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单核细胞增多性李斯特菌iap基因的克隆、表达与p60蛋白的纯化 被引量:3
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作者 吕添 武海涛 +1 位作者 曹正茂 王小红 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2010年第11期157-161,共5页
以单增李斯特菌基因组DNA为模板,利用自行设计的引物,通过PCR法扩增出单增李斯特菌的iap基因。在iap基因的5'端和3'端分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ2个酶切位点将其克隆到pMD-18T载体上,构建克隆载体pMD-18T-iap。经测序正确后,将iap... 以单增李斯特菌基因组DNA为模板,利用自行设计的引物,通过PCR法扩增出单增李斯特菌的iap基因。在iap基因的5'端和3'端分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ2个酶切位点将其克隆到pMD-18T载体上,构建克隆载体pMD-18T-iap。经测序正确后,将iap基因克隆至表达载体pET-28a上构建表达质粒pET-28a-iap。在IPTG诱导下,携带pET-28a-iap的E.coliBL21(DE3)高效表达分子质量约为60kD的可溶性蛋白及包涵体形式的蛋白,其中可溶性蛋白占总p60蛋白含量的76.3%左右。诱导表达的可溶性蛋白通过Ni2+亲和层析柱纯化得到纯度在95.6%以上的重组p60蛋白,其提取率为68.3%左右。 展开更多
关键词 单核细胞增多性李斯特菌 iap基因 克隆 表达 p60蛋白 纯化
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食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立 被引量:9
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作者 徐义刚 崔丽春 +4 位作者 李丹丹 刘忠梅 李苏龙 张子群 张国财 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第16期137-141,共5页
基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测... 基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。 展开更多
关键词 单核细胞增生李斯特菌 iap基因 环介导恒温扩增 快速检测
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基于双启动引物特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的PCR方法 被引量:7
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作者 徐义刚 李丹丹 +4 位作者 张柏棋 刘忠梅 魏冬旭 刘新亮 李苏龙 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期86-89,共4页
以单核细胞增生李斯特氏菌iap基因为靶基因,利用一新型PCR引物设计方法——双启动引物(Dual-primingoligonucleotide,DPO),建立了特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的DPO—PCR方法,测试了DPO—PCR方法退火温度不敏感性、特异性及... 以单核细胞增生李斯特氏菌iap基因为靶基因,利用一新型PCR引物设计方法——双启动引物(Dual-primingoligonucleotide,DPO),建立了特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的DPO—PCR方法,测试了DPO—PCR方法退火温度不敏感性、特异性及灵敏度,并在实践检测中进行了初步应用。结果显示:该方法检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为1.51×10^2CFU/mL;退火温度不敏感性测试中,与常规PCR引物相比,DPO引物在48~68℃退火温度范围内均能够高效率地扩增靶基因;特异性测试中,DPO—PCR方法能特异地检测出目标菌,与其他菌株无非特异性扩增反应,比常规PCR方法显示出更强的特异性。实践应用证明,利用DPO—PCR方法对130份样本进行检测,共计检出9份单核细胞增生李斯特氏菌阳性样本,经国标法(GB/T4789.30—2008)复检,两者检测结果一致,显示出良好的实用性,为单核细胞增生李斯特氏菌的快速准确检测提供了新方法。 展开更多
关键词 单核细胞增生李斯特氏菌 iap基因 DPO-PCR方法
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