多交叉置换扩增结合纳米生物传感器检测伊氏李斯特菌的方法建立

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作者 李慧 王毅 +1 位作者 王艳 叶长芸 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期605-612,共8页

目的应用多交叉置换扩增技术结合纳米生物传感器(multiple cross displacement amplification coupled with gold nanoparticle-based lateral flow biosensor,MCDA-LFB)建立一种快速、特异和灵敏的伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,L.iv... 目的应用多交叉置换扩增技术结合纳米生物传感器(multiple cross displacement amplification coupled with gold nanoparticle-based lateral flow biosensor,MCDA-LFB)建立一种快速、特异和灵敏的伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,L.ivanovii)检测方法,并对该方法进行评价。方法以L.ivanovii种特异性基因smcl为靶标设计引物,对引物进行最佳反应温度、灵敏度和特异性测试,并用模拟样本和实际样本进行评估。结果L.ivanovii-MCDA-LFB的最佳反应温度为64℃。在L.ivanovii和non-L.ivanovii菌种鉴定中,该方法特异性为100%。此外,L.ivanovii-MCDA-LFB在纯培养物和模拟污染粪便样本的灵敏度分别为10 fg/反应和6.8×10^(2) CFU/g。在195份野鼠粪便样本增菌培养物检测中,L.ivanovii-MCDA-LFB检测结果和传统培养法(ISO 11290-1)结果相同,且只需二次增菌液水煮模板即可检出。结论L.ivanovii-MCDA-LFB方法作为一种快速、灵敏和特异的诊断方法可应用于食品、医疗和科研领域。 展开更多

关键词 伊氏李斯特菌 多交叉置换扩增 纳米生物传感器 smcl基因 最低检测限

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混合斑中精子细胞分离及其DNA制备方法 被引量：5

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作者 李鑫 胡兰 +1 位作者 冯雪飞 刘晓 《法医学杂志》 CAS CSCD 2007年第4期286-289,共4页

目的尝试建立一种检测混合斑中精子细胞的方法。方法使用显微操作法捕获精子细胞,全基因组扩增(多重置换扩增)精子细胞DNA。结果对10管精斑检材的全基因组扩增,获得了高产、保真的产物。使用50μL体系对20个精子细胞直接进行全基因组扩... 目的尝试建立一种检测混合斑中精子细胞的方法。方法使用显微操作法捕获精子细胞,全基因组扩增(多重置换扩增)精子细胞DNA。结果对10管精斑检材的全基因组扩增,获得了高产、保真的产物。使用50μL体系对20个精子细胞直接进行全基因组扩增,省去了对起始模板的纯化过程,DNA扩增倍数达30000倍以上,片段长度大多在15 kb以上,其STRs复合扩增分型结果有可参照性。结论显微操作法可以有效捕获精子细胞,排除干扰,多重置换扩增可以提供足够量的产物用于法医DNA分析,该方法具有可行性。 展开更多

关键词 法医物证学 显微操作法 混合斑 精子细胞 多重置换扩增 全基因组扩增 短串联重复序列

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X-连锁严重联合免疫缺陷病的植入前遗传学诊断 被引量：2

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作者 吴海涛 沈晓婷 +5 位作者 叶青剑 刘瑜亮 钟依平 曾艳红 徐艳文 周灿权 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期955-960,共6页

【目的】采用多重置换扩增建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断方法,应用于X-连锁严重联合免疫缺陷病(X-SCID)的植入前遗传学诊断(PGD)。【方法】选择5个位于致病基因IL-2受体γ链(IL2RG)基因两侧的短串联重复序列(STR)位点对X-SCID... 【目的】采用多重置换扩增建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断方法,应用于X-连锁严重联合免疫缺陷病(X-SCID)的植入前遗传学诊断(PGD)。【方法】选择5个位于致病基因IL-2受体γ链(IL2RG)基因两侧的短串联重复序列(STR)位点对X-SCID家系进行单体型分析,采用多重置换扩增(MDA)对单细胞进行全基因组扩增,对扩增产物采用在家系分析中具有多态性的STR位点进行单体型分析,结合位点Amel进行性别诊断,STR位点均采用单重荧光PCR,同时对IL2RG基因exon5进行测序分析。【结果】对家系分析中,共有3个STR位点具有多态性。对10个单淋巴细胞及10个单卵裂球进行了预实验:MDA扩增成功率为100%,对致病基因IL2RG exon5的行基因测序的检测效率为100%;对于3个有多态性的STR位点和AMEL,PCR扩增效率为96.3%(77/80),等位基因脱扣率(ADO)为11.5%(7/61)。对该家系进行了一个周期的PGD,对7个胚胎进行了诊断,其中2个为正常胚胎,移植后获得双胎妊娠,早产活产一个健康男婴及一个健康女婴。【结论】采用多重置换扩增结合致病基因特异性扩增测序检测及单体型分析在单细胞水平对X-连锁严重联合免疫缺陷病进行检测,两者相结合可避免污染、等位基因脱扣等导致的误诊,提高了PGD诊断效率。 展开更多

关键词 X-连锁严重联合免疫缺陷病 植入前遗传学诊断 多重置换扩增 短串联重复序列 单体型分析

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采用多重置换扩增进行软骨发育不全的植入前遗传学诊断 被引量：1

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作者 沈晓婷 郭奕斌 +5 位作者 徐艳文 钟依平 曾艳红 王静 丁晨晖 周灿权 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期564-568,共5页

【目的】采用多重置换扩增建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断方法,可应用于软骨发育不全的植入前遗传学诊断。【方法】对软骨发育不全高危家系采用8个与成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）基因紧密连锁的短串联重复序列（STR）进行... 【目的】采用多重置换扩增建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断方法,可应用于软骨发育不全的植入前遗传学诊断。【方法】对软骨发育不全高危家系采用8个与成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）基因紧密连锁的短串联重复序列（STR）进行软骨发育与不全（ACH）的单体型分析。采用多重置换扩增（MDA）对单细胞进行全基因组扩增,对其产物采用在家系分析中具有多态性的STR位点及PCR-限制性酶切法检测FGFR3基因进行分析。【结果】对家系分析中,共有5个STR位点具有多态性。共进行了10个单淋巴细胞及11个单卵裂球的MDA,MDA扩增效率为100%（21/21）,单个淋巴细胞MDA产物的PCR结果与其外周血结果比较,平均PCR扩增率为96.8%（122/126,变化范围95.4%~100%）,平均ADO率为8.5%（7/82,变化范围0~12.6%）,综合诊断效率为100%,其中一个单淋巴细胞的MDA产物在经过酶切后未能检测出两个条带,出现了异常等位基因的脱扣,在11个单卵裂球的MDA产物中进行致病基因的检测,经酶切后均只产生一条条带。【结论】本研究采用限制性酶切法直接检测FGFR3基因及单体型分析在单细胞水平对ACH进行检测,两者相结合可避免污染、等位基因脱扣等导致的误诊,可提高软骨发育不全的PGD诊断效率,为进一步的临床应用奠定了基础。 展开更多

关键词 软骨发育不全 植入前遗传学诊断 多重置换扩增 单体型分析

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短串联重复序列在染色体罗氏易位植入前遗传学诊断的应用 被引量：2

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作者 沈晓婷 吴海涛 +5 位作者 徐艳文 钟依平 曾艳红 王静 丁晨晖 周灿权 《实用妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期830-833,共4页

目的：采用多重置换扩增（MDA）结合短串联重复序列（STR）建立一种基于PCR技术诊断染色体罗氏易位的植入前遗传学诊断（PGD）方法。方法：选择位于易位染色体上的STR位点，对家系采用荧光PCR进行分析，选择有多态性的位点，再采用MDA... 目的：采用多重置换扩增（MDA）结合短串联重复序列（STR）建立一种基于PCR技术诊断染色体罗氏易位的植入前遗传学诊断（PGD）方法。方法：选择位于易位染色体上的STR位点，对家系采用荧光PCR进行分析，选择有多态性的位点，再采用MDA对单细胞进行全基因组扩增，根据家系分析的结果，对具有多态性的STR位点进行分析诊断。结果：对3个家系进行了4个取卵周期（3个PGD周期），每个家系分别采用7～15个具有多态性的STR位点进行分析，共对24个胚胎进行诊断。PGD的诊断效率为95．8％（23／24），平衡胚胎占52．2％（12／23），异常胚胎占47．8％（11／23），共移植了6个胚胎，获得2例临床妊娠，临床妊娠率为66．7％（2／3），出生了2个健康婴儿，染色体核型均正常。结论：采用依赖于STR的PCR分析法可以用于染色体罗氏易位的PGD。 展开更多

关键词 植入前遗传学诊断 多重置换扩增 短串联重复序列 染色体罗氏易位

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多重置换扩增在病理切片DNA分型中的应用 被引量：1

6

作者 张越 陈阳 +2 位作者 杨元立 李继周 李朝品 《法医学杂志》 CAS CSCD 2013年第1期17-20,共4页

目的探讨多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)技术应用于法医学组织病理切片DNA分型的可行性。方法采用重复拉丁方设计实验,按保存时间、组织类型、尸源年龄3个因素分7个水平进行随机分组,共制作98例病理切片。硅珠... 目的探讨多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)技术应用于法医学组织病理切片DNA分型的可行性。方法采用重复拉丁方设计实验,按保存时间、组织类型、尸源年龄3个因素分7个水平进行随机分组,共制作98例病理切片。硅珠法制备DNA模板,对照组直接采用AmpFlSTR IdentifilerTM试剂盒进行PCR扩增,实验组进行MDA后再进行扩增。以新鲜尸体组织的分型结果为标准,对比分析切片实验组与对照组的基因座检出数与检出率。结果各保存时间切片实验组与对照组的基因座检出率相比差异有统计学意义(P<0.01);组织切片保存时间为360 d以内,实验组的16个基因座检出率均可达到95%以上。各组织类型间的差异具有统计学意义(P<0.01),而尸源年龄组间差异无统计学意义(P>0.01)。结论 MDA可提高病理切片模板基因组量,相对降低PCR扩增抑制物浓度,减少等位基因脱扣现象,有效提高基因座检出率,MDA在法医切片DNA分型中具有运用价值,但应注意切片保存时间与组织类型等因素对分型结果的影响。 展开更多

关键词 法医遗传学 冷冻切片 多重置换扩增

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探讨植物单染色体测序中的假阳性问题 被引量：1

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作者 王发明 莫权辉 +5 位作者 叶开玉 龚弘娟 刘平平 蒋桥生 齐贝贝 李洁维 《广西植物》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期16-23,共8页

单细胞测序技术目前虽已广泛应用于人类、动物、微生物等物种的研究,但由于细胞壁的存在,使得该技术在植物上的应用举步维艰。如果能先分离出植物单条染色体,然后再应用单细胞测序技术进行扩增和测序,则可以避免细胞壁的干扰,从而具有... 单细胞测序技术目前虽已广泛应用于人类、动物、微生物等物种的研究,但由于细胞壁的存在,使得该技术在植物上的应用举步维艰。如果能先分离出植物单条染色体,然后再应用单细胞测序技术进行扩增和测序,则可以避免细胞壁的干扰,从而具有重要的应用价值。虽然科研人员一直尝试针对单条植物染色体进行测序,但目前尚未见有成功的报道,也未见有文章对失败的原因进行讨论。该研究以六倍体中国春小麦为材料,针对使用单细胞测序技术进行单染色体扩增过程中出现的假阳性问题进行了探讨,分析了单染色体扩增失败的主要原因,并通过高通量测序技术研究了外源污染的可能来源。结果表明:在对实验器具、耗材、环境污染严格防控的基础上,人体接触可能是造成污染的主要来源;同时,推测单染色体之所以扩增失败可能是因为染色体自身超螺旋状态造成引物难以结合和复制。该研究还针对存在的问题提出了可行性建议,为将来成功进行单染色体测序提供了有益的借鉴。 展开更多

关键词 单染色体 单细胞测序 外源污染 假阳性 mda MALBAC

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SNP基因芯片结合多重置换扩增技术检测单细胞非整倍体的研究

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作者 凌家炜 方丛 +1 位作者 徐艳文 庄广伦 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期468-472,476,共6页

【目的】建立并优化利用微阵列-比较基因组杂交技术检测单细胞非整倍体的实验方案。【方法】纤维母细胞系GM02732(47,XY,+18)和GM00343[46,XY,4(del)(qter>p14)]被用于实验。阳性对照组为上述细胞系的基因组DNA(gDNA)(A组与B组,n=6)... 【目的】建立并优化利用微阵列-比较基因组杂交技术检测单细胞非整倍体的实验方案。【方法】纤维母细胞系GM02732(47,XY,+18)和GM00343[46,XY,4(del)(qter>p14)]被用于实验。阳性对照组为上述细胞系的基因组DNA(gDNA)(A组与B组,n=6);实验组为单细胞模板的多重置换扩增(MDA)产物(C组与D组,n=10);阴性对照组为空白对照的MDA产物(E组,n=6)。以上样本与10k2.0基因分型芯片杂交并进行染色体拷贝数分析,比较利用非扩增的正常gDNA和同法扩增的DNA(MDA-DNA)作为分析参照对C组和D组的结果准确度的影响。【结果】A→E组的芯片杂交信号判读率分别为98.7%、97.2%、86.7%、85.9%与3.2%。利用单细胞MDA-DNA作为参照时,C组与D组杂交信号的变异程度明显小于使用gDNA作为参照时(P<0.05)。利用CNAT分析软件,发现以gDNA作为参照时,C组与D组部分染色体优势扩增明显,而使用MDA-DNA作为参照时则未观察到类似现象。【结论】结合MDA和基因芯片平台对单细胞进行非整倍体检测时应使用同法扩增的DNA作为分析参照。 展开更多

关键词 SNP基因分型芯片 多重置换扩增 非整倍体筛查 植入前遗传学诊断

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多交叉置换扩增技术在单增李斯特菌检测中的应用及评价 被引量：2

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作者 李慧 王毅 +3 位作者 王艳 李华 陈峥宏 叶长芸 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期99-104,共6页

目的应用多交叉置换扩增(MCDA)技术建立单增李斯特菌的简单、快速、敏感且特异的诊断方法,并对该方法进行敏感度、特异性及实际应用评价。方法根据单增李斯特菌的种特异性基因lmo0733设计引物,采用荧光染料颜色变化、实时浊度检测及琼... 目的应用多交叉置换扩增(MCDA)技术建立单增李斯特菌的简单、快速、敏感且特异的诊断方法,并对该方法进行敏感度、特异性及实际应用评价。方法根据单增李斯特菌的种特异性基因lmo0733设计引物,采用荧光染料颜色变化、实时浊度检测及琼脂糖凝胶电泳三种方法确认MCDA产物,对MCDA引物进行最佳反应条件、敏感度、特异性评估,并对实际样本进行检测。结果单增李斯特菌MCDA检测方法的最佳反应温度为61℃。单增李斯特菌MCDA检测方法的敏感度为10fg/反应,分别是环介导等温扩增(LAMP)技术和交叉引物恒温扩增(CPA)技术的25倍和250倍。对153份鼠粪便标本2次增菌培养物的检测结果证实,本研究建立的单增李斯特菌MCDA检测方法的检测能力与分离培养方法(ISO 11290-1)相同,且优于LAMP、CPA和PCR方法。结论 MCDA方法作为一种快速、敏感和高效的检测方法可以应用于食品行业及临床标本中单增李斯特菌的检测。 展开更多

关键词 单增李斯特菌 多交叉置换扩增 lmo 0733基因 最低检测限

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四种单增李斯特菌常用核酸检测方法的评价与应用 被引量：3

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作者 纪顺师 叶长芸 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1085-1091,1099,共8页

目的应用聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光PCR(Real-time PCR)、环介导等温扩增(LAMP)和多交叉置换扩增(MCDA)4种核酸检测方法,对单增李斯特菌进行检测,探索特异、灵敏、高效,且适用于肉类样本中单增李斯特菌检测的核酸检测方法。方法比... 目的应用聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光PCR(Real-time PCR)、环介导等温扩增(LAMP)和多交叉置换扩增(MCDA)4种核酸检测方法,对单增李斯特菌进行检测,探索特异、灵敏、高效,且适用于肉类样本中单增李斯特菌检测的核酸检测方法。方法比较文献报道的以单增李斯特菌特异性基因lmo0733作为靶标的4种核酸检测方法,评价这4种方法在特异性、灵敏度、检出速率方面的差异,并应用于单增李斯特菌模拟样本和猪肉样本中单增李斯特菌的检测。结果传统PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法都能准确检测单增李斯特菌,其中MCDA方法检测下限为10 fg/反应,且能在30 min内完成对样本核酸的检测,灵敏度和检出速率优于其它3种核酸诊断方法;MCDA方法对于模拟样本和实际样本的检测效率优于其它3种核酸检测方法和传统分离培养方法,能够提高样本检测的阳性率。结论MCDA方法作为一种特异、灵敏和高效的核酸检测方法,可用于肉制品中单增李斯特菌检测时的快速筛查,并能提高传统分离培养方法对标本中单增李斯特菌的阳性检出率。 展开更多

关键词 单增李斯特菌 聚合酶链式反应 实时荧光PCR 环介导等温扩增 多交叉置换扩增

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多重置换扩增在含抑制物检材中的应用 被引量：1

11

作者 丁东雪 丁梅 《法医学杂志》 CAS CSCD 2016年第5期342-345,共4页

目的研究多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)在含抑制物检材中的抗抑制能力,与磁珠法纯化检材相比较,证明其在法医学中的应用及意义。方法将不同浓度血红素和腐殖酸与样本DNA进行混合,分为MDA处理组、磁珠法处理组... 目的研究多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)在含抑制物检材中的抗抑制能力,与磁珠法纯化检材相比较,证明其在法医学中的应用及意义。方法将不同浓度血红素和腐殖酸与样本DNA进行混合,分为MDA处理组、磁珠法处理组和空白对照组,PCR-STR单基因座D3S1358扩增联合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,并应用Amp F詛STR誖IdentifilerTMPlus试剂盒联合毛细管电泳检测。结果血红素质量浓度大于1 ng/μL或腐殖酸质量浓度大于0.1 ng/μL时,空白对照组经单基因座STR检测不能得到扩增产物;磁珠法处理组血红素质量浓度大于100 ng/μL或腐殖酸浓度大于1 ng/μL时,不能够得到扩增产物;MDA处理组各浓度抑制物均能成功扩增,完全不受抑制物影响。结论 MDA技术可消除血红素及腐殖酸的抑制作用,其抗抑制能力优于磁珠法纯化DNA,具有一定的法医学应用意义。 展开更多

关键词 法医遗传学 核酸扩增技术 多重置换扩增 抑制物 血红素 腐殖酸

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全基因组扩增法应用于低拷贝数DNA检测 被引量：11

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作者 周怀谷 张晨 《法医学杂志》 CAS CSCD 2006年第1期43-44,47,共3页

目的建立基于多重置换扩增(MDA)技术的全基因组扩增(WGA)方法,实现对低拷贝数(LCN)DNA样品进行分析。方法采用REPLI-g试剂盒对样本进行等温全基因组扩增,扩增产物采用ProfilerPlus试剂盒确定样本的十个STR基因座的等位基因型。结果10pg... 目的建立基于多重置换扩增(MDA)技术的全基因组扩增(WGA)方法,实现对低拷贝数(LCN)DNA样品进行分析。方法采用REPLI-g试剂盒对样本进行等温全基因组扩增,扩增产物采用ProfilerPlus试剂盒确定样本的十个STR基因座的等位基因型。结果10pgDNA模板经全基因组扩增后,能够进行DNA分型。结论全基因组扩增可以用于LCN的DNA分析,帮助提高微量物证的检出成功率。 展开更多

关键词 多重置换扩增 全基因组扩增 低拷贝数

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REPLI-g~? Single Cell Kit应用于微量DNA扩增的效率评估

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作者 徐倩南 沈琼 +4 位作者 张佳怡 张轶伦 李莉 刘希玲 李成涛 《法医学杂志》 CAS CSCD 2019年第2期210-215,共6页

目的评估REPLI-g~?Single Cell Kit应用于检材DNA扩增的效率,探讨该试剂盒在法医学微量DNA扩增方面的应用价值。方法选取3种微量DNA提取试剂盒,对来自10名无关个体的外周血进行DNA提取,并对所提DNA的产量和纯度进行比较。根据比较结果选... 目的评估REPLI-g~?Single Cell Kit应用于检材DNA扩增的效率,探讨该试剂盒在法医学微量DNA扩增方面的应用价值。方法选取3种微量DNA提取试剂盒,对来自10名无关个体的外周血进行DNA提取,并对所提DNA的产量和纯度进行比较。根据比较结果选取1例DNA样本进行浓缩稀释作为全基因组扩增起始样本,使用REPLI-g~?Single Cell Kit对起始样本进行全基因组扩增,计算扩增产量及扩增倍数,并进行琼脂糖凝胶电泳检测片段分布情况。使用Goldeneye~? DNA身份鉴定系统20A对起始样本和经全基因组扩增所得DNA进行STR分型。结果经比较后选取由QIAsymphony~? DNA Investigator~? Kit所提取的1例DNA进行浓缩稀释作为全基因组扩增起始样本。经REPLI-g~?Single Cell Kit对一系列起始样本全基因组扩增后,发现扩增产量均值最低可达到8.77×10~3ng,相应的扩增倍数均值为1.40×10~6,DNA片段大且集中。全基因组扩增样本随着起始样本量的减少,STR分型成功率降低,但当起始样本量低于0.5ng时,全基因组扩增后样本的STR分型成功率高于相同起始量未经全基因组扩增样本的STR分型成功率。结论应用REPLI-g~?Single Cell Kit可有效提高模板DNA总量,特别对于微量DNA,可在一定程度上提高STR分型成功率。 展开更多

关键词 法医遗传学 短串联重复 全基因组扩增 多重置换扩增 微量检材

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