一步法RT-LAMP-HNB检测兰花建兰花叶病毒和齿舌兰环斑病毒方法的建立 被引量：4

1

作者 徐匆 黄皓 +5 位作者 罗华建 杜见南 黄晓彦 陈彦 梁卫驱 胡珊 《广东农业科学》 CAS 2022年第5期95-101,共7页

【目的】全世界兰花病毒有50余种,建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿舌兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒病,因此建立针对病毒的高效监测、检测方... 【目的】全世界兰花病毒有50余种,建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿舌兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒病,因此建立针对病毒的高效监测、检测方法,对控制兰花病毒感染具有至关重要的意义。【方法】以兰花病毒CymMV和ORSV为试验材料,采用反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)进行病毒RNA的扩增,从而建立CymMV和ORSV的快速检测方法。分别根据两种病毒的cp基因序列保守区设计RT-LAMP引物,在一步法RT-LAMP反应体系中加入羟基萘酚蓝(HNB,终浓度200 μmol/L)作为扩增产物指示剂,不需开盖进行凝胶电泳检测,便可直接根据体系颜色变化判读反应结果。【结果】利用该检测方法能够在2 h测出样品中是否存在CymMV和ORSV病毒RNA,其灵敏度是RT-PCR的10倍。对20株田间样品进行一步法RT-LAMP-HNB检测,根据田间检测结果显示,CymMV检出率为70%,ORSV检出率为55%,与RT-PCR结果保持一致,该法适用于田间样品检测。【结论】建立的一步法RT-LAMP-HNB是一种灵敏、快速、特异、便捷的CymMV和ORSV检测方法,仅需要简单控温设备如水浴锅便可进行核酸扩增,适用于在基层或不便利地区推广使用。 展开更多

关键词 建兰花叶病毒 齿舌兰环斑病毒 反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP) 羟基萘酚蓝(hnb) CP基因

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向日葵核盘菌环介导等温扩增检测技术 被引量：2

2

作者 常海城 李虎 +2 位作者 郑立秋 李海燕 孟庆林 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1412-1420,共9页

应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色变化、反应灵敏的向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)检测方法。筛选出检测核盘菌的LAMP特异性引物,建立了LAMP反应体系与优化条件,并进行灵... 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色变化、反应灵敏的向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)检测方法。筛选出检测核盘菌的LAMP特异性引物,建立了LAMP反应体系与优化条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明,以F3-1(ATGCCTGTTCGAGCGTCA)、B3-1(AGTTCAGC-GGGTATCCCTA)、FIP-1(GCCGCCACTGATTTTAGAGCCTTTTCAACCCTCAAGCTCAGC)、BIP-1(TCGTTACAG-GTTCTCGGTGTGCCCTGATCCGAGGTCAACCAT)为引物,反应体系中10×Bst Reaction Buffer 2.4μL、dNTP Mixture1.28 mmol·L^(-1)、F3/B3 0.15μmol·L^(-1)、FIP/BIP 0.8μmol·L^(-1)、HNB 150μmol·L^(-1)、MgSO_(4) 1.2 mmol·L^(-1)、Bst DNA聚合酶0.19 U·L^(-1)、ddH_(2)O 13.4μL等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果,且琼脂糖凝胶电泳验证显示清晰的梯形扩增结果。灰葡萄孢、疫霉、腐霉等其他供试菌株中均没有观察到这些现象,对核盘菌的特异性较强;LAMP技术最低检测限为1×10^(-3) ng·μL^(-1)。该方法的建立为向日葵核盘菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。 展开更多

关键词 向日葵核盘菌 环介导等温扩增技术 羟基萘酚蓝(hnb)

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小反刍兽疫LAMP反应结果可视化检测方法比较研究

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作者 索婧媛 郑茜之 +1 位作者 王博 刘学东 《野生动物学报》 北大核心 2024年第3期664-669,共6页

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种可应用于各种病原体检测、基因分型等领域的等温扩增技术。该技术所需设备简单且易于操作,因此具有较大的发展潜力。根据目前已经存在的判定LAMP结果的可视化方... 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种可应用于各种病原体检测、基因分型等领域的等温扩增技术。该技术所需设备简单且易于操作,因此具有较大的发展潜力。根据目前已经存在的判定LAMP结果的可视化方法,以可能对野生小反刍动物造成威胁的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)cDNA为检测对象,选择合适的引物组,比较评估均可在日光或紫外光下区分阴阳性结果的SYBR Green I、SYBR Safe Stain和羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)3种指示剂方法的适用性与灵敏度。结果表明:3种方法的灵敏度都很高,均与琼脂糖凝胶电泳相当。其中,SYBR Green I结果区分度高、不受体系成分影响且无须额外设备,但成本较高;SYBR Safe Stain具有良好的结果区分度,成本相对较低,但需要额外的紫外照射设备;HNB成本最低,但颜色区分度较低,且易受多种因素影响。建议在选择LAMP指示剂时,综合考虑成本、使用便利性、结果准确性及实验条件,通过充分的体系优化和验证,确保LAMP检测的准确性和可靠性。研究结果突显了不同方法的特征和适用场景,为研究人员根据不同场所与条件选择高效、便捷的LAMP反应结果可视化方法提供参考。 展开更多

关键词 环介导等温扩增 SYBR Green I SYBR Safe Stain 羟基萘酚蓝 小反刍兽疫病毒

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基于环介导等温扩增技术检测橡树疫霉菌 被引量：21

4

作者 戴婷婷 陆辰晨 +2 位作者 沈浩 王源超 郑小波 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期23-28,共6页

应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)检测方法。以ITS为靶序列对橡树疫霉菌的分子检测存在无法区分近似种的问题,笔者... 应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)检测方法。以ITS为靶序列对橡树疫霉菌的分子检测存在无法区分近似种的问题,笔者在橡树疫霉菌的基因组研究中,发现了PrA3aPro类转座子序列。生物信息学分析表明,该序列非常适合作为大豆疫霉分子检测的靶标。利用LAMP技术,以PrA3aPro为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系与条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明:整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,然后经3种方法验证扩增结果:1)浊度仪验证浊度变化;2)琼脂糖凝胶电泳验证;3)在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定。特异性试验中,在橡树疫霉菌株中能够产生浊度曲线,扩增到梯形条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度试验中,PrA3aPro-LAMP技术最低检测限为1 ng.μL-1。该方法的建立为橡树疫霉菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。 展开更多

关键词 橡树疫霉菌 环介导等温扩增 PrA3aPro 羟基萘酚蓝(hnb)

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利用环介导等温扩增技术检测黑白轮枝菌 被引量：6

5

作者 田擎 曾丹丹 +3 位作者 李彬 张海峰 王源超 郑小波 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期582-588,共7页

[目的]黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)能够危害苜蓿等多种作物,是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方... [目的]黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)能够危害苜蓿等多种作物,是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。[方法]基于LAMP技术,通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异,选取Tub(β-tublin,编码β-微管蛋白)基因作为靶标基因,设计并筛选了4条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和1条环引物,在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的LAMP体系,并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法在62℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。[结果]特异性试验中,仅黑白轮枝菌菌株DNA扩增后呈天蓝色的阳性反应,而在其他真菌的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为1 pg·μL^(-1)。Tub-LAMP技术能够检测出发病苜蓿植物组织中的目标菌,在采自新疆的7份疑似样本中检测到3份阳性。在土壤中人工添加孢子的试验中,Tub-LAMP技术能够从每0.25 g土壤含有10个孢子和每10 g苜蓿种子含有50个孢子中检测出该病菌。[结论]该方法的建立为黑白轮枝菌的检疫及其所致病害的诊断提供了新的技术。 展开更多

关键词 黑白轮枝菌 环介导等温扩增 Tub基因 羟基萘酚蓝(hnb)

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等温扩增技术快速检测棕榈疫霉 被引量：7

6

作者 戴婷婷 吴小芹 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第10期161-166,共6页

【目的】棕榈疫霉是农林业生产上的一种危害严重的病原菌,建立棕榈疫霉的快速分子检测技术对于预测疫病发生情况、及时采取有效的防治方法控制疫病的传播和流行、减少经济损失具有重要意义。【方法】采用环介导等温核酸扩增技术(loop-me... 【目的】棕榈疫霉是农林业生产上的一种危害严重的病原菌,建立棕榈疫霉的快速分子检测技术对于预测疫病发生情况、及时采取有效的防治方法控制疫病的传播和流行、减少经济损失具有重要意义。【方法】采用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了以基因间隔区(intergenic spacer,IGS)为靶标的快速、简单、特异和灵敏的棕榈疫霉菌的检测方法。以IGS基因为靶序列,利用环介导等温核酸扩增技术,设计了多组LAMP引物,同时建立并优化了LAMP反应体系与条件,最终筛选出1组扩增反应结果较好的LAMP引物,采用该组引物进行特异性、灵敏度和实际应用的验证。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定反应结果。【结果】整个检测过程在等温64℃条件下仅需80 min即可通过肉眼直接目测试验结果。在特异性试验中,通过HNB显色只有在棕榈疫霉菌株中能观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌的供试菌株仍为紫色的阴性反应;在灵敏度试验中,PpIGS-LAMP技术检测灵敏度达到10fg.μL^(-1)目标菌纯DNA;在实际应用中,PpIGS-LAMP技术能够快速检测出采自田间的木薯根部土壤中目标菌和人工接种发病木薯组织样品的目标菌。【结论】本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测棕榈疫霉,建立了1种快速、高灵敏度、高特异性、可视化的棕榈疫霉的LAMP检测方法。建立的棕榈疫霉菌的LAMP检测方法在80 min内可完成待检样品的检测过程,显著缩短检测时间,降低基层部门的检测成本,为棕榈疫霉引起疫病的检疫和所致病害的快速诊断提供了新的检测技术。 展开更多

关键词 棕榈疫霉 环介导等温扩增 PpIGS 羟基萘酚蓝

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大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测技术的建立 被引量：2

7

作者 吴旭东 陆辰晨 +4 位作者 沈浩 吴翠萍 张海峰 王源超 郑小波 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期568-574,共7页

[目的]应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的简便、快速和灵敏的大豆茎褐腐病菌[Phialophora gregata f.sp.sojae(PGS)]检测方法。[方法]利用LAMP技术,以ITS为靶序列,设计了4条... [目的]应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的简便、快速和灵敏的大豆茎褐腐病菌[Phialophora gregata f.sp.sojae(PGS)]检测方法。[方法]利用LAMP技术,以ITS为靶序列,设计了4条特异性的LAMP引物和2条环引物,在此基础上建立了检测大豆茎褐腐病菌的LAMP体系。[结果]整个检测过程仅需1 h就可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化可以判断PGS的存在与否。特异性试验中,大豆茎褐腐病菌菌株DNA扩增后HNB呈天蓝色的阳性反应,而在其他大豆常见病害的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。在灵敏度试验中,ITS-LAMP技术最低检测限为10 pg·μL-1,对于进口大豆残体样本中PGS的检测灵敏度为每10 g大豆植株残体50个孢子。[结论]该方法的建立为检疫性病害大豆茎褐腐病菌的检测提供了新的技术平台,符合我国口岸对大豆茎褐腐病菌快速检测的迫切需要。 展开更多

关键词 大豆茎褐腐病菌 环介导等温扩增 ITS 羟基萘酚蓝(hnb)

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基于可视化环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌 被引量：20

8

作者 郭建平 万佳佳 +4 位作者 陆兆新 吕凤霞 张充 赵海珍 别小妹 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第20期325-331,共7页

应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法.根据金黄色葡萄球菌特异性靶基因SAR0395设计LAMP引物,建立可视化LAMP检测方法.优化的反应体系为:1.6μmo... 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法.根据金黄色葡萄球菌特异性靶基因SAR0395设计LAMP引物,建立可视化LAMP检测方法.优化的反应体系为:1.6μmol/L内引物(FIP和BIP),0.2μmol/L外引物(F3和B3),4.0 mmol/L MgSO4,1.0 mmol/L dNTPs,0.4 U/μL Bst 2.0 WarmStartTMDNA聚合酶,120μmol/L羟基萘酚蓝,扩增温度60℃,扩增时间60 min.在可视化LAMP体系中添加两条环引物(LF和LB)反应时间可缩短至20 min.该可视化LAMP反应60 min,其基因组灵敏度可以达到0.0103 fg/μL,菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL;利用46株金黄色葡萄球菌和24株非金黄色葡萄球菌证实该可视化LAMP具有良好的特异性和可靠性.本研究中建立的可视化LAMP可为金黄色葡萄球菌的快速检测提供一种新的技术. 展开更多

关键词 可视化 环介导等温扩增技术 检测 金黄色葡萄球菌 羟基萘酚蓝

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北美栅锈菌和松杨栅锈菌可视化检测体系建立 被引量：1

9

作者 蓝燕 农花萍 +4 位作者 彭子嘉 陆颖 李坤蓬 徐勇 余仲东 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2023年第5期140-148,共9页

[目的]为实现北美栅锈菌和松杨栅锈菌快速有效的鉴别及鉴定。[方法]本研究根据两种锈菌的28SrDNA基因序列设计若干组LAMP引物。经筛选得到的引物以北美栅锈菌、松杨栅锈菌、图拉斯叉钩丝壳菌、芍药白粉菌、梨胶锈菌、羊肚菌、金针菇的... [目的]为实现北美栅锈菌和松杨栅锈菌快速有效的鉴别及鉴定。[方法]本研究根据两种锈菌的28SrDNA基因序列设计若干组LAMP引物。经筛选得到的引物以北美栅锈菌、松杨栅锈菌、图拉斯叉钩丝壳菌、芍药白粉菌、梨胶锈菌、羊肚菌、金针菇的基因组DNA为模板进行LAMP反应并完成特异性检测;首先建立初始LAMP反应体系,再进一步优化LAMP反应体系的组分和反应条件,加入羟基萘酚蓝实现可视化检测;最后确定检测体系灵敏度。[结果]表明,筛选出的引物具有特异性;25μL北美栅锈菌LAMP检测体系最佳Mg^(2+)浓度为6 mmol·L^(−1),最佳内外引物比例为8:1,最佳dNTPs浓度为1.2 mmol·L^(−1);同样地,25μL松杨栅锈菌LAMP检测体系最佳Mg^(2+)浓度为4 mmol·L^(−1),最佳内外引物比例为6:1,最佳dNTPs浓度为1 mmol·L^(−1)。加入160μM羟基萘酚蓝(HNB)可清晰地指示反应结果,两种检测体系在61℃条件下,分别反应30 min和40 min可实现目视判断结果,且灵敏度分别可达34 fg·μL^(−1)和60 fg·μL^(−1)。[结论]通过建立两种锈菌的可视化LAMP-HNB检测体系可实现对北美栅锈菌和松杨栅锈菌进行区分及鉴定,为快速鉴定和区分重要杨树锈病提供了技术支撑和实践参考。 展开更多

关键词 杨树 北美栅锈菌 松杨栅锈菌 环介导等温扩增技术 羟基萘酚蓝

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畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌可视化LAMP检测方法的研究 被引量：4

10

作者 陈琼 董华夏 +3 位作者 戴小芳 刘萍 晏涛 郦娟 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2020年第20期235-240,245,共7页

目的:建立一种设备要求简单、结果可视化的用于定性检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的快速检测方法。方法:通过对羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)浓度、叠氮溴化丙啶(propidium monoazide,PMA)浓度等的优化,结合环介导恒温扩增技... 目的:建立一种设备要求简单、结果可视化的用于定性检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的快速检测方法。方法:通过对羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)浓度、叠氮溴化丙啶(propidium monoazide,PMA)浓度等的优化,结合环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立一种PMA-HNB-LAMP联用的可视化的用于快速检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的方法,对其特异性、灵敏度进行测试,并用于人工污染样品和实际样品的检测。结果:本研究成功建立了LAMP扩增体系,并通过添加210μmol/L HNB到LAMP扩增体系中,得到了差异明显的阴阳性结果。建立的HNB-LAMP法特异性强,其纯菌液灵敏度为104 CFU/mL,样品基质灵敏度为105 CFU/mL。本研究中用于处理样品的PMA浓度为10μg/mL,处理条件为室温下避光孵育5 min,曝光15 min。在检测人工污染的样品时,PMA-HNB-LAMP法和传统微生物法检测结果一致。结论:本研究成功建立了可快速检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的可视化PMA-HNB-LAMP法。 展开更多

关键词 环介导恒温扩增技术 叠氮溴化丙啶 羟基萘酚蓝 金黄色葡萄球菌

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叠氮溴化丙锭-羟基萘酚蓝-环介导等温扩增法检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌 被引量：5

11

作者 戴小芳 陈琼 +3 位作者 董华夏 向春燕 虞伟明 郦娟 《肉类研究》 北大核心 2020年第5期48-52,共5页

将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)、羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术相结合,建立一种可视化PMA-HNB-LAMP方法快速检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌(Liste... 将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)、羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术相结合,建立一种可视化PMA-HNB-LAMP方法快速检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)。结果表明,当PMA终质量浓度为5.0μg/mL、孵育和曝光时间均为15 min时,可有效抑制10~5 CFU/m L的单核细胞李斯特菌死菌DNA的聚合酶链式反应扩增,而对活菌DNA的扩增不具有抑制作用。LAMP反应体系中HNB终浓度为210μmol/L时,检测显色结果肉眼可见。该方法的纯菌液灵敏度为2.4×10~2 CFU/m L,人工污染肉制品的检出限为2.3×10~4 CFU/m L。分别采用国标法、PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法检测20份市售畜禽肉样,3种方法的单核细胞李斯特菌检出率分别为5%、10%和20%。PMA-HNB-LAMP法在一定程度上可解决LAMP法的假阳性问题,并且具有操作简单、可视性强的优点。 展开更多

关键词 单核细胞李斯特菌 叠氮溴化丙锭 羟基萘酚蓝 环介导等温扩增 畜禽肉

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