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巴西固氮螺菌Yu62的EGFP标记及其在小麦体内的定殖研究 被引量：5
1
作者 刘华伟 王庆贺 +3 位作者 张宏 王蕊 肖红利 郭蔼光 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期2367-2372,共6页
以质粒pEGFP-C1为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因全长序列,将其与原核表达载体pVK-100连接,构建成重组载体pVK-EGFP。利用电转化法将重组载体导入巴西固氮螺菌Yu62中,得到EGFP标记菌株。用EGFP标记菌接种小麦... 以质粒pEGFP-C1为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因全长序列,将其与原核表达载体pVK-100连接,构建成重组载体pVK-EGFP。利用电转化法将重组载体导入巴西固氮螺菌Yu62中,得到EGFP标记菌株。用EGFP标记菌接种小麦‘小偃107’种子,室内限菌条件下培养10 d后,用荧光显微镜观测标记菌在小麦体内的定殖规律并观察接菌植株的田间生长状况。结果显示,巴西固氮螺菌Yu62能定殖于小麦根毛区、茎组织的细胞间隙等部位,而且接菌小麦‘小偃107’植株在根系发育、株高、分蘖数等方面比对照有较明显的优势。研究表明,巴西固氮螺菌Yu62能够定殖于小麦根茎内,并具有促进植物生长的作用。 展开更多
关键词 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 巴西固氮螺菌YU62 小麦 定殖
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超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的实验研究 被引量：13
2
作者 许燕 周希瑗 +1 位作者 王志刚 李兴升 《中国医学影像技术》 CSCD 北大核心 2007年第2期188-190,共3页
目的探讨超声破坏微泡介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的效率及可行性,为实现外源基因高效、定向的转移目的奠定基础。方法将30只Long-evans大鼠分为6组,第1组仅以0.5W/cm2的超声波辐照大鼠眼球,第2组于尾静脉输入适当剂量的微泡造影剂,并... 目的探讨超声破坏微泡介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的效率及可行性,为实现外源基因高效、定向的转移目的奠定基础。方法将30只Long-evans大鼠分为6组,第1组仅以0.5W/cm2的超声波辐照大鼠眼球,第2组于尾静脉输入适当剂量的微泡造影剂,并立即以相同能量的超声波辐照大鼠眼球,第3组于尾静脉输入质粒,第4组于尾静脉输入质粒,并以超声辐照大鼠眼球,第5组于尾静脉输入质粒与微泡,第6组尾静脉输入质粒、微泡,并用超声辐照眼球。转染2周后,在激光共聚焦显微镜下观察EGFP表达情况。结果超声微泡介导的EGFP质粒对大鼠视网膜的转染效率,明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照,及适当浓度的微泡,对大鼠视网膜脉络膜无明显损伤。结论利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂,能够有效地提高EGFP质粒在大鼠视网膜的转染效率。 展开更多
关键词 超声 微泡造影剂 视网膜 基因治疗 增强型绿色荧光蛋白
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家蚕精子介导报告基因gfp和egfp转移技术的研究 被引量：4
3
作者 左正宏 吴春旭 +2 位作者 桂慕燕 陈元霖 洪满贤 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期580-584,共5页
探讨家蚕精子介导基因转移技术能否有效地将外源基因导入并整合到家蚕基因组中,使之稳定遗传.分别进行了含gfp报告基因的pG350载体和含egfp报告基因的pMD-Fib-IE-EGFP与pEGFP-N3载体的精子介导基因转移实验.结果表明,导入线性pG350载体,... 探讨家蚕精子介导基因转移技术能否有效地将外源基因导入并整合到家蚕基因组中,使之稳定遗传.分别进行了含gfp报告基因的pG350载体和含egfp报告基因的pMD-Fib-IE-EGFP与pEGFP-N3载体的精子介导基因转移实验.结果表明,导入线性pG350载体,在14个G0代实验蛾区的DNA样品中,有5个PCR检测为阳性,阳性率为35.7%;对G1代的PCR与Southern blot检测的结果证明,导入的gfp基因存在于G1代的家蚕基因组中.导入不同浓度或构型的pMD-Fib-IE-EGFP与pEGFP-N3载体时,对G0代的PCR检测结果表明,导入线性pMD-Fib-IE-EGFP组的PCR阳性率为61.2%,而导入环状质粒组的PCR阳性率为57.1%;导入环状pEGFP-N3组的PCR阳性率为46.2%;对部分PCR阳性蛾区进行Southern blot检测结果表明,导入的egfp基因整合在G0代家蚕基因组中.本研究的结果表明,家蚕精子介导基因转移能够将外源基因有效地导入、整合于家蚕基因组,并可遗传至G1代. 展开更多
关键词 精子介导基因转移 家蚕 绿色荧光蛋白
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结核杆菌Hsp65与EGFP融合基因的构建及DC疫苗的制备 被引量：8
4
作者 肖凌 魏雅稚 +1 位作者 夏飞 刘胜武 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期13-16,共4页
目的: 构建结核杆菌H37Rv株Hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGHsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提Hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP... 目的: 构建结核杆菌H37Rv株Hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGHsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提Hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP- C1中, 构建pEGHsp65融合基因。以其转染Hela细胞, 在共聚焦激光扫描荧光显微镜下观测不同时间荧光表达的强弱, 并用RT- PCR检测Hsp65mRNA的表达。以pEGHsp65融合基因转染小鼠骨髓细胞经GM- CSF和IL -4诱导分化的DC, 用MTT比色法检测DC疫苗刺激未致敏脾细胞的增殖。结果: 用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切鉴定证实, H37Rv株Hsp65DNA已插入重组表达载体pEG -FP- C1中。将融合基因转染入Hela细胞, 48h转染率最高;用RT- PCR在mRNA水平上可检测到Hsp65mRNA的表达。用MTT比色法检测表明, 融合基因转染的DC能激活并引起未致敏的脾细胞增殖。结论: 成功地构建pEGHsp65融合基因和以其制备的DC疫苗, 为进一步观察其治疗结核病的效应奠定了基础。 展开更多
关键词 结核杆菌 HSP65 增强型绿色荧光蛋白 树突状细胞
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含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的家蚕同源重组质粒载体的构建 被引量：3
5
作者 桂慕燕 叶向群 +1 位作者 吴春旭 熊秀芳 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期628-633,共6页
以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG35 0为出发质粒 ,插入增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体 pMD Fib IE EGFP ,通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中 ,通过脂质体介... 以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG35 0为出发质粒 ,插入增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体 pMD Fib IE EGFP ,通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中 ,通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光 ,表明该质粒能够在真核细胞中表达 。 展开更多
关键词 egfp 家蚕 同源重组质粒载体 增强型绿色荧光蛋白基因 转基因蚕 载体构建 基因表达
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重组腺病毒载体Ad5-hTRX-EGFP的构建及其表达 被引量：4
6
作者 扈江伟 王军 +5 位作者 徐曼 苏永锋 孔维霞 盛红霞 张斌 陈虎 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期744-748,共5页
本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础。设计含有NotⅠ和EcoRⅤ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-m... 本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础。设计含有NotⅠ和EcoRⅤ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP,利用Lipofectamine2000脂质体的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHG lox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包装扩增病毒,用氯化铯高速梯度离心、纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用流式细胞仪测定感染HEK293细胞的效率,Western blot方法验证细胞表达hTRX蛋白。结果显示,重组腺病毒质粒经PCR和NotⅠ、EcoRⅤ酶切鉴定,证实含有hTRX基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5.558×1010pfu/ml。病毒成功感染HEK293细胞,MOI=100时,感染效率达92.25%。经Western blot方法验证表明,感染后的HEK293细胞高表达hTRX蛋白。结论:应用细胞内同源重组方法成功构建了含hTRX基因的重组腺病毒载体,制备获得高滴度的病毒,能高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白,为后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人硫氧还蛋白 腺病毒载体 增强型绿色荧光蛋白
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抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26～28kDa单链抗体与EGFP的融合表达及靶向性研究 被引量：3
7
作者 何卓 汪世平 +6 位作者 周帅锋 秦永华 高冬梅 汪希雅 李林 余路新 徐绍锐 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期704-707,共4页
目的体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26-28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位，探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值。方法扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因．克隆至PET32a／SIEA26～28kDa-scFv质粒，构建PET... 目的体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26-28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位，探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值。方法扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因．克隆至PET32a／SIEA26～28kDa-scFv质粒，构建PET32a／EGFP-scFv质粒。转化至感受态E．coli BL21（DE3）中。并诱导表达单链抗体融合蛋白。分析单链抗体融合蛋白与SIEA26～28kDa的结合特异性。单链抗体融合蛋白与日本血吸虫成虫、虫卵切片孵育，荧光显微镜下观测GFP信号。确定特异性单链抗体的靶向性。结果重组质粒PET32a／EGFP-scFv构建成功．Trx-EGFP-scFv融合蛋白高效表达．与SIEA26-28kDa特异性结合。GFP信号主要集中在未成熟卵卵胚．雌虫卵巢、卵黄腺及与生殖系统邻近的肠腔组织。结论SIEA26-28kDa单链抗体与血吸虫未成熟卵胚胎及雌虫生殖系统具有较强的靶向性，具有潜在抗卵胚发育、抗雌虫生殖作用，为SIEA26-28kDa单链抗体在抗日本血吸虫病疫苗免疫靶向方面的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 日本血吸虫 未成熟卵可溶性抗原(SIEA) 单链抗体(scFv) 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 靶向性
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脂质体介导pIDO-EGFP转染原代培养软骨细胞的初步研究 被引量：3
8
作者 段小红 何贤辉 +5 位作者 崔鹏程 王晓燕 吴明明 史剑波 许庚 江逊 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1110-1112,1116,共4页
目的:检测脂质体介导pIDO-EGFP转染原代培养的C57小鼠关节软骨细胞的瞬时表达及转染效率,建立原代培养的小鼠关节软骨细胞转染方法。方法:大肠杆菌中扩增pIDO-EGFP质粒,在最优化条件下通过lipofectamine2000TM转染试剂将pIDO-EGFP质粒... 目的:检测脂质体介导pIDO-EGFP转染原代培养的C57小鼠关节软骨细胞的瞬时表达及转染效率,建立原代培养的小鼠关节软骨细胞转染方法。方法:大肠杆菌中扩增pIDO-EGFP质粒,在最优化条件下通过lipofectamine2000TM转染试剂将pIDO-EGFP质粒转入原代培养的小鼠关节软骨细胞,应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况,流式细胞术检测其转染效率。结果:质粒携带的增强型绿色荧光蛋白在转染后24h得到了明显表达,48h后流式细胞术检测其转染效率为36.43%,未影响软骨细胞贴壁过程。结论:经绿色荧光蛋白检测表明,脂质体成功地将IDO基因转染进入原代培养的软骨细胞。转染后的软骨细胞在体外仍能存活,在最优化的条件下能达到良好的瞬时转染效率,为组织工程化软骨细胞基因导入和基因修饰提供了思路。 展开更多
关键词 基因转染 软骨细胞 基因表达 吲哚胺2 3-双加氧酶 绿色荧光蛋白
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反转录病毒载体介导的EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中的表达 被引量：7
9
作者 刘朝晖 杨宇 +3 位作者 庄鹏辉 许杰华 马延兵 胡海涛 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期10-13,共4页
目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒载体,并且探讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞,计数NIH... 目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒载体,并且探讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞,计数NIH3T3荧光表达细胞的数量来确定病毒的浓度;使用RV载体感染SK-N-SH细胞,通过流式细胞学荧光检测明确RV在SK-N-SH细胞的感染效率。结果成功构建了基因转移载体RV/EGFP,确定重组病毒的浓度为8.3×106病毒颗粒/mL。在SK-N-SH细胞RV/EGFP稳定转染并有效表达。在SK-N-SH细胞EGFP的荧光表达显示RV的转移并且表达的效率达到30%以上。结论SK-N-SH细胞能被RV病毒载体有效感染,在转基因细胞株外源基因的表达长期稳定并且显示RV病毒载体具有良好的基因转移效率。 展开更多
关键词 SK—N—SH神经母细胞瘤细胞 增强型绿色荧光蛋白 反转录病毒载体
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ZNF580-EGFP融合蛋白的亚细胞定位研究 被引量：6
10
作者 张文成 孙慧燕 孟祥艳 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1590-1594,共5页
目的:构建增强型绿色荧光报告蛋白(EGFP)与人ZNF580融合蛋白的真核表达载体,转染MGC803细胞进行表达,研究ZNF580-EGFP融合蛋白在MGC803细胞的亚细胞定位。方法:利用PCR技术扩增ZNF580基因cDNA开放阅读框架全编码区、N端编码区、C端编码... 目的:构建增强型绿色荧光报告蛋白(EGFP)与人ZNF580融合蛋白的真核表达载体,转染MGC803细胞进行表达,研究ZNF580-EGFP融合蛋白在MGC803细胞的亚细胞定位。方法:利用PCR技术扩增ZNF580基因cDNA开放阅读框架全编码区、N端编码区、C端编码区,分别克隆到真核表达载体pEGFP-C1,BglⅡ及HindⅢ双酶切电泳筛选、鉴定并测序。荧光显微镜下观察ZNF580-EGFP在MGC803细胞中的表达及亚细胞定位。结果:酶切pEGFP-ZNF580(1-172)、pEGFP-ZNF580(1-93)、pEGFP-ZNF580(94-172),电泳分析插入片段长度分别为:526bp、289bp、247bp,经连接点两端进行测序证实连接正确。pEGFP-ZNF580(1-172)、pEGFP-ZNF580(94-172)表达的ZNF580-EGFP融合蛋白定位在MGC803细胞核。结论:成功构建真核表达载体并在MGC803细胞中得到表达,分析其核定位信号可能位于ZNF580蛋白的C端C2H2型锌指主构域94-172位氨基酸区间。 展开更多
关键词 ZNF580-egfp融合蛋白 真核表达载体 绿色荧光蛋白 亚细胞定位
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超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠骨骼肌 被引量：5
11
作者 劳翼 修建成 +7 位作者 黄劭 谢昌联 陈向辉 黄武锋 吴爵非 宾建平 查道刚 刘伊丽 《中国医学影像技术》 CSCD 北大核心 2008年第10期1515-1518,共4页
目的探讨增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP)在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的条件下表达的可行性。方法20只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为裸质粒组(P)、质粒+超声组(P+U)、质粒+微泡组(P+M)和质粒+超声+微泡组(P+U+M)共4组进行实... 目的探讨增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP)在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的条件下表达的可行性。方法20只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为裸质粒组(P)、质粒+超声组(P+U)、质粒+微泡组(P+M)和质粒+超声+微泡组(P+U+M)共4组进行实验。选择增强绿色荧光蛋白质粒与白蛋白微泡相混合,以超声介导白蛋白微泡破裂的方法对大鼠骨骼肌行基因转染,转染7 d后,荧光显微镜下观察质粒在大鼠脊斜肌组织中的表达情况。结果P、P+ M组大鼠脊斜肌组织中均未见增强型绿色荧光蛋白表达;P+U组可见少量微弱绿色荧光,荧光强度较P和P+M组明显增强(P<0.05),P+U+M组可见明显特异性增强型绿色荧光蛋白表达,荧光强度约为P、P+M组的10倍,P+U组的3倍(P<0.05);P+U+M组转染率为(42.72±10.07)%较之P+U组(13.62±6.17)%明显增高(P<0.05)。结论超声介导微泡造影剂破裂造成的脊斜肌组织毛细血管通透性的增加,是血管内基因成功跨越内膜屏障的主要途径之一。 展开更多
关键词 超声检查 介入性 造影剂 增强型绿色荧光蛋白 基因疗法
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野生型和突变型PS1-EGFP真核共表达载体的构建与鉴定 被引量：2
12
作者 方伯言 贾建平 +2 位作者 邵延坤 孙永馨 刘宪霜 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期631-635,共5页
为了构建人野生型和突变型PS1(早老素-1, presenilin-1)-EGPF共表达蛋白的真核表达重组质粒pcDNA3.1 /PS1-EG-FP,本研究应用下述方法:对野生型pcDNA3.1 /PS1(WT)质粒,采用一步法定点突变技术构建pcDNA3.1 /PS1(C407G)突变质粒;合成两对... 为了构建人野生型和突变型PS1(早老素-1, presenilin-1)-EGPF共表达蛋白的真核表达重组质粒pcDNA3.1 /PS1-EG-FP,本研究应用下述方法:对野生型pcDNA3.1 /PS1(WT)质粒,采用一步法定点突变技术构建pcDNA3.1 /PS1(C407G)突变质粒;合成两对引物,利用PCR技术从pEGFP-C1质粒合成EGFP cDNA片断,在EGFP转录起始密码子ATG之前导入一BamHⅠ酶切位点,利用与pcDNA3.1 /PS1质粒共存的另一EcoRⅠ酶切位点,将合成的EGFP片断通过BamHⅠ和EcoRⅠ两个位点分别克隆入野生型及突变型pcDNA3.1 /PS1质粒的多克隆位点中,从而构建了野生型和突变型PS1与增强绿色荧光蛋白共表达载体。经限制性内切酶双酶切鉴定及DNA测序证实此蛋白共表达载体构建成功。利用此重组质粒瞬时转染SH-SY5Y细胞,72 h后荧光显微镜(激发波长488 nm)观察细胞内有绿色荧光蛋白表达。本研究成功构建了人野生型和突变型PS1-EGFP的真核表达载体,为下一步建立细胞模型,研究突变型PS1的生物学功能以及PS1在AD发病机制中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 PSI(Presenilin-1) 增强绿色荧光蛋白 基因突变
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以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体的构建及鉴定 被引量：3
13
作者 石秦东 张蓬勃 +4 位作者 康前雁 陈新林 田玉梅 刘建新 刘勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1834-1837,共4页
目的构建以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体,并对其进行鉴定。方法以pEGFP-N1质粒为模板,PCR法扩增获得EGFP基因片段,并将其亚克隆入PGL3-promoter质粒骨架,得到以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒pEGFP-enhancer。人工合成不同拷贝... 目的构建以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体,并对其进行鉴定。方法以pEGFP-N1质粒为模板,PCR法扩增获得EGFP基因片段,并将其亚克隆入PGL3-promoter质粒骨架,得到以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒pEGFP-enhancer。人工合成不同拷贝的缺氧反应元件(HRE)增强子序列,插入到pEGFP-enhancer多克隆位点获得重组质粒pEGFP-HRE、pEGFP-5HR,以脂质体Lipofectamine 2000转染Hela细胞,常氧与缺氧处理后以荧光显微镜及流式细胞仪观察EGFP荧光表达。结果构建的不同拷贝HRE的增强子鉴定质粒pEGFP-HRE、pEGFP-5HRE转染Hela细胞后,常氧处理绿色荧光表达无差异,缺氧处理后随HRE拷贝数增加绿色荧光表达强度增加。结论成功构建了增强子表达质粒pEGFP-enhancer,通过EGFP的表达强度可以反应增强子活性。 展开更多
关键词 增强子 绿色荧光蛋白 载体 缺氧反应元件 HELA细胞
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EGFP标记的Lewis肺癌细胞构建裸鼠恶性胸腔积液模型 被引量：7
14
作者 马兴群 孙宇 +2 位作者 王守巨 杨志坚 宋勇 《中国肺癌杂志》 CAS 北大核心 2012年第6期317-323,共7页
背景与目的恶性胸腔积液是晚期肺癌预后差的因素之一。本研究拟用Lewis肺癌细胞构建裸鼠恶性胸腔积液模型,从而建立一个良好的动物实验研究平台。方法经胸膜腔接种表达增强型绿色荧光蛋白的Lewis肺癌细胞,建立裸鼠恶性胸腔积液模型。定... 背景与目的恶性胸腔积液是晚期肺癌预后差的因素之一。本研究拟用Lewis肺癌细胞构建裸鼠恶性胸腔积液模型,从而建立一个良好的动物实验研究平台。方法经胸膜腔接种表达增强型绿色荧光蛋白的Lewis肺癌细胞,建立裸鼠恶性胸腔积液模型。定期解剖小鼠,经小动物活体荧光成像系统观察肿瘤的生长。剩余小鼠定期行胸部CT检查,计算各时间点的成胸水率,并观察建模后裸鼠的生存期和肿瘤转移情况。所有小鼠在解剖时发现有胸水,抽取并计量,同一时间点内获得多份胸水标本,计算其平均体积。利用相关性检验分析胸水体积与肿瘤积分光密度之间的相关性。结果接种后第4天,荧光体视镜下可发现胸膜上有绿色荧光,成瘤率100%。随接种时间延长,肿瘤体积逐渐增加,肿瘤侵及纵隔和肺门淋巴结、对侧胸膜、心包,转移率分别为87%、73%和20%。第7天、第14天和第21天成胸水率分别为13%、46%和53%。小鼠平均生存时间为28.8天,所有胸水均为血性,胸水平均体积在第10天以后逐渐增加,第16天达到峰值(0.5mL)。胸水体积与积分光密度之间具有相关性(r=0.91,P<0.000,1)。结论本研究将表达增强型绿色荧光蛋白的肺癌细胞在显微镜下经胸膜腔接种成功建立肺癌恶性胸腔积液模型,有助于动态观察肿瘤细胞在胸腔内的生物学行为,该模型可应用于肺癌的基础研究及抗肿瘤药物开发。 展开更多
关键词 恶性胸腔积液 增强型绿色荧光蛋白 裸鼠模型 积分光密度
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PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞 被引量：5
15
作者 董晓 王家宁 +1 位作者 黄永章 郭凌郧 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期1114-1117,共4页
目的表达并纯化融合蛋白PEP-1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-pep-1-EGFP,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白PEP-1-EGFP并进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐... 目的表达并纯化融合蛋白PEP-1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-pep-1-EGFP,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白PEP-1-EGFP并进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-pep-1-EGFP,PEP-1-EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,纯化后的蛋白浓度为6.18mg/ml,蛋白产量为14.15mg/100ml菌液,SDS-PAGE和Westernblotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP-1-EGFP,细胞膜穿透实验证实PEP-1-EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 细胞穿透肽 增强型绿色荧光蛋白 原核表达 蛋白转导 人脐静脉内皮细胞
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慢病毒介导EGFP基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究 被引量：3
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作者 金玲 陈剑 +4 位作者 吴静 徐锦堂 周清 叶茹珊 张宏 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期685-689,共5页
背景研究发现人羊膜上皮细胞（AECs）具有干细胞的某些特性，已有学者用其进行眼表重建，其可能是角膜表层重建的一种新型种子细胞。目的探讨经慢病毒载体（pLenti6／V5一DEST）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰的人AECs作为组... 背景研究发现人羊膜上皮细胞（AECs）具有干细胞的某些特性，已有学者用其进行眼表重建，其可能是角膜表层重建的一种新型种子细胞。目的探讨经慢病毒载体（pLenti6／V5一DEST）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰的人AECs作为组织工程化角膜表层一种新的细胞来源的应用价值。方法利用慢病毒载体携带标记基因EGFP转染人AECs，荧光显微镜下观察转染基因的瞬时表达，倒置显微镜下观察转染细胞的生长形态，用流式细胞仪检测转染细胞中EGFP的阳性表达率，然后应用EGFP基因修饰的人AECs构建复层上皮细胞一角膜基质移植材料。手术切除兔眼的全部角膜缘组织制备角膜缘干细胞缺损动物模型，随机分为2组，实验组兔眼移植EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料，对照组兔眼移植无上皮细胞的角膜基质移植材料，每天裂隙灯下观察2组兔眼角膜的混浊、结膜上皮化和新生血管化情况。1个月后处死动物摘除眼球，荧光显微镜下观察角膜植片中EGFP的表达，用免疫组织化学法检测其细胞角蛋白8（CK8）、CKl8和CKl2的表达，以鉴定移植细胞分化为角膜样的上皮细胞。结果大多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞与正常体外培养的人AECs形态相似，流式细胞仪检测显示瞬时转染48h的人AECs中EGFP阳性表达率最高，为61．50％，与12、24、96h转染组15．24％、38．27％、39．10％比较差异均有统计学意义（P〈0．05），与72h转染组的58．36％比较差异无统计学意义（P〉0．05）。实验组10只兔眼中有6只眼角膜恢复透明，组织片在荧光显微镜下观察能发出绿色荧光，免疫组织化学结果显示CK8、CKl8、CKl2表达均为细胞质棕色染色，细胞核蓝染。对照组兔眼角膜均混浊、水肿，荧光显微镜下未见荧光，且部分角膜组织有CK8、CKl8表达，无CKl2表达。结论EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料能较好地重建角膜缘干细胞缺乏的兔眼角膜表层，可能是组织工程角膜表层一种新的细胞来源。慢病毒载体是一种安全有效的基因转移工具。 展开更多
关键词 慢病毒 增强型绿色荧光蛋白 基因转染 人羊膜上皮细胞 角膜移植
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EGFP标记的人肺癌裸鼠原位移植模型的建立 被引量：11
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作者 魏淑珍 孙宇 +1 位作者 杨志坚 宋勇 《中国肺癌杂志》 CAS 2010年第7期670-675,共6页
背景与目的小鼠活体分子成像模型可以连续实时监测活体肿瘤的变化。本研究拟通过外科原位移植法建立表达绿色荧光蛋白的肺癌裸鼠原位移植模型并探讨其肿瘤生物学特性,从而建立一个良好的肺癌动物实验研究平台。方法利用逆转录病毒转染... 背景与目的小鼠活体分子成像模型可以连续实时监测活体肿瘤的变化。本研究拟通过外科原位移植法建立表达绿色荧光蛋白的肺癌裸鼠原位移植模型并探讨其肿瘤生物学特性,从而建立一个良好的肺癌动物实验研究平台。方法利用逆转录病毒转染法将增强型绿色荧光蛋白基因导入人肺癌大细胞系NCI-H460,采用外科原位移植法建立肺癌原位移植模型。定期通过小动物活体荧光成像系统观察肿瘤生长,利用相关性检验分析荧光面积和肿瘤体积之间的相关关系,并观察原位移植术后裸鼠的生存期和肿瘤转移情况。结果模型建立后1周通过皮瓣在荧光体视镜下可观察到肺部肿瘤的绿色荧光,成瘤率为100%。荷瘤裸小鼠平均生存期为34.2天。解剖裸鼠观察到肿瘤侵及对侧肺、纵隔及肺门淋巴结、胸膜和膈肌,转移率分别为87.5%、75%、25%和12.5%。肿瘤体积和荧光面积具有相关性(r=0.873,P=0.001)。结论外科原位移植法建立的表达EGFP的裸鼠肺癌原位模型是肺癌临床前研究的理想的实验工具。应用小动物活体荧光成像系统能够定量客观评价肿瘤在动物体内的生长、侵袭和转移,该模型可应用于肺癌的基础研究和新药开发。 展开更多
关键词 肺肿瘤 增强型绿色荧光蛋白 外科原位移植 模型
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重组真核表达载体pEGFP-N1/PDGF-A的构建及真皮干细胞的转染 被引量：6
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作者 闫国和 粟永萍 +5 位作者 王军平 汪代杰 艾国平 王锋超 冉新泽 程天民 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第20期2005-2008,共4页
目的克隆血小板衍生生长因子A链(plateletderivedgrowthfactorAchain,PDGFA)基因,以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)载体pEGFPN1为骨架,携带PDGFA基因进入真皮间充质干细胞(dermisdrivedmesenchymalstemcells... 目的克隆血小板衍生生长因子A链(plateletderivedgrowthfactorAchain,PDGFA)基因,以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)载体pEGFPN1为骨架,携带PDGFA基因进入真皮间充质干细胞(dermisdrivedmesenchymalstemcells,DMSCs),为采用转入PDGFA基因的DMSCs修复创面奠定基础。方法采用RTPCR二步分离法,以人肝癌细胞系(SMC7721)的总RNA为模板,扩增PDGFA基因的全长cDNA编码序列,克隆入载体pMD18T,随后又将PDGFA基因亚克隆入pEGFPN1载体中,构建PDGFA基因的真核表达载体pEGFPN1/PDGFA,并采用Fugene6介导转染技术将PDGFA基因导入DMSCs。结果克隆到PDGFA基因的全长cDNA序列,经测序验证,其序列与GenBank所报告的该基因的序列完全一致。结论成功地将PDGFA基因克隆到pEGFPN1载体中,并实现了PDGFA基因在DMSCs的表达。 展开更多
关键词 克隆 真核表达载体 血小板衍生生长因子A链基因 绿色荧光蛋白 真皮间充质干细胞
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“睡美人”转座子系统介导EGFP转染鸡SSCs条件优化的研究 被引量：3
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作者 李碧春 陈强 +6 位作者 高波 田智泉 余飞 何先红 宋成义 常国斌 王克华 《中国家禽》 北大核心 2009年第1期10-14,共5页
利用"睡美人"转座子系统介导增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)报告基因,比较和优化了电穿孔转染条件和精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)对G418的耐受能力。结果表明,在SB与PT-EGFP的... 利用"睡美人"转座子系统介导增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)报告基因,比较和优化了电穿孔转染条件和精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)对G418的耐受能力。结果表明,在SB与PT-EGFP的比为1∶10,质粒浓度为15μg/mL,细胞处于对数生长期,且细胞密度为106～107/mL时,精原干细胞在电场强度为270V,脉冲时程为80μs,转染后在4℃静置10min的条件下转染效率最高。浓度为400μg/mL的G418对转染后的SSCs进行快速筛选6d时,出现了EGFP阳性克隆。 展开更多
关键词 转座子 电穿孔 精原干细胞 增强型绿色荧光蛋白
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TGF-β1、EGFP双基因修饰骨髓间充质干细胞的体外实验研究 被引量：2
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作者 曹颖光 王戎 +1 位作者 宋珂 王华均 《口腔医学研究》 CAS CSCD 2007年第1期28-31,共4页
目的:构建pTGF-β1-IRES2-EGFP双顺反子真核表达载体,检测其在骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达,为研究基因修饰细胞回植后的迁移转归及成骨作用提供实验基础。方法:构建p TGF-β1-IRES2-EGFP双顺反子真核表达载体,p TGF-β1-IRES2-EGFP... 目的:构建pTGF-β1-IRES2-EGFP双顺反子真核表达载体,检测其在骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达,为研究基因修饰细胞回植后的迁移转归及成骨作用提供实验基础。方法:构建p TGF-β1-IRES2-EGFP双顺反子真核表达载体,p TGF-β1-IRES2-EGFP与pIRES2-EGFP分别转染BMSCs,并设空白对照。荧光显微镜和细胞免疫组化分别检测GFP和TGF-β1的表达。结果:成功地构建含TGF-β1基因和EGFP基因的真核表达载体。G418筛选10-15 d后有抗性克隆形成。pTGF-β1-IRES2-EGFP转染组抗性克隆中,GFP表达的同时有TGF-β1的表达,而部分抗性克隆(约20%)中有TGF-β1表达的却无GFP表达。pIRES2-EGFP转染组的抗性克隆中有EGFP表达,但无TGF-β1表达。结论:利用IRES构建的含TGF-β1基因和GFP基因的双顺反子真核表达载体,能在部分BMSCs中同时获得表达,可以作为TGF-β1基因修饰BMSCs体内回植后追踪其成骨作用的方法。 展开更多
关键词 转化生长因子Β1 增强型绿色荧光蛋白 骨髓间充质干细胞
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