利用改良SOE-PCR技术定点突变TuMVC4-VPg基因 被引量：3

1

作者 李国亮 钱伟 +7 位作者 张淑江 李菲 章时蕃 张慧 谢露露 武剑 王晓武 孙日飞 《中国蔬菜》 北大核心 2017年第10期39-44,共6页

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是白菜类蔬菜生产上的重要病害,其中Tu MV VPg基因在Tu MV侵染白菜类蔬菜的过程中起着至关重要的作用,且不同Tu MV株系的致病性不同。本试验采用改良的重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术,以Tu MV C4-VP... 芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是白菜类蔬菜生产上的重要病害,其中Tu MV VPg基因在Tu MV侵染白菜类蔬菜的过程中起着至关重要的作用,且不同Tu MV株系的致病性不同。本试验采用改良的重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术,以Tu MV C4-VPg基因序列为模板,定点突变Tu MV C4-VPg与Tu MV CDN1-VPg基因间5个差异核苷酸位点(决定5个氨基酸差异)。结果表明:通过SOE-PCR技术获得了5个Tu MV C4-VPg基因的单点突变体,即Tu MV C4-VPg-Ⅰ、Tu MV C4-VPg-Ⅱ、Tu MV C4-VPg-Ⅲ、Tu MV C4-VPg-Ⅳ和Tu MV C4-VPg-Ⅴ。 展开更多

关键词 白菜类蔬菜 芜菁花叶病毒 VPg基因 重叠延伸pcr技术 单点突变

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利用交错延伸剪接PCR技术扩增油菜花粉育性基因MS2 Bnap全长cDNA序列 被引量：3

2

作者 李德谋 罗小英 +3 位作者 侯磊 裴炎 方卫国 杨光伟 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期553-555,共3页

交错延伸剪接PCR是一种用于分子进化研究的DNA改组技术。本实验利用其原理 ,将已获得的油菜花粉育性基因MS2Bnap有部分序列重叠的三段PCR产物作为模板进行扩增 ,获得了花粉育性基因MS2Bnap的全长cD NA序列。

关键词 交错延伸剪接pcr 花粉育性基因MS2Bnap 全长CDNA序列 油菜 植物

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降落-重叠PCR法四重融合构建平菇同源重组片段 被引量：10

3

作者 柴冉 孙强 邱立友 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期375-379,共5页

对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法.本文提出一种新的融合PCR策略,即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序,减少不适当的退火温度和PCR产物3'端额外碱基A对片段融合、扩增的影响,提高正确融合与扩增的效率... 对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法.本文提出一种新的融合PCR策略,即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序,减少不适当的退火温度和PCR产物3'端额外碱基A对片段融合、扩增的影响,提高正确融合与扩增的效率.结果表明,为构建平菇葡聚糖合成酶启动子的同源重组序列,在4个长度分别是1 015 bp、2 822 bp、2 206 bp和1 008 bp的片段进行融合时,在重叠PCR的第1步加上退火温度61.5℃～57.5℃、每降落0.5℃进行1个循环的降落PCR程序,在重叠PCR的第2步加上退火温度60℃～56℃、每降落0.5℃进行1个循环的降落PCR程序,经过1次PCR即获得顺序正确的全长融合片段.测序结果与4个片段序列的一致性达到98.5%,降落-重叠PCR法对多个长片段的基因融合具有较高的应用价值. 展开更多

关键词 基因融合 重叠pcr 降落pcr 同源重组

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重叠延伸PCR克隆拟南芥ACCase基因和植物表达载体构建 被引量：5

4

作者 胡亚平 夏玉平 +4 位作者 吴刚 武玉花 肖玲 李均 卢长明 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期407-412,420,共7页

植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7 000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将... 植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7 000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将其cDNA分成八个重叠的片段分别扩增出来,再用重叠延伸PCR将得到的片段逐步拼接成长度为6 890bp的完整的基因序列,测序证实克隆序列正确无误,最后将其克隆到农杆菌转化植物的载体上。序列分析发现ACCase基因的开放阅读框长度为6 765bp,编码一个含2 254个氨基酸残基的多肽链,推测其分子量约为250kDa。ACCase基因的成功克隆为利用该基因调控油料作物的含油量奠定了良好基础,同时为克隆长度较大的基因提供了一种经济可行的方法。 展开更多

关键词 重叠延伸pcr 乙酰辅酶A羧化酶 基因克隆

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利用重叠PCR技术对OsAMT1.2进行定点突变 被引量：2

5

作者 李宝珍 李素梅 +1 位作者 施卫明 苏彦华 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期69-72,共4页

铵是植物吸收利用的主要氮源之一,而铵转运蛋白对铵的吸收、转运和代谢方面有重要的作用。为了深入研究水稻铵转运蛋白的结构功能特性,利用重叠PCR技术对OsAMT1.2蛋白质序列中保守的253 aa和257 aa的苯丙氨酸(F)和丝氨酸(S)分别突变为... 铵是植物吸收利用的主要氮源之一,而铵转运蛋白对铵的吸收、转运和代谢方面有重要的作用。为了深入研究水稻铵转运蛋白的结构功能特性,利用重叠PCR技术对OsAMT1.2蛋白质序列中保守的253 aa和257 aa的苯丙氨酸(F)和丝氨酸(S)分别突变为丙氨酸,成功获得了相应的2个点突变基因。因此,重叠PCR技术是一种简单有效的进行体外基因重组和突变的方法,对于研究高等植物功能基因的结构功能特性具有重要的意义。 展开更多

关键词 水稻 铵转运蛋白 OsAMT1.2 点突变 重叠pcr

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米黑根毛霉脂肪酶基因密码子优化及重叠延伸PCR合成 被引量：1

6

作者 苗长林 罗文 +3 位作者 吕鹏梅 李惠文 杨玲梅 袁振宏 《安徽农业科学》 CAS 2013年第1期47-48,112,共3页

[目的]对米黑根毛霉脂肪酶基因的密码子进行优化,并采用重叠延伸PCR合成设计的基因序列。[方法]根据毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子使用偏好性,对米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因进行全面密码子优化,根据优化后的氨基酸编码序列设计合成30... [目的]对米黑根毛霉脂肪酶基因的密码子进行优化,并采用重叠延伸PCR合成设计的基因序列。[方法]根据毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子使用偏好性,对米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因进行全面密码子优化,根据优化后的氨基酸编码序列设计合成30条长度约为48 bp的寡核苷酸片段,并采用重叠延伸PCR法扩增合成全长基因序列。[结果]经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析表明,合成的目的基因与设计的序列相一致。[结论]该研究为脂肪酶基因在毕赤酵母中的构建及后续表达奠定了基础。 展开更多

关键词 米黑根毛霉脂肪酶 密码子优化 重叠延伸pcr 克隆

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重叠延伸PCR法扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因及生物信息学分析

7

作者 张毅 周淑艳 +2 位作者 陈锐 孙业红 李体远 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期173-178,共6页

利用重叠延伸PCR技术扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并进行了蛋白的诱导表达。通过序列测定和ORF软件分析,该融合基因含有1个1 005 bp的ORF,编码335个氨基酸。应用生物信息学方法,对该融合基... 利用重叠延伸PCR技术扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并进行了蛋白的诱导表达。通过序列测定和ORF软件分析,该融合基因含有1个1 005 bp的ORF,编码335个氨基酸。应用生物信息学方法,对该融合基因编码的蛋白ZtaN-p23从氨基酸组成、理化性质、信号肽、疏水性/亲水性、二级结构、亚细胞定位、功能域和高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明,该蛋白的预测分子量为46.2 kD,理论等电点约为8.97,是亲水性蛋白,推测它定位于细胞质中。序列分析表明,该蛋白可能具有信号转导、转录调控、免疫应答等功能。预测的二级结构及三级结构都表明该蛋白含有较多的不规则卷曲和α-螺旋,三级结构上呈对称形状。 展开更多

关键词 重叠延伸 pcr EB病毒 BZLF1N基因 BLRF2基因 生物信息学

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OE-PCR快速合成基因的探索研究

8

作者 董冰雪 韩雪梅 +4 位作者 薜淑萍 耿三春 刘伟 李运会 詹慧莹 《湖北农业科学》 北大核心 2013年第12期2929-2933,共5页

根据GenBank中基因序列,利用DNAworks3.1软件,选择合适的参数优化设计引物。通过一步简单的重叠延伸PCR(OE-PCR),然后使用最外端的引物进行PCR扩增得到完整的基因序列。结果表明,利用该方法不但成功地合成了几个具有毕赤酵母密码子偏好... 根据GenBank中基因序列,利用DNAworks3.1软件,选择合适的参数优化设计引物。通过一步简单的重叠延伸PCR(OE-PCR),然后使用最外端的引物进行PCR扩增得到完整的基因序列。结果表明,利用该方法不但成功地合成了几个具有毕赤酵母密码子偏好性的基因,而且一次向野生型Cip基因里引入了12个点突变,并可以低成本、低错误率甚至是正确无误地合成1.5 kb以内的任何已知基因。 展开更多

关键词 基因合成 DNAworks3 1软件 重叠延伸pcr(OE-pcr)

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一种改进后的重叠延伸PCR法对被孢霉重组载体的构建 被引量：2

9

作者 孟祥亮 王宁新 +3 位作者 牛丽华 李培光 李洋 黄大卫 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期62-67,共6页

为了提高DNA大片段的拼接效率,通过引入逐次退火的PCR的方法,改良了传统的重叠延伸PCR方法。逐次退火PCR法,一方面延长了重叠区的PCR引物长度;另一方面把原来在1个循环中1个退火温度改成若干个,逐次降低退火温度,适用于Tm值相差比较大... 为了提高DNA大片段的拼接效率,通过引入逐次退火的PCR的方法,改良了传统的重叠延伸PCR方法。逐次退火PCR法,一方面延长了重叠区的PCR引物长度;另一方面把原来在1个循环中1个退火温度改成若干个,逐次降低退火温度,适用于Tm值相差比较大的引物;相邻的退火温度之间相差3-6℃。结果显示,通过此种方法成功拼接了ω3(2)和HCT两个大片段;PCR产物电泳条带单一,克隆测序证实序列完全正确,可以直接应用于后续试验。这种改进后的方法可以有效减少非特异性扩增,提高灵敏度,把这种方法称之为逐次退火重叠延伸PCR。 展开更多

关键词 逐次退火 重叠区域pcr 突变 拼接

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重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化 被引量：3

10

作者 焦凤娟 刘俊杰 +1 位作者 卢思维 姜东君 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1109-1115,共7页

目的:基于重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法:根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_(n)和R_(n... 目的:基于重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法:根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_(n)和R_(n)进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E.coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果:第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸(TCT)成功突变为丙氨酸(GCT)。在0.5 mmol·L^(-1)IPTG、16℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。结论:利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。 展开更多

关键词 转录因子EB 重叠延伸pcr 定点突变 融合蛋白 丝氨酸 丙氨酸

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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：3

11

作者 王永飞 邓博文 +5 位作者 刘晓艳 哈尔勒哈·阿曼太 郭嘉栋 周正国 蔡江 李有文 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期689-699,共11页

[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu... [目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。 展开更多

关键词 绵羊肺炎支原体 重叠延伸pcr EF-Tu基因 多克隆抗体

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油茶FAD2基因全长cDNA的克隆和序列分析 被引量：39

12

作者 谭晓风 陈鸿鹏 +6 位作者 张党权 曾艳玲 李魏 蒋瑶 谢禄山 胡孝义 胡芳名 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第3期70-75,共6页

FAD2基因控制油酸转化为亚油酸,是油茶油脂合成代谢的关键酶基因。在构建的油茶EST文库基础上,采用5′RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶FAD2基因的全长cDNA克隆。该基因序列长1682bp,开放阅读框为1149bp,编码382个氨基酸,并且具有FAD2... FAD2基因控制油酸转化为亚油酸,是油茶油脂合成代谢的关键酶基因。在构建的油茶EST文库基础上,采用5′RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶FAD2基因的全长cDNA克隆。该基因序列长1682bp,开放阅读框为1149bp,编码382个氨基酸,并且具有FAD2特有的保守序列和相关特征。经过比对分析,发现油茶的FAD2基因与其他植物的FAD2基因具有较高的相似性。 展开更多

关键词 油茶 EST文库 FAD2基因 RACE 交错延伸pcr 基因克隆

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猪α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究 被引量：11

13

作者 闫若潜 吴志明 +3 位作者 张志凌 盛敏 刘光辉 赵明军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期248-255,共8页

为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleuk... 为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleukin-2,PoIL-2)成熟肽基因连接,构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因,并克隆入pGEM-T Easy载体,将PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体进行原核表达。通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中的PoIFN-α在不同细胞系上对不同病毒增殖活性的抑制作用;分别采用MTT法和PoIL-2 ELISA试验方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中PoIL-2的生物学活性。结果表明成功构建并克隆PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中得到高效表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白相对分子质量约36.7 ku,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在细胞上具有与单一rPoIFN-α蛋白相近的抑制病毒增殖活性,其中在PK-15细胞上抗VSV的活性单位为1.891×104I U.mL-1,在Marc-145细胞上抑制高致病性PRRSV增殖的活性单位为905 U.mL-1;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有与单一rPoIL-2蛋白对照相近的生物学活性,可明显促进CTLL-2细胞的增殖,并可与抗PoIL-2单抗发生特异性免疫反应。这表明rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白双重的生物学活性,为基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗等研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪Α干扰素 猪白细胞介素2 重叠延伸pcr 嵌合基因 融合表达 活性

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鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用 被引量：5

14

作者 徐重新 张霄 +6 位作者 张存政 刘媛 仲建锋 董飒 胡晓丹 林曼曼 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第1期210-217,共8页

构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸... 构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。 展开更多

关键词 噬菌体展示库 单链抗体 重叠延伸pcr 噬菌粒载体 BT毒素

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利用Red重组系统敲除大肠杆菌rnc基因构建dsRNA原核表达体系 被引量：6

15

作者 尹国华 刘楠 +3 位作者 孙兆楠 宋云枝 朱常香 温孚江 《山东农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第3期317-324,共8页

大肠杆菌的rnc基因编码产物为RNaseIII酶,RNaseIII酶能降解细菌中绝大多数dsRNA。利用来源于λ噬菌体的Red重组系统和重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR),敲除了大肠杆菌origami(DE3)菌株的rnc基因,获得... 大肠杆菌的rnc基因编码产物为RNaseIII酶,RNaseIII酶能降解细菌中绝大多数dsRNA。利用来源于λ噬菌体的Red重组系统和重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR),敲除了大肠杆菌origami(DE3)菌株的rnc基因,获得了RNaseIII缺失型菌株M-origami。利用电激法,将构建的TMV运动蛋白基因(movement protein gene,MP)的dsRNA表达载体LMP480导入M-origami菌株中,IPTG诱导表达的结果显示:构建的M-origami/LMP480原核表达系统能高效表达TMV运动蛋白基因的dsRNA。初步的抗病性鉴定显示,表达的dsRNA能够诱发烟草对TMV的抗性。 展开更多

关键词 RED重组系统 重叠延伸pcr RNaseIII缺失菌株 DSRNA 病毒抗性

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重叠区扩增法合成抗菌肽B基因 被引量：9

16

作者 桑春果 张开春 张军科 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2002年第1期65-67,共3页

人工设计并合成了抗菌肽 B基因的 4个寡聚核苷酸片段 ,通过重叠区扩增法 ,扩增出了相当于抗菌肽基因全长的寡聚核苷酸片段。经克隆测序 ,证明成功地实现了抗菌肽基因的人工合成、拼接和克隆。

关键词 重叠区扩增法 抗菌肽 基因合成 基因克隆

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重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用 被引量：4

17

作者 易平勇 余海 +2 位作者 马文学 孙文均 姜槐 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2003年第5期412-414,共3页

目的 :将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,形成融合基因。方法 :利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PLAP- 1C末端信号肽序列和 SEA基因序列。然后 ,将二段基因拼... 目的 :将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,形成融合基因。方法 :利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PLAP- 1C末端信号肽序列和 SEA基因序列。然后 ,将二段基因拼接并与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 :成功扩增出 h PLAP- 1C末端信号肽序列 131bp和 SEA基因序列 796 bp;经测序证实 ,二段基因序列成功拼接 (90 1bp)。结论 :重叠区扩增基因拼接法能将 SEA基因与 h PL AP- 1C末端信号肽序列拼接 ,形成融合基因。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌肠毒素A 碱性磷酸酶 重叠区扩增基因拼接法

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微小隐孢子虫三个基因主要抗原表位区的串联表达及其抗原性分析 被引量：4

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作者 秦培兰 李艳 +7 位作者 米荣升 呼高伟 黄燕 周鹏 张国恩 苏庆美 曹薇 陈兆国 《中国动物传染病学报》 CAS 2012年第3期36-43,共8页

应用多个抗原表位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的氨基酸序列进行T细胞表位预测及分析,从中选取了三个抗原表位富集的基因片段,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)将... 应用多个抗原表位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的氨基酸序列进行T细胞表位预测及分析,从中选取了三个抗原表位富集的基因片段,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)将该三个基因片段串联在一起,各基因片段之间以柔性氨基酸(GGGGS)碱基序列链接,得到的拼接片段命名为CpTm。将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pET-CpTm,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果成功地构建了CpTm串联基因并在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,质谱分析表明重组表达蛋白包含了上述三个抗原的氨基酸序列。Western blot分析显示该重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清及隐孢子虫鼠基因型CP15、P23、CP15/60基因重组表达蛋白免疫兔血清识别,制备的抗血清能被重组蛋白特异性识别,表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为多表位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 微小隐孢子虫 抗原表位 重叠延伸pcr 原核表达 抗原性

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抗转铁蛋白受体单链抗体原核表达载体的构建和表达 被引量：3

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作者 朱慧芬 杨道锋 +1 位作者 沈关心 周春 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期402-404,408,共4页

目的　构建抗转铁蛋白受体 (TfR)单链抗体原核表达载体 ,为进一步研究其效应奠定基础。方法　从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体 pGEM T VH和 pGEM T VL中扩增重链可变区 (VH)和轻链可变区 (VL)基因 ,用重叠延伸PCR的方... 目的　构建抗转铁蛋白受体 (TfR)单链抗体原核表达载体 ,为进一步研究其效应奠定基础。方法　从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体 pGEM T VH和 pGEM T VL中扩增重链可变区 (VH)和轻链可变区 (VL)基因 ,用重叠延伸PCR的方法 ,在VH和VL基因间引入连接短肽 (Linker) ,构建VH Linker VL的单链抗体 (singlechainFv ,scFv)基因。经NcoⅠ和NotⅠ酶切后亚克隆到原核分泌型表达载体pUC19/119上 ,转化和筛选后 ,阳性细菌经IPTG诱导表达。间接免疫荧光法 (IFA)及抗体封闭试验鉴定其抗体活性。结果　凝胶电泳可见重叠延伸PCR扩增产物约 70 0bp条带 ,SDS PAGE鉴定表达产物的分子量为 2 7kD左右 ,与scFv的理论值一致 ,IFA及抗体封闭试验证明表达产物有抗人TfR的活性。结论　本研究成功地构建并表达了抗人TfRscFv ,为抗人TfRscFv的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 抗转铁蛋白受体 单链抗体 原核表达 跨膜糖蛋白

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修饰GLP2分泌性表达载体的构建及促增殖活性测定的实验研究 被引量：3

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作者 谭虎 杨天德 +5 位作者 粟永萍 艾国平 黄岚 陶军 刘晓宏 楼淑芬 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第17期1650-1653,共4页

目的对胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptid-2,GLP-2)进行基因修饰,观察其促细胞增殖活性。方法通过RT-PCR方法获得含GLP2编码序列的高血糖素原cDNA片段;通过PCR重叠延伸技术得到GLP2信号肽及成熟肽的嵌合分子,并将编码GLP2成熟肽N-... 目的对胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptid-2,GLP-2)进行基因修饰,观察其促细胞增殖活性。方法通过RT-PCR方法获得含GLP2编码序列的高血糖素原cDNA片段;通过PCR重叠延伸技术得到GLP2信号肽及成熟肽的嵌合分子,并将编码GLP2成熟肽N-末端第二位丙氨酸的序列(GCT)突变为编码甘氨酸的序列(GGT);将其插入真核表达质粒pVITRO3,转染至肠上皮细胞(Caco-2),观察其对细胞增殖活性的影响。结果克隆的修饰GLP2基因与国外报道的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列完全一致,并成功拼接GLP2的信号肽及成熟肽;且加入pVITRO3-GLP2-Caco-2培养上清的细胞生长明显快于对照组。结论PCR重叠延伸技术适用于分泌性载体构建。构建的修饰GLP2表达系统所表达的蛋白具有促进肠上皮细胞增殖的作用。 展开更多

关键词 胰高血糖素样肽-2 基因克隆 pcr重叠延伸技术 肠上皮 细胞增殖

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