含有鹅圆环病毒(GoCV)全长基因组的pMDT-GoCV-yk01质粒为模板,PCR扩增出长度为625 bp的片段,克隆到pGEM-T Easy载体,获得目标模板,命名为pGoCV625-T;同时,构建与目标模板DNA有相... 建立了基层临床定量检测鹅圆环病毒DNA的竞争PCR方法。以含有鹅圆环病毒(GoCV)全长基因组的pMDT-GoCV-yk01质粒为模板,PCR扩增出长度为625 bp的片段,克隆到pGEM-T Easy载体,获得目标模板,命名为pGoCV625-T;同时,构建与目标模板DNA有相同引物结合区、扩增片段长度为300 bp的竞争模板,克隆于pMD18-T,获得竞争模板,命名为pGoCV300-T。用定量竞争模板pGoCV300-T与系列倍比稀释的定量目标模板pGoCV625-T进行竞争PCR扩增,利用二者PCR产物的荧光强度(IOD)比值与目标模板浓度对数值间的关联性建立标准竞争曲线,推算出直线回归方程,建立GoCV竞争PCR方法。结果表明,竞争模板与目标模板共扩增的最低检测限为1.0μl1.0×104拷贝。初步应用试验结果表明,该方法可定量检测GoCV阳性鹅法氏囊组织中的GoCV DNA。 展开更多

关键词 鹅圆环病毒 竞争pcr 检测方法

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定量PCR的非同源对照模板的构建 被引量：2

5

作者 陈燃 金詟 毛裕民 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期247-250,共4页

建立了HCVRNA和hTERTmRNA的竞争定量PCR系统。对照模板的构建方法是 :利用计算机辅助优选设计连接引物 ,低严紧型扩增大肠杆菌DNA ,回收并克隆预期的DNA片段。该片段与靶序列除两端引物序列完全相同外 ,无同源性 ,因此可作为非同源对照... 建立了HCVRNA和hTERTmRNA的竞争定量PCR系统。对照模板的构建方法是 :利用计算机辅助优选设计连接引物 ,低严紧型扩增大肠杆菌DNA ,回收并克隆预期的DNA片段。该片段与靶序列除两端引物序列完全相同外 ,无同源性 ,因此可作为非同源对照模板。这种构建非同源对照模板的方法 ,简便易行 。 展开更多

关键词 竞争定量pcr 对照模板 异源双链 大肠杆菌

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猪IL-12p40竞争定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：1

6

作者 司兴奎 张济培 +1 位作者 陈建红 顾万军 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期91-94,共4页

根据GenBank中猪IL-12p40的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增377 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含IL-12p40部分基因片段的重组质粒.利用反向PCR技术构建与扩增377 bp片段共用同一对引物但扩增255 bp片段的竞争重组... 根据GenBank中猪IL-12p40的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增377 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含IL-12p40部分基因片段的重组质粒.利用反向PCR技术构建与扩增377 bp片段共用同一对引物但扩增255 bp片段的竞争重组子.通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立了猪IL-12p40的标准竞争曲线和直线回归方程. 展开更多

关键词 猪 IL-12P40 竞争定量RT-pcr

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猪TNF-α竞争定量RT-PCR标准曲线的建立 被引量：1

7

作者 司兴奎 张济培 +1 位作者 陈建红 顾万军 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期730-733,共4页

根据GenBank中猪TNF-α的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增402 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T载体中,构建成含TNF-α部分基因片段的重组质粒.利用反向PCR技术构建与扩增402 bp片断共用同一对引物,但缺失137 bp的竞争重组子.通过重组... 根据GenBank中猪TNF-α的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增402 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T载体中,构建成含TNF-α部分基因片段的重组质粒.利用反向PCR技术构建与扩增402 bp片断共用同一对引物,但缺失137 bp的竞争重组子.通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立猪TNF-α的标准竞争曲线和直线回归方程. 展开更多

关键词 猪 TNF-Α 竞争定量RT-pcr

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定量测定羊关联性恶性卡他热病毒DNA的竞争性PCR方法的建立 被引量：3

8

作者 华育平 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2002年第9期10-13,共4页

此项研究中建立了用于定量测定羊关联性恶性卡他热 (Sheep- associated malignant catarrhal fever,SA- MCF)病毒 DNA的竞争性聚合酶链反应 (Comppetitive polymerase chain reaction,c PCR)方法。该分析中采用同一引物 ,分别将一固定... 此项研究中建立了用于定量测定羊关联性恶性卡他热 (Sheep- associated malignant catarrhal fever,SA- MCF)病毒 DNA的竞争性聚合酶链反应 (Comppetitive polymerase chain reaction,c PCR)方法。该分析中采用同一引物 ,分别将一固定但未知含量的待测目的 DNA(target DNA)与一系列已知含有不同拷贝数量的竞争性 DNA(com petitive DNA)同时扩增。经4 0次扩增后 ,在 30～ 30 0 0 0 0 DNA拷贝范围内 ,目的 DNA与竞争性 DNA之间其扩增产物具有明显的线性竞争关系 (r=0 .98) 展开更多

关键词 羊关联性恶性卡他热 竞争性pcr 病毒DNA 定量测定 羊疤疹2型病毒

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猪IFN-γ竞争定量RT-PCR标准曲线的建立

9

作者 司兴奎 张济培 +1 位作者 陈建红 顾万军 《中国畜牧兽医》 CAS 2008年第6期43-46,共4页

根据GenBank中猪IFN-γ的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增380bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-TEasy载体中,构建成含IFN-γ部分基因片段的重组质粒。利用反向PCR技术构建和扩增380 bp片段共用同一对引物但缺失163 bp的竞争重组子。通过... 根据GenBank中猪IFN-γ的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增380bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-TEasy载体中,构建成含IFN-γ部分基因片段的重组质粒。利用反向PCR技术构建和扩增380 bp片段共用同一对引物但缺失163 bp的竞争重组子。通过重组质粒与竞争重组子,建立猪IFN-γ的标准竞争曲线和直线回归方程,为进一步检测IFN-γ的mRNA的转录水平变化奠定基础。 展开更多

关键词 猪 IFN-Γ 竞争定量RT-pcr

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应用竞争PCR方法检测亚硝化细菌的研究

10

作者 张艳 李秋芬 王晓熙 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第S1期394-397,409,共5页

选用竞争PCR技术建立了亚硝化细菌的快速定量检测方法。实验以实验室分离、鉴定的一株亚硝化细菌提取的DNA为模板,设计特异性引物,制备特异性内标模板,进行竞争PCR实验;同时采用传统的平板计数法和吖啶橙荧光显微镜计数法两种方法进行... 选用竞争PCR技术建立了亚硝化细菌的快速定量检测方法。实验以实验室分离、鉴定的一株亚硝化细菌提取的DNA为模板,设计特异性引物,制备特异性内标模板,进行竞争PCR实验;同时采用传统的平板计数法和吖啶橙荧光显微镜计数法两种方法进行细菌计数,与竞争PCR结果比较分析,建立了样品细菌数量与内标模板量的线性方程,并将其应用于海水养殖环境中亚硝化细菌的检测中。该方法具有简化检测过程、缩短细菌检测时间、无须昂贵仪器设备等优点,并克服有些环境微生物难以培养的困难,为将来有益菌在应用中实际存活和繁殖情况的监测提供了有力的技术支撑。 展开更多

关键词 竞争pcr 亚硝化细菌 定量检测 内标模板

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赤拟谷盗HSP70基因克隆和竞争定量PCR检测

11

作者 苏丽娟 董晓慧 尹新明 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期218-223,共6页

为研究赤拟谷盗Tribolium castaneum受到热胁迫后高度保守的热激蛋白70(heat shock protein70,HSP70)基因的表达变化,本研究扩增了681bp的赤拟谷盗hsp70片段,编码227个氨基酸残基,GenBank登录号为HM345948。同源性分析表明:赤拟谷盗hsp7... 为研究赤拟谷盗Tribolium castaneum受到热胁迫后高度保守的热激蛋白70(heat shock protein70,HSP70)基因的表达变化,本研究扩增了681bp的赤拟谷盗hsp70片段,编码227个氨基酸残基,GenBank登录号为HM345948。同源性分析表明:赤拟谷盗hsp70核苷酸序列与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata的hsp70(GenBank登录号:AF322911.1)同源性最高,为97%;其推测的蛋白序列与马铃薯甲虫、甘蓝夜蛾Mamestra brassicae、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和美洲斑潜蝇Liriomyza sativae的HSP70蛋白均有94%以上的同源性。利用RT-PCR技术得到与赤拟谷盗hsp70进行竞争定量的内部竞争物,以等量的目标cDNA和一系列稀释的竞争模板进行竞争PCR扩增,构建了hsp70的竞争定量PCR检测体系,该体系标准曲线的线性方程为Y=1.032X-1.618(r2=0.975)。这些结果为赤拟谷盗的hsp70定量检测提供了方便,并为热控技术防治害虫提供了基础资料。 展开更多

关键词 赤拟谷盗 热激蛋白70 竞争定量pcr 内部竞争物 同源性分析

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猪IL-18 mRNA定量RT-PCR检测方法的建立

12

作者 王霞泰 汤世坤 +1 位作者 周双海 刘凤华 《北京农学院学报》 2008年第4期37-40,共4页

根据GenBank中猪白介素(IL)-18基因序列,设计1对引物,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出其411 bp cDNA片段,将其与pGEM-T Easy载体连接,经转化、筛选阳性克隆、酶切与测序鉴定后,构建出含猪IL-18 cDNA部分片段的重组质粒。后... 根据GenBank中猪白介素(IL)-18基因序列,设计1对引物,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出其411 bp cDNA片段,将其与pGEM-T Easy载体连接,经转化、筛选阳性克隆、酶切与测序鉴定后,构建出含猪IL-18 cDNA部分片段的重组质粒。后用反向PCR技术构建出与扩增411 bp片段共用同1对引物,但缺失174 bp的竞争重组质粒。通过上述2种质粒的竞争PCR方法,建立了猪IL-18 mRNA的标准竞争曲线,得到其直线回归方程^y=0.583 2x-2.903 4(R2=0.9898)。 展开更多

关键词 猪 IL-18 竞争定量pcr

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猪圆环病毒2型感染后猪外周血淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-10、IL-12p40、IFN-γ和TNF-α mRNA转录的变化 被引量：16

13

作者 司兴奎 郭鑫 杨汉春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期78-82,共5页

采用竞争定量RT-PCR技术(qcRT-PCR)对PCV2感染组和健康对照组外周血淋巴细胞中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12p40、IFN-γ和TNF-α的mRNA转录水平进行分析。结果表明,在14和21 DPI(Days post inoculation)感染组Th1类细胞因子IL-2 mRNA转录... 采用竞争定量RT-PCR技术(qcRT-PCR)对PCV2感染组和健康对照组外周血淋巴细胞中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12p40、IFN-γ和TNF-α的mRNA转录水平进行分析。结果表明,在14和21 DPI(Days post inoculation)感染组Th1类细胞因子IL-2 mRNA转录水平分别为对照组的5.1(P<0.01)和24.0(P<0.01)倍;IL-12p40 mRNA转录水平在14和21 DPI分别为对照组的1.7(P<0.05)和1.2(P<0.05)倍;感染组IFN-γmRNA转录水平除在7 DPI低于对照组外(P<0.05),在28和42 DPI均明显高于对照组,分别为对照组的38.2(P<0.01)和4.0(P<0.05)倍。Th2类细胞因子波动较为明显,28 DPI IL-4 mRNA转录水平显著高于对照组(P<0.01);感染组IL-10mRNA在7(P<0.01)和14 DPI(P<0.05)的转录水平均显著高于对照组,而在35 DPI明显低于对照组(P<0.05)。在整个试验过程中TNF-αmRNA转录水平没有发生明显变化。上述6种细胞因子mRNA变化结果显示,PCV2感染猪Th1细胞的细胞因子表达水平升高,而Th2细胞的细胞因子在28 DPI前后出现明显波动,尤其是在35 DPI IL-10 mRNA显著下降(P<0.05),提示PCV2感染可造成猪体内Th1/Th2免疫应答的失衡,导致细胞免疫应答功能增强而体液免疫应答下降。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 外周血淋巴细胞 qcRT—pcr 细胞因子 动态变化

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IL2、IL12、IL15的不同组合对人外周血源NK细胞功能的影响 被引量：7

14

作者 李晓红 马健 +5 位作者 吴晓雄 李猛 汪菲菲 达万明 于力 高春记 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2009年第4期918-923,共6页

本研究旨在探讨细胞因子IL2,IL12,IL15的不同组合对体外扩增的人外周血来源的NK细胞功能的影响。IL2、IL12和IL15等细胞因子的不同组合培养的人外周血NK细胞分为IL2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组;无细胞因子培养的NK细... 本研究旨在探讨细胞因子IL2,IL12,IL15的不同组合对体外扩增的人外周血来源的NK细胞功能的影响。IL2、IL12和IL15等细胞因子的不同组合培养的人外周血NK细胞分为IL2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组;无细胞因子培养的NK细胞组为对照组。用细胞计数盒分别测定不同效靶比下NK细胞对靶细胞(K562)的杀伤作用;用ELISA方法检测培养液上清中IFN-γ的分泌水平;用建立竞争性RT-PCR方法定量检测穿孔蛋白、颗粒酶BmRNA的表达水平。结果显示,各组培养的NK细胞对K562细胞的杀伤率增强,在不同效靶比下IL2+IL15和IL2+IL15+IL12组NK细胞对K562细胞的杀伤率显著高于其他组,但此两组间无显著性差异(p>0.05);各细胞因子组培养液中分泌IFN-γ水平均显著高于未加细胞因子的空白对照组(p<0.01),在不同细胞因子条件下,IFN-γ分泌水平依次为IL2+IL12+IL15组>IL2+IL12组>IL2+IL15组>IL2组(p<0.01);各培养组的NK细胞穿孔蛋白及颗粒酶B基因的表达量均较对照组明显增加(p<0.01),且IL2+IL15组和IL2+IL12+IL15组上述两种基因的表达量均显著高于其他组(p<0.01),但组间差别较小,与NK细胞杀伤实验的结果相一致。结论:不同细胞因子组合诱导的外周血NK细胞功能有差异。IL2和IL15在增强NK细胞杀伤功能及促进其扩增作用方面有协同作用,IL12主要刺激NK细胞分泌细胞因子(如IFN-γ),增强其免疫调节功能。 展开更多

关键词 NK细胞 白介素2 白介素12 白介素15 干扰素-γ 外周血

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猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对猪肺泡巨噬细胞外源性抗原加工递呈相关分子和共刺激分子的影响 被引量：9

15

作者 磨美兰 杨汉春 +4 位作者 郭鑫 吕艳丽 周双海 陈艳红 查振林 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期568-573,共6页

采用定量竞争PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后不同时相猪肺泡巨噬细胞(PAM)中外源性抗原加工递呈相关分子SLA-DRI、i链和SLA-DM分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的mRNA转录动态进行了定量检测。结果表明,PRRSV感染后PAM... 采用定量竞争PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后不同时相猪肺泡巨噬细胞(PAM)中外源性抗原加工递呈相关分子SLA-DRI、i链和SLA-DM分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的mRNA转录动态进行了定量检测。结果表明,PRRSV感染后PAM的SLA-DR mRNA转录水平在3、7和14 d下调,低于对照组;感染后3 d,Ii链、SLA-DM和CD40的mRNA转录水平极显著下调(P<0.01);CD80和CD86mRNA转录水平也在感染后3 d明显下调(P<0.05)。用流式细胞术检测PAM表面的SLA-DR抗原的结果表明,在感染后3 d短暂上升,7 d之后一直低于对照组。由此说明,PRRSV感染早期对猪肺泡巨噬细胞的外源性抗原加工和递呈功能产生显著影响,导致其外源性抗原递呈功能下降,进而影响机体的体液免疫应答。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪肺泡巨噬细胞 抗原加工和递呈相关分子 共刺激分子 定量竞争pcr

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烟草转基因内标准定量检测中竞争性模板的制备

16

作者 郭兆奎 范志新 +2 位作者 魏继承 万秀清 于艳华 《中国烟草科学》 CSCD 2002年第2期37-40,共4页

以转基因烟草为材料,通过DNA提取、PCR扩增获得NOS终止子片段产物,以重叠延伸扩增法制备该片段的竞争性模板,并进行酶切验证。

关键词 转基因烟草 内标准定量 竞争性模板 pcr NOS终止子 烟草转基因检测

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