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鸡毒支原体磷酸甘油酸变位酶的亚细胞定位及免疫原性分析
1
作者 赵宇馨 祁晶晶 +7 位作者 尚原冰 李浩然 刘婷 王宇 王少辉 田明星 高崧 于圣青 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期42-50,共9页
鸡毒支原体(MG)感染鸡、鸭、鹅等多种禽类,引起慢性呼吸道疾病,导致产蛋率下降、生长发育受阻,给养禽业造成的经济损失大。磷酸甘油酸变位酶(PGM)是一种参与糖酵解和葡萄糖异生的重要酶,研究表明PGM在一些病原菌的膜表面分布,并能结合... 鸡毒支原体(MG)感染鸡、鸭、鹅等多种禽类,引起慢性呼吸道疾病,导致产蛋率下降、生长发育受阻,给养禽业造成的经济损失大。磷酸甘油酸变位酶(PGM)是一种参与糖酵解和葡萄糖异生的重要酶,研究表明PGM在一些病原菌的膜表面分布,并能结合宿主细胞的胞外基质蛋白,在病原菌致病过程中发挥重要作用,而MG中的PGM蛋白(MGPGM)相关方面的研究少见报道。对MGPGM进行原核表达、亚细胞定位检测及免疫原性分析,为进一步探索MGPGM的生物学功能奠定基础。通过PCR扩增MG的pgm全基因序列(MGpgm),连接表达载体pET-28a(+)并进行原核表达及纯化,获得重组MGPGM(rMGPGM)蛋白;制备抗rMGPGM兔血清,提取MG菌的全菌蛋白、膜蛋白以及胞浆蛋白,与抗rMGPGM兔血清进行Western blot反应,分析其在MG菌中的亚细胞定位情况;抗rMGPGM兔血清与MG菌进行悬浮免疫荧光分析,测定PGM在MG的膜表面定位情况;用MG Rlow感染阳性鸡血清与rMGPGM蛋白进行Western blot反应,分析其免疫原性。在大肠杆菌BL21中成功表达rMGPGM蛋白,制备的兔抗rMGPGM血清抗体效价为102400,Western blot显示抗rMGPGM的兔血清能与MG全菌蛋白、膜蛋白以及胞浆蛋白反应,且MGPGM不仅在胞浆中大量分布,也少量分布在膜蛋白组分中;悬浮免疫荧光试验进一步证实MG的细胞膜表面有PGM蛋白分布;且MG感染血清与rMGPGM蛋白具有明显反应条带,说明rMGPGM具有较好的免疫原性。文章证实了MGPGM蛋白在MG的膜表面分布,同时还具有较好的免疫原性,为进一步研究MGPGM蛋白在MG致病过程中的作用提供参考。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 磷酸甘油酸变位酶 原核表达 亚细胞定位 免疫原性
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牛支原体分子伴侣Dnak的原核表达及黏附特性分析
2
作者 赵云海 张阳阳 +11 位作者 马海云 王青 何肖肖 刘凯 张钰婷 刘玉东 杨永宁 武小椿 邢小勇 权国梅 张志雄 包世俊 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2868-2878,共11页
旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)分子伴侣Dnak(chaperone protein Dnak)蛋白的免疫原性和黏附特性。根据GenBank中Mb HB0801株Dnak基因设计引物,利用Overlap PCR扩增获得Mb Dnak基因,构建重组质粒pET-Dnak,经双酶切和测序鉴定正... 旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)分子伴侣Dnak(chaperone protein Dnak)蛋白的免疫原性和黏附特性。根据GenBank中Mb HB0801株Dnak基因设计引物,利用Overlap PCR扩增获得Mb Dnak基因,构建重组质粒pET-Dnak,经双酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)并通过异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔获得抗rDnak血清,利用Western blot、ELISA和间接免疫荧光检测Dnak蛋白的免疫原性以及Dnak蛋白在Mb中的分布。通过补体介导的杀菌试验分析检测rDnak抗血清介导的激活补体杀支原体活性。利用黏附及黏附抑制试验分析Dnak蛋白对宿主细胞的黏附功能。结果表明,重组蛋白rDnak主要以上清可溶形式在大肠杆菌中成功表达,其相对分子质量约为70 ku,具有良好的免疫原性;其多抗血清可有效激活补体杀伤支原体;Dnak蛋白在Mb的细胞膜和细胞质中均存在,是Mb的一种黏附相关蛋白,参与对EBL细胞的黏附。综上,Dnak蛋白是Mb中具有良好免疫原性的黏附相关蛋白,为探究Mb的致病机制奠定基础。 展开更多
关键词 牛支原体 Dnak蛋白 原核表达 黏附 免疫原性
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副鸡禽杆菌lpxM蛋白的原核表达及免疫原性研究 被引量：1
3
作者 梁之瑄 梅晨 +4 位作者 张雪 徐浩钧 支岩 李焕荣 王宏俊 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期719-727,共9页
[目的]探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。[方法]构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱... [目的]探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。[方法]构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。[结果]重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和C型副鸡禽杆菌的保护率分别为0、20%和60%。[结论]本研究成功构建了原核表达载体pET-28a-lpxM,实现了lpxM重组蛋白的高效表达,且表现出良好的免疫原性。研究结果为探究副鸡禽杆菌外膜蛋白lpxM的免疫学特性以及为鸡传染性鼻炎的预防和疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 副鸡禽杆菌 lpxM蛋白 原核表达 免疫原性
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猴痘病毒A5L蛋白的原核表达及其免疫原性评价 被引量：2
4
作者 熊嘉琦 贾梦乐 +6 位作者 杨领弟 王毅豪 孙静婷 王婷 黎美凤 孔令保 彭棋 《中国畜牧兽医》 CSCD 北大核心 2024年第1期365-372,共8页
【目的】获取高纯度猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A5L蛋白,制备小鼠抗A5L高效价抗血清,为MPXV A5L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-A5L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过... 【目的】获取高纯度猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A5L蛋白,制备小鼠抗A5L高效价抗血清,为MPXV A5L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-A5L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过分析不同IPTG诱导浓度、诱导温度、诱导时间条件下重组蛋白A5L表达情况,筛选最佳表达条件。通过Western blotting鉴定重组蛋白A5L表达,利用SDS-PAGE分析重组蛋白可溶性。A5L蛋白经His-Bind镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠,通过ELISA法检测抗体效价。【结果】双酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-28a-A5L构建成功。Western blotting结果显示重组蛋白A5L在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达;A5L蛋白在诱导温度42℃、诱导剂(IPTG)浓度为1.6 mmol/L、诱导16 h后表达量最高,大小为40 ku。SDS-PAGE分析结果显示,A5L蛋白主要以包涵体形式存在,最佳咪唑洗脱浓度为50 mmol/L。ELISA结果显示,制备的鼠抗A5L蛋白抗体最高效价达1∶205 440。【结论】本研究成功构建了重组质粒pET-28a-A5L,并在原核表达系统中成功表达重组蛋白A5L,制备的A5L多克隆抗体具有较好的免疫原性,研究结果为进一步探究MPXV A5L蛋白的生物学功能奠定基础。 展开更多
关键词 猴痘病毒 原核表达 A5L蛋白 免疫原性
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猴痘病毒B20R蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：3
5
作者 杨领弟 李小梅 +3 位作者 芦晓鸥 彭棋 孔令保 王宇 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期217-225,共9页
【目的】构建猴痘病毒B20R蛋白原核表达系统,并评价原核表达获得的融合蛋白免疫原性,为后续的猴痘病毒检测及新型治疗方法开发提供技术支撑。【方法】参照GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列,按照大肠杆菌密码子偏好性对B20R基因DNA序... 【目的】构建猴痘病毒B20R蛋白原核表达系统,并评价原核表达获得的融合蛋白免疫原性,为后续的猴痘病毒检测及新型治疗方法开发提供技术支撑。【方法】参照GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列,按照大肠杆菌密码子偏好性对B20R基因DNA序列进行优化,人工合成B20R基因并将其分别克隆至表达载体pET-28a和pET-32a以构建原核表达载体;以构建的2种原核表达载体分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后使用SDSPAGE和Western blotting检测融合蛋白B20R的表达情况。通过控制变量法优化融合蛋白B20R的诱导表达条件,使用Ni柱亲和层析进行纯化;以纯化的融合蛋白B20R经腹腔注射免疫昆明小鼠,定期采集昆明小鼠血样,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】将B20R基因克隆至表达载体pET-32a能成功构建原核表达载体pET-32a-B20R,经IPTG诱导后,可在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达出融合蛋白B20R,且主要以不可溶的包涵体形式进行表达。融合蛋白B20R最佳诱导表达条件为37℃下以0.6 mmol/L IPTG诱导12 h,Ni柱亲和层析纯化的最佳咪唑洗脱浓度为40 mmol/L。以纯化的融合蛋白B20R接种免疫昆明小鼠,可在短时间内引起昆明小鼠产生强烈的体液免疫,且至免疫第42 d仍然维持较高的抗体水平,抗体效价高达1∶409600。【结论】构建的猴痘病毒B20R蛋白原核表达载体可在大肠杆菌BL21细胞中以包涵体形式成功表达出融合蛋白B20R,且融合蛋白B20R具有良好的免疫原性,可在短时间内引起昆明小鼠产生强烈的体液免疫。 展开更多
关键词 猴痘病毒 B20R蛋白 原核表达 免疫原性 抗体效价
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罗非鱼无乳链球菌Sip基因的克隆、表达及免疫原性分析 被引量：25
6
作者 黎炯 叶星 +3 位作者 可小丽 卢迈新 迟妍妍 田园园 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期626-633,共8页
表面免疫原性蛋白(Surface Immunogenic Protein,Sip)是B群链球菌(Group B Streptococcus,GBS)的一种表面蛋白,在GBS多种血清型的菌株中均有表达。研究从实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌广东株的基因组DNA中扩增出Sip基因,构建原核表达... 表面免疫原性蛋白(Surface Immunogenic Protein,Sip)是B群链球菌(Group B Streptococcus,GBS)的一种表面蛋白,在GBS多种血清型的菌株中均有表达。研究从实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌广东株的基因组DNA中扩增出Sip基因,构建原核表达载体pColdII-Sip,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株。经诱导表达、SDS-PAGE电泳检测显示重组蛋白主要以可溶形式表达。重组蛋白用亲和层析的方法纯化,蛋白纯度达98%。纯化后的重组蛋白免疫罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)以分析其免疫原性。受免鱼免疫14d后进行人工攻毒试验,免疫组的相对保护率为70%—87%。酶联免疫吸附试验(Elisa)显示受免鱼对重组蛋白产生了较好的免疫应答,免疫剂量为3μg/g和5μg/g时受免鱼血清抗体滴度可达1:128000。研究结果显示重组蛋白Sip具有较强的免疫原性和保护作用,Sip基因可作为罗非鱼链球菌基因工程亚单位疫苗候选基因。 展开更多
关键词 罗非鱼 无乳链球菌 表面免疫原性蛋白 原核表达 免疫原性 抗体 相对保护率
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刚地弓形虫peroxiredoxin基因的克隆表达与免疫原性分析 被引量：14
7
作者 刘转转 王海龙 +3 位作者 殷国荣 马广源 张建中 凡振伟 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期334-337,共4页
目的对刚地弓形虫peroxiredoxin(TgPrx)基因进行克隆、表达和免疫原性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入EcoRI和XhoI酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPrx的基因片段克隆到原核质粒pET30a(+)中,经双酶切、PC... 目的对刚地弓形虫peroxiredoxin(TgPrx)基因进行克隆、表达和免疫原性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入EcoRI和XhoI酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPrx的基因片段克隆到原核质粒pET30a(+)中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行鉴定,重组蛋白用Western blotting分析其免疫原性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出591bp的TgPrx基因片段,并成功构建重组质粒pET30a(+)/TgPrx;SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中高效表达。重组蛋白的相对分子量约32kDa,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结论RH株刚地弓形虫peroxiredoxin可在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 PEROXIREDOXIN 克隆 原核表达 免疫原性
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猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究 被引量：7
8
作者 汤德元 李春燕 +4 位作者 罗险峰 黄涛 曾智勇 甘振磊 王凤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1649-1653,共5页
本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析。并将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD... 本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析。并将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2基因 原核表达 免疫原性
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罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因体外表达及其免疫原性 被引量：6
9
作者 王蓓 李桂欢 +4 位作者 王培 汤菊芬 鲁义善 吴灶和 简纪常 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2014年第6期60-67,共8页
为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin,Hly)对鱼体的免疫保护作用,根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因,定向克隆于原核表达载体p ET-28a中,构建原核重组质粒p ET-28a-hly,经IPTG诱导表达后,制成亚单位... 为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin,Hly)对鱼体的免疫保护作用,根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因,定向克隆于原核表达载体p ET-28a中,构建原核重组质粒p ET-28a-hly,经IPTG诱导表达后,制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼,并分析疫苗的免疫保护力。结果显示,hly基因产物大小1335 bp,编码444个氨基酸,经测序与Gen Bank报道的链球菌属Hly氨基酸序列同源性可达99%。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见一条51.7 k D的特异条带;Western blotting分析结果说明表达的Hly蛋白能与His-Tag单抗特异性结合;制备的亚单位疫苗免疫鱼体后第14天即可检测到抗体产生,并在第28天达到峰值,抗体效价为1∶4096,免疫保护率为70%。由此证实,该亚单位疫苗有望成为预防由无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病的基因工程类疫苗。 展开更多
关键词 无乳链球菌 溶血素 原核表达 免疫原性
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乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达及其免疫原性的研究 被引量：9
10
作者 汤德元 王凤 +5 位作者 马萍 罗险峰 李春燕 曾智勇 徐健 刘建 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期1330-1336,共7页
收集某猪场1例发病种公猪的睾丸病料,处理后采用细胞培养与乳鼠脑内接毒相结合的方法盲传并结合RT-PCR方法分离鉴定,命名为乙型脑炎病毒(JEV)贵州分离株(GZ株),然后根据GenBank登录的日本乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株全基因序列设计... 收集某猪场1例发病种公猪的睾丸病料,处理后采用细胞培养与乳鼠脑内接毒相结合的方法盲传并结合RT-PCR方法分离鉴定,命名为乙型脑炎病毒(JEV)贵州分离株(GZ株),然后根据GenBank登录的日本乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株全基因序列设计并合成1对扩增E基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株E基因,并将E基因克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-E,经双酶切鉴定、测序及序列分析鉴定后,再将E基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建乙脑病毒E基因原核表达质粒pET-32a-E,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,得到了约59ku条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化和浓缩目的蛋白,并将其加入弗氏佐剂后免疫小鼠,免疫后采血检测抗体。结果显示:乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为乙型脑炎亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 贵州分离株 E基因 原核表达 免疫原性
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猪肺炎支原体P65基因原核表达及免疫原性分析 被引量：5
11
作者 刘茂军 张悦 +4 位作者 杜改梅 白昀 王海燕 姜平 邵国青 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期262-267,共6页
P65蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白,与其他支原体无交叉反应,常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白。本研究通过基因合成获得P65基因中含有3个稀有密码子的前922bp,利用PCR从Mhp168株扩增获得P65基因后段,然后通过重叠延伸PCR(SOE-PCR... P65蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白,与其他支原体无交叉反应,常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白。本研究通过基因合成获得P65基因中含有3个稀有密码子的前922bp,利用PCR从Mhp168株扩增获得P65基因后段,然后通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将前后段连接后,克隆入pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a(+)/mhp P65,经IPTG诱导获得87ku的重组融合蛋白,Western blot分析表明其与Mhp血清呈强阳性反应。将该重组蛋白免疫小鼠获得了高滴度的特异性抗体,表明该蛋白具有良好的免疫原性。本研究成功表达了可溶性的Mhp P65融合蛋白,其具有较好的免疫原性,这为猪肺炎支原体P65蛋白的功能研究以及诊断学方法的建立和亚单位疫苗的研制提供了帮助。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 P65基因 原核表达 免疫原性
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哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU的克隆、表达与免疫原性研究 被引量：13
12
作者 黄辉 毛芝娟 陈吉刚 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期346-350,共5页
根据已发表的哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应（PCR）方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已... 根据已发表的哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应（PCR）方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231。构建表达质粒pET-30a（＋）-OmpU后转化至大肠杆菌E.coliBL21（DE3）,在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符。重组蛋白以包涵体形式表达。以脲素法得到初步纯化的重组蛋白,以50μg/mL的剂量注射免疫大黄鱼幼鱼,经间接ELISA法检测了4-8周后特异性抗体的效价,同时检测了注射后4周的免疫保护率。结果表明,4-8周内特异性抗体效价持续升高,达到log28.0以上,4周时的相对免疫保护率为85%。试验结果显示了重组哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU具有良好的免疫原性,可作为亚单位疫苗的开发对象。 展开更多
关键词 哈维氏弧菌 外膜蛋白OmpU 克隆 原核表达 免疫原性
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肠道病毒71型VP1～VP4基因克隆及其表达产物的免疫原性 被引量：4
13
作者 宋远斌 余楠 +4 位作者 何思杰 陈欣欣 王斌 车小燕 曾其毅 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1846-1850,共5页
目的克隆并表达肠道病毒71型VP1~VP4蛋白基因,初步鉴定其免疫原性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1~VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物用8 mol/L尿素洗涤及Ni柱亲和层析纯化后,用肠道病毒71型免疫兔... 目的克隆并表达肠道病毒71型VP1~VP4蛋白基因,初步鉴定其免疫原性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1~VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物用8 mol/L尿素洗涤及Ni柱亲和层析纯化后,用肠道病毒71型免疫兔血清和柯萨奇病毒A16型免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA鉴定。结果构建的重组质粒pQE30a/VP1~VP4经IPTG诱导,重组蛋白VP1~VP4高效表达并纯化成功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1~VP4可以被免疫兔血清特异识别。结论肠道病毒71型VP1~VP4蛋白表达载体在大肠杆菌M15中高效表达。纯化产物具有较强的免疫原性,为今后EV71亚单位疫苗的研究和检测试剂盒提供了参考。 展开更多
关键词 肠道病毒71型 基因克隆 原核表达 免疫原性
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鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的多克隆抗体制备与免疫原性分析 被引量：6
14
作者 周勇 史玉恒 +5 位作者 范玉顶 刘文枝 江南 赵建青 许晨 曾令兵 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2018年第6期40-45,共6页
鲫(Carassius auratus)造血器官坏死症是我国养殖鲫中新出现的一种传染性病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2),为研制针对该病的有效诊断试剂和疫苗,分析了Cy HV-2 ORF25基因编码蛋白的抗原表位,利用原核表达系统对Cy HV-2 ORF2... 鲫(Carassius auratus)造血器官坏死症是我国养殖鲫中新出现的一种传染性病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2),为研制针对该病的有效诊断试剂和疫苗,分析了Cy HV-2 ORF25基因编码蛋白的抗原表位,利用原核表达系统对Cy HV-2 ORF25编码蛋白富含抗原表位的区域进行截短表达,制备了抗Cy HV-2 ORF25编码蛋白的多克隆抗体,通过间接免疫荧光和免疫保护力测定等实验研究了截短表达蛋白的免疫原性。结果显示,原核表达的截短蛋白t ORF25分子质量约为28 k W,蛋白纯化后免疫日本大耳兔制备的多克隆抗体可特异性识别在Gi CB上增殖的Cy HV-2。将截短表达蛋白t ORF25免疫异育银鲫后,感染Cy HV-2,其相对免疫保护率达47%。 展开更多
关键词 鲤疱疹病毒Ⅱ型 ORF25截短蛋白 原核表达 多克隆抗体 免疫原性
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广州管圆线虫ASP基因的克隆及原核表达 被引量：4
15
作者 郭鹏娟 詹希美 +5 位作者 甘明 李卓雅 于彦杰 潘智华 张美春 何蔼 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期471-474,共4页
目的对广州管圆线虫ASP基因的完整开放读码框进行克隆、表达及重组蛋白的免疫性分析。方法以广州管圆线虫幼虫cDNA文库中含有ASP基因的质粒为模板,扩增目的基因,进一步将其克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE... 目的对广州管圆线虫ASP基因的完整开放读码框进行克隆、表达及重组蛋白的免疫性分析。方法以广州管圆线虫幼虫cDNA文库中含有ASP基因的质粒为模板,扩增目的基因,进一步将其克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-IDA亲和层析纯化表达产物。免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫性。结果广州管圆线虫ASP基因的编码区含有366个碱基,编码121个氨基酸,相对分子量(Mt)为13398.26Da。重组质粒pET-30a(+)-ASP构建成功,IPTG诱导获得可溶性表达的重组蛋白,经亲和层析获得的纯化蛋白可被广州管圆线虫病人血清识别。结论广州管圆线虫ASP基因可在原核表达系统中获得具有免疫性的高效表达。 展开更多
关键词 广州管圆线虫 天冬氨酸蛋白酶 基因克隆 原核表达 免疫性
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α-银环蛇毒素基因的克隆及其非融合型原核表达 被引量：5
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作者 胡延春 张乃生 +3 位作者 邓俊良 左之才 廖玉辉 欧阳红生 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期463-469,共7页
根据文献报道α-银环蛇毒素的氨基酸序列推导出其DNA序列,设计并人工合成两两互补的14条寡核苷酸片段。经片段延伸、PCR、克隆,成功构建α-银环蛇毒素基因克隆质粒;质粒经XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切回收后连接于表达载体pET28a(+)中,分别转化B... 根据文献报道α-银环蛇毒素的氨基酸序列推导出其DNA序列,设计并人工合成两两互补的14条寡核苷酸片段。经片段延伸、PCR、克隆,成功构建α-银环蛇毒素基因克隆质粒;质粒经XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切回收后连接于表达载体pET28a(+)中,分别转化BL21(DE3)、BL21(DE3)Codon plus、BL21(DE3)plysS进行诱导表达,表达产物经Tris/tricine系统进行SDS-PAGE分析。结果表明:该基因已在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行了非融合表达,其表达量占细菌总蛋白的11.98%,主要以包涵体形式存在;同时对表达条件进行了优化,其表达量可达16.28%。经Western blot分析,在大约8 kDa处出现明显的目的带,与预计蛋白分子量大小一致,说明表达产物与天然α-银环蛇毒素具有相似的免疫原性。表达产物纯化、复性后经动物毒性试验表明:表达的α-银环蛇毒素蛋白具有生物学活性,小鼠腹腔注射其LD50约为1.28μg/g。 展开更多
关键词 Α-银环蛇毒素 基因克隆 非融合原核表达 免疫原性 生物学活性
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猪流行性腹泻病毒HB/FN株S基因的克隆、原核表达及免疫原性分析 被引量：5
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作者 王晨枫 左玉柱 +2 位作者 裴丽华 杨震 范京惠 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第5期21-25,共5页
根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)经典毒株的S基因序列并参照pMD19-T载体序列,设计了一对分别引入限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,PCR方法从猪流行性腹泻病毒HB/FN株中扩增得到一条1 080bp的片段。将其连入pMD19-T... 根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)经典毒株的S基因序列并参照pMD19-T载体序列,设计了一对分别引入限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,PCR方法从猪流行性腹泻病毒HB/FN株中扩增得到一条1 080bp的片段。将其连入pMD19-T载体中,经酶切鉴定并测序,测序结果和参考株S基因同源性高达100%。根据抗原性分析选择其抗原性较高的655bp基因片段分别插入到pET-28a(+)、pET-32a(+)、pGEX-6p-1中,构建3种不同的原核表达载体,经合适条件的IPTG诱导后SDS-PAGE分析,结果显示S基因在3种表达载体中均能表达,在pET-28a(+)中表达量最高,表达产物分子质量约为25ku。利用His标签的特性对重组蛋白进行纯化,Western blot证明蛋白可以与PEDV阳性血清产生特异性结合反应。用纯化的蛋白免疫小鼠,抗体检测显示S蛋白具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S基因 原核表达 免疫原性
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溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统注射装置蛋白VscO的原核表达及免疫原性 被引量：7
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作者 庞欢瑛 周泽军 +3 位作者 丁燏 黄郁葱 吴灶和 简纪常 《广东海洋大学学报》 CAS 2014年第3期41-46,共6页
为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(NO.KJ179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vsc... 为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(NO.KJ179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscO基因,序列分析结果显示,该基因全长462 bp,理论分子质量为18.430ku。将vscO基因定向插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-vscO。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为22 ku的VscO融合蛋白,且该蛋白主要以包涵体形式存在。VscO蛋白表达和纯化的最优条件为:0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4 h,咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,获得高效多克隆抗体。Western-blotting结果表明,鼠抗VscO血清既能与重组VscO蛋白发生反应,也能与分离自溶藻弧菌约22 ku的天然蛋白发生反应,提示T3SS注射装置蛋白VscO可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。 展开更多
关键词 溶藻弧菌 vscO基因 Ⅲ型分泌系统 原核表达 免疫原性
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CRP基因原核表达载体的构建和表达及其免疫原性检测 被引量：3
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作者 余云芳 姚伟 +4 位作者 张昌菊 鲁林 何正权 乐超银 梁宏伟 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期226-229,共4页
采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白。以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的CRP基因,将其克隆入表达载体pET28 a(+)中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原... 采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白。以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的CRP基因,将其克隆入表达载体pET28 a(+)中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测。成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28 a(+)-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性。结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨。 展开更多
关键词 C反应蛋白 原核表达 IPTG 免疫原性
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牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究 被引量：5
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作者 张锐 杨铭伟 +3 位作者 任静静 朱玲 柳旭伟 剡根强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第7期1949-1957,共9页
试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,转... 试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,重组蛋白P48大小约为66ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平(D450nm值为1.126)。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。 展开更多
关键词 牛支原体新疆分离株 P48基因 克隆 原核表达 免疫原性
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