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嗜热裂解性多糖单加氧酶的异源表达及其应用
1
作者 谢乐 彭龙云 +3 位作者 胡芸 任洪艳 孙海彦 孙付保 《食品与生物技术学报》 北大核心 2025年第5期105-115,共11页
【目的】探究新型嗜热的裂解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)在以木质纤维素为底物的纤维素酶高效水解中的应用。【方法】以大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)为宿主,异源表达来源于堆肥宏基因组的嗜热LPMO(m... 【目的】探究新型嗜热的裂解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)在以木质纤维素为底物的纤维素酶高效水解中的应用。【方法】以大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)为宿主,异源表达来源于堆肥宏基因组的嗜热LPMO(mgLPMO10),通过优化表达载体信号肽以及诱导条件(温度、IPTG浓度、诱导时间)提高其表达量,并测定该酶的最适温度、最适pH、温度稳定性、pH稳定性及金属离子对其酶活力的影响;随后,评估mgLPMO10与2种嗜热内切葡聚糖酶(Tn CelB和Dt CelB)在不同摩尔比下,于70℃对磷酸溶胀纤维素(PASC)及其他纤维素底物的协同水解效率。【结果】表达载体中pelB信号肽编码序列显著提高mgLPMO10的表达量,以温度28℃、IPTG浓度0.50 mmol/L、诱导18 h的条件优化后,表达量达到12.9 mg/L,较优化前提高了90%。mgLPMO10的最适反应温度为70℃,最适pH为6.0,最高酶活力为25.5 U/g。加入5 mmol/L Mn^(2+)后,其酶活力提升75%。该酶与嗜热内切葡聚糖酶Tn CelB或Dt CelB协同水解磷酸溶胀纤维素时,协同度分别达到123%和138%,且对其他纤维素底物也有明显促进作用。【结论】mgLPMO10与嗜热内切葡聚糖酶联合作用可显著增强高温条件下的纤维素水解效率,为开发高温木质纤维素生物炼制工艺提供了重要的酶资源与理论依据。 展开更多
关键词 裂解性多糖单加氧酶 嗜热 水解 木质纤维素 内切葡聚糖酶
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杂色曲霉产葡聚糖内切酶条件优化及酶学性质初步研究
2
作者 付跃 陆桂雅 +3 位作者 黄玲胜 易群 梁彩荣 罗奉奉 《中国饲料》 北大核心 2025年第9期45-50,共6页
本研究采用单因素试验和正交试验对杂色曲霉产葡聚糖内切酶发酵条件进行优化,并对其酶学性质进行初步探究,旨在为木质纤维素类生物质在饲料领域中的应用提供数据支撑。优化后的发酵条件为:蔗渣与麸皮比例4:3,硫酸铵添加量2%,发酵温度28... 本研究采用单因素试验和正交试验对杂色曲霉产葡聚糖内切酶发酵条件进行优化,并对其酶学性质进行初步探究,旨在为木质纤维素类生物质在饲料领域中的应用提供数据支撑。优化后的发酵条件为:蔗渣与麸皮比例4:3,硫酸铵添加量2%,发酵温度28℃,发酵时间4 d,在此条件下葡聚糖内切酶酶活为37.92 U/mL,比优化前提高了1.64倍。酶学性质研究结果表明:杂色曲霉产葡聚糖内切酶的最适温度为55℃,在温度35~55℃内是稳定的。最适pH为4,在pH为4~6内是稳定的。Ca^(2+)、Ba^(2+)对葡聚糖内切酶酶活有促进作用,Co^(2+)和Mg^(2+)具有一定的抑制作用。 展开更多
关键词 杂色曲霉 葡聚糖内切酶 产酶条件优化 酶学性质
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厚垣镰孢霉固体发酵产葡聚糖内切酶的条件优化
3
作者 张健 《贵州农业科学》 CAS 2024年第9期74-79,共6页
【目的】优化厚垣镰孢霉固体发酵产葡聚糖内切酶的条件,为纤维素酶应用奠定基础。【方法】以厚垣镰孢霉HML278为研究对象,采用固体发酵方法分析其产葡聚糖内切酶的条件即发酵时间、发酵温度、接种量和培养基料液比对葡聚糖内切酶酶活力... 【目的】优化厚垣镰孢霉固体发酵产葡聚糖内切酶的条件,为纤维素酶应用奠定基础。【方法】以厚垣镰孢霉HML278为研究对象,采用固体发酵方法分析其产葡聚糖内切酶的条件即发酵时间、发酵温度、接种量和培养基料液比对葡聚糖内切酶酶活力的影响,通过正交试验筛选厚垣镰孢霉固态产酶的最优发酵条件。【结果】葡萄糖浓度线性回归方程:y=0.0465x+0.0177,R 2=0.999。单因素试验中,料液比为1︰2时酶活最高,为2.86 U/mL;孢子接种量为孢子悬液1.5 mL/100g物料时酶活最高,为3.29 U/mL;发酵温度为40℃时酶活最高,为3.67 U/mL;发酵时间为4 d时酶活最高,为3.67 U/mL。正交试验显示,最优发酵条件为培养基料液比1︰2、发酵温度40℃、发酵时间5 d,葡聚糖内切酶酶活为4.15 U/mL。【结论】优化的厚垣镰孢霉固体发酵条件产葡聚糖内切酶的酶活较高,降解纤维素效果佳。 展开更多
关键词 厚垣镰孢霉酶 固体发酵 条件优化 葡聚糖内切酶 培养基 酶活
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低温β-1,4-内切葡聚糖酶的基因挖掘、异源表达及其酶学性质表征
4
作者 圣弟青 钮成拓 +4 位作者 闫亚楠 郑飞云 刘春凤 王金晶 李崎 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期17-24,共8页
β-1,4-内切葡聚糖酶在洗涤行业有着广泛的应用价值,其中具有较好的低温和碱性耐受能力是其实现工业应用的重要前提。该论文通过基因挖掘获得一株具有低温耐受能力的Deinococcus cellulosilyticus来源新型β-1,4-内切葡聚糖酶基因EgDC,... β-1,4-内切葡聚糖酶在洗涤行业有着广泛的应用价值,其中具有较好的低温和碱性耐受能力是其实现工业应用的重要前提。该论文通过基因挖掘获得一株具有低温耐受能力的Deinococcus cellulosilyticus来源新型β-1,4-内切葡聚糖酶基因EgDC,并将其在大肠杆菌中实现了可溶性表达,其中大部分存在于周质空间,少部分分泌至胞外。对EgDC酶的酶学性质进行了表征,发现该酶的最适温度和最适pH值分别为40℃和pH 6.5,其在20℃能保持70%以上活力,且在pH 8.0和pH 9.0的半衰期分别达到83.43 min和53.79 min。EgDC酶具有较好的催化性质,其比酶活力k_(cat)/K_(m)值分别为(26.38±1.43)U/mg和(520.03±17.07)s^(-1)/mg,且对于金属离子以及表面活性剂均具有较强耐受能力。由此可见,新型β-1,4-内切葡聚糖酶EgDC具有较好的催化能力,且在低温、碱性以及存在表面活性剂环境下较为稳定,因此具有潜在的工业应用价值。 展开更多
关键词 基因挖掘 β-1 4-内切葡聚糖酶 异源表达 酶学性质 低温 耐碱性
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色氨酸残基在内切葡聚糖酶分子中的作用 被引量：22
5
作者 阎伯旭 曲音波 +1 位作者 高培基 孙迎庆 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第2期181-185,共5页
内切葡聚糖酶的化学修饰研究表明：色氨酸残基可能位于活性位点，与底物结合有关．荧光光谱测定指出该酶的荧光几乎都来自色氨酸残基，酶分子中色氨酸微环境对ｐＨ变化非常敏感，降低ｐＨ导致了酶分子构象发生了较大变化，配基结合使酶... 内切葡聚糖酶的化学修饰研究表明：色氨酸残基可能位于活性位点，与底物结合有关．荧光光谱测定指出该酶的荧光几乎都来自色氨酸残基，酶分子中色氨酸微环境对ｐＨ变化非常敏感，降低ｐＨ导致了酶分子构象发生了较大变化，配基结合使酶分子色氨酸微环境产生了改变，引发了与ｐＨ诱导不同的构象变化． 展开更多
关键词 纤维素酶 内切葡聚糖酶 色氨酸 荧光
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内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质研究 被引量：17
6
作者 陈惠 胥兵 +2 位作者 廖俊华 官兴颖 吴琦 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期649-654,共6页
通过PCR方法将已克隆的内切葡聚糖酶基因(GenBank No.DQ782954)信号肽编码序列去除,然后与表达载体pHIS1525连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-pHIS1525-G7并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌WH320原生质体,获得基因工程菌W... 通过PCR方法将已克隆的内切葡聚糖酶基因(GenBank No.DQ782954)信号肽编码序列去除,然后与表达载体pHIS1525连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-pHIS1525-G7并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌WH320原生质体,获得基因工程菌WH320-pHIS1525-G7。刚果红染色和SDS-PAGE分析表明该基因在巨大芽孢杆菌中得到了有效表达。基因工程菌经优化培养后,胞外上清液中的酶活力可达889U,是出发菌株(即枯草芽孢杆菌C-36)的11.22倍。酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度与pH值分别为65℃与pH6.0,在pH4.5～10.0范围内50℃保温30min可保持在最高酶活的80%以上。 展开更多
关键词 巨大芽孢杆菌 内切葡聚糖酶 基因表达 酶学性质
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高温纤维素降解菌的筛选及内切酶基因的克隆表达 被引量：8
7
作者 田伟 王磊 +3 位作者 李刚 汪贞 李妍 张纪兵 《农业环境科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期788-793,共6页
以滤纸条作为唯一碳源从以牛粪和砻糠为原料的堆肥样品中分离到了8株具有纤维素降解特性的微生物,其中菌株T1和T2在刚果红培养基上培养48 h后的水解圈明显大于其他菌株。对菌株T1和T2进行了生理生化和16S rRNA序列分析,克隆了菌株T2的... 以滤纸条作为唯一碳源从以牛粪和砻糠为原料的堆肥样品中分离到了8株具有纤维素降解特性的微生物,其中菌株T1和T2在刚果红培养基上培养48 h后的水解圈明显大于其他菌株。对菌株T1和T2进行了生理生化和16S rRNA序列分析,克隆了菌株T2的内切酶基因并对该基因进行了结构域分析,同时构建了表达载体p28-egB并将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。研究结果表明:(1)菌株T1和T2可分别鉴定为Bacillus cereus和Bacillus subtilis;(2)菌株T2的内切酶基因片段大小为1500 bp,编码499个氨基酸,结构域分析显示该酶由两个不连续的结构域组成,其一为N端催化结构域,由糖基水解酶家族5组成,其二为C端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成;(3)在E.coli BL21中成功表达了菌株T2的内切酶基因,SDS-PAGE电泳图谱显示该蛋白大小约为50 KD,浓度约为93.14 mg·L-1。 展开更多
关键词 纤维素降解菌 内切酶基因 克隆 表达 结构域
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灰绿曲霉产纤维素酶的研究 被引量：5
8
作者 陶毅明 马素娟 +3 位作者 邬小兵 龙敏南 黄建忠 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期391-395,共5页
灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）发酵液通过硫酸铵盐析、Sephadex G-100分子筛、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析,分离纯化一种外切葡聚糖酶（CBH）和一种内切葡聚糖酶（EG）.通过SDS-PAGE和... 灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）发酵液通过硫酸铵盐析、Sephadex G-100分子筛、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析,分离纯化一种外切葡聚糖酶（CBH）和一种内切葡聚糖酶（EG）.通过SDS-PAGE和凝胶柱层析法测定分子质量表明：CBH全酶分子质量为71 ku,由两个分子质量为35 ku的同型亚基组成;EG为单体蛋白,全酶分子质量为32 ku.酶学性质研究表明：CBH催化pNPC的最适pH为6.0,最适温度为55℃,酶活在pH 5.0~8.0区间和温度低于55℃时稳定;EG催化CMC-Na的最适pH为4.0,最适温度为50℃,酶活在pH3.5~7.5区间和温度低于65℃时稳定.Na＋、K＋、Ba2＋、Mg2＋以及NO3-和SO42-对CBH和EG酶活均无影响;Ca2＋和Mn2＋对CBH有激活作用,Fe2＋和Mn2＋对EG有激活作用,而Zn2＋、Cd2＋和Cu2＋对CBH和EG均有不同程度的抑制效应.酶动力学分析表明：CBH催化pNPC水解的米氏常数Km值为1.4 mmol/L（pH 6.0,55℃）,EG催化CMC-Na水解的米氏常数Km值为5.0 mg/mL（pH 4.0,50℃）. 展开更多
关键词 灰绿曲霉 纤维素酶 外切葡聚糖酶 内切葡聚糖酶 分离纯化 酶学性质
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里氏木霉产纤维素酶的诱导和合成机理研究进展 被引量：12
9
作者 李辉 王义强 +1 位作者 陈介南 张伟涛 《中国酿造》 CAS 北大核心 2011年第6期8-12,共5页
纤维素酶是一类诱导酶,诱导剂对纤维素酶的表达是必需的。常用的诱导剂如纤维素、槐糖、乳糖、纤维二糖、山梨糖等。里氏木霉主要表达3种纤维素酶:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1,4-葡萄糖苷酶,其中以外切葡聚糖苷酶Ⅰ的合成量最多,... 纤维素酶是一类诱导酶,诱导剂对纤维素酶的表达是必需的。常用的诱导剂如纤维素、槐糖、乳糖、纤维二糖、山梨糖等。里氏木霉主要表达3种纤维素酶:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1,4-葡萄糖苷酶,其中以外切葡聚糖苷酶Ⅰ的合成量最多,其次是内切葡聚糖苷酶和β-1,4-葡萄糖苷酶。纤维素酶的合成和表达是激活原件和抑制因子共同作用的结果:诱导物质和激活元件结合激活细胞内纤维素酶的合成和表达;当纤维素酶的分解产物达到一定水平时,细胞内的抑制因子和启动子结合,阻止纤维素酶的表达。 展开更多
关键词 里氏木霉 纤维素酶 内切葡聚糖苷酶 外切葡聚糖苷酶 β-1 4-葡萄糖苷酶
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黑曲霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特性分析 被引量：7
10
作者 董自星 李伟国 +2 位作者 佟新新 田康明 路福平 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期58-64,共7页
基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A... 基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A)、GS115(p PIC-en3g B)和GS115(p PIC-en3g C)。在摇瓶水平上,这株重组菌的酶活分别为1.3、8.5和10.1 U/m L。重组酶En3g A、En3g B和En3g C的最适作用温度分别为65、50和55°C;最适作用p H分别为5.0、5.0和3.5。此外,3种重组酶对羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na)和凝结多糖都具有典型的内切水解作用。这3个重组β-1,3(4)-葡聚糖酶具有良好的温度和p H稳定性,可为其在啤酒制造以及饲料加工过程中的应用奠定基础。 展开更多
关键词 内切β-1 3(4)-葡聚糖酶 黑曲霉 酶学特征
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易错PCR技术提高中性内切葡聚糖酶活性 被引量：6
11
作者 唐自钟 刘姗 +6 位作者 韩学易 姚友旭 刘默洋 陈惠 晋海军 吴琦 单志 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期754-761,共8页
近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）C-36的内切葡聚糖酶基因进行... 近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,构建了在大肠杆菌中的突变体库。通过刚果红平板筛选,获得了酶活性提高的突变株F-10,活力比亲本酶提高4.2倍。序列分析表明：F-10有5个碱基发生突变,两个氨基酸突变：D212V和T307S。SDSPAGE条带,表明基因表达正确,而表达量较原始菌株显著增加。酶学性质分析,表明该酶的最适反应pH为5.6,最适反应温度为45℃,在pH 4.5~10.0范围内50℃保温30 min可保持80%的剩余酶活,在60~75℃酶活力相对稳定,可保持在最高酶活的80%以上,当温度高于75℃时,酶开始变性失活,酶活力迅速下降。研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。 展开更多
关键词 枯草芽胞杆菌 内切葡聚糖酶 易错PCR 酶学性质
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匍枝根霉TP-02内切葡聚糖酶基因eg2的克隆表达及功能分析 被引量：8
12
作者 汤斌 张莹莹 杨亚平 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期13-17,共5页
从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到内切葡聚糖酶基因eg2,在大肠杆菌BL21中成功表达,通过对其结构功能进行初步分析,并对EGⅡ的纤维素结合模块CBM1及催化结构域GH45区进行突变研究。结构分析表明:N39S可影响CBM1亲水平面的形成,V136D... 从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到内切葡聚糖酶基因eg2,在大肠杆菌BL21中成功表达,通过对其结构功能进行初步分析,并对EGⅡ的纤维素结合模块CBM1及催化结构域GH45区进行突变研究。结构分析表明:N39S可影响CBM1亲水平面的形成,V136D及E260D对GH45活性中心的改变较大。突变株的发酵特性显示,N39S可缩短达到峰值的时间,V136D及E260D可显著提高酶活。其中,突变株EGⅡ-F在发酵21 h后,酶活达到最高为1.321 IU/mL,比突变前提高了82.7%。 展开更多
关键词 匍枝根霉 内切葡聚糖酶 突变 功能分析
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绿色木霉葡聚糖内切酶cDNA基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达 被引量：10
13
作者 王利英 刘一 +1 位作者 杨登峰 黄日波 《广西科学》 CAS 2007年第3期315-319,共5页
用L-山梨糖诱导绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711纤维素酶基因的转录,提取其总RNA反转录获得cDNA。PCR扩增葡聚糖内切酶(EG)和葡聚糖内切酶(EG)的cDNA基因,将其克隆到酵母载体中,构建产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。重组菌株能够识... 用L-山梨糖诱导绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711纤维素酶基因的转录,提取其总RNA反转录获得cDNA。PCR扩增葡聚糖内切酶(EG)和葡聚糖内切酶(EG)的cDNA基因,将其克隆到酵母载体中,构建产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。重组菌株能够识别EG和EG自身携带的信号肽而将表达产物分泌到胞外,故可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的重组转化子。重组菌株表达的EG酶活在诱导70h时达到最高(为0.08U/ml),表达的EG酶活在诱导60h时达到最高(为0.03U/ml)。 展开更多
关键词 绿色木霉 葡聚糖内切酶 酿酒酵母
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巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶编码基因的克隆及序列分析 被引量：3
14
作者 黄玉杰 杨合同 +4 位作者 丁爱云 李纪顺 周红姿 王萍 Maarten Ryder 《中国生物防治》 CSCD 北大核心 2004年第4期256-259,共4页
利用pBluescripts构建巨大芽孢杆菌基因组文库,在ABP平板上测定酶活性,共有78株阳性克隆子具有内切葡聚糖酶活性。将酶活性表达较好的一株菌株进行序列测定。测定结果这个片段共941bp,含有一个开放阅读框架,共348个核苷酸,可编码116个... 利用pBluescripts构建巨大芽孢杆菌基因组文库,在ABP平板上测定酶活性,共有78株阳性克隆子具有内切葡聚糖酶活性。将酶活性表达较好的一株菌株进行序列测定。测定结果这个片段共941bp,含有一个开放阅读框架,共348个核苷酸,可编码116个氨基酸。序列比较结果表明,该基因片段同已发表的枯草芽孢杆菌glyB aprE之间的同源性为35%;同芽孢杆菌BP23celB、短小芽孢杆菌内切葡聚糖酶和多粘芽孢杆菌β 1,4 内切葡聚糖酶的编码基因的同源性只有27%。虽然同源性较低,但酶活性表达较强,认为该基因是编码内切葡聚糖酶的一个新基因片段。 展开更多
关键词 巨大芽孢杆菌 内切葡聚糖酶 基因 克隆 序列分析
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β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达 被引量：7
15
作者 郭成栓 崔堂兵 郭勇 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第12期112-115,145,共5页
从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌菌株H9中,克隆到了编码葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)... 从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌菌株H9中,克隆到了编码葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中进行表达,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.实验结果表明:该基因大小为1980bp,共编码659个氨基酸,在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达;该酶的相对分子质量约为73000,由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,其二为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成,其在不同温度和pH值下的活力和稳定性与原始菌株的比较接近. 展开更多
关键词 葡聚糖内切酶 大肠杆菌 短小芽孢杆菌 基因 克隆 表达
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绿色木霉葡聚糖内切酶(EGⅠ)基因克隆及在酿酒酵母中的表达 被引量：3
16
作者 陈红漫 张欣 +2 位作者 李艳秋 阚国仕 任大明 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期48-52,共5页
以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为1 400 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中的E00390葡聚糖内切酶序列相比,氨基酸序列同源性达91%。将EGⅠ基因构建入表达载体pESC中,在GAL10启动子控制下,目... 以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为1 400 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中的E00390葡聚糖内切酶序列相比,氨基酸序列同源性达91%。将EGⅠ基因构建入表达载体pESC中,在GAL10启动子控制下,目的基因在酿酒酵母Fm135a中成功表达,所得葡聚糖内切酶经初步纯化后,SDS-PAGE检测为49 kD,比活力为2.45 U/mg。 展开更多
关键词 绿色木霉 纤维素酶 酿酒酵母 葡聚糖内切酶 克隆表达
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瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在酿酒酵母中的表达研究 被引量：6
17
作者 丁新丽 黄晶 汪天虹 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2004年第11期18-22,共5页
将PCR合成的瑞氏木霉 (Trichodermareesei) β 内切葡聚糖酶I(EGI)cDNA基因片断分别插入酵母met1 0和 pgk1启动子和终止子序列之间 ,构建了在不同启动子控制下 ,具有不同拷贝数的eg1表达分泌质粒pRS41 5ME、pRS41 5PE和 pRS42 5PE。通... 将PCR合成的瑞氏木霉 (Trichodermareesei) β 内切葡聚糖酶I(EGI)cDNA基因片断分别插入酵母met1 0和 pgk1启动子和终止子序列之间 ,构建了在不同启动子控制下 ,具有不同拷贝数的eg1表达分泌质粒pRS41 5ME、pRS41 5PE和 pRS42 5PE。通过电转化使重组质粒转移至实验室酿酒酵母H1 5 8菌株中 ,分别得到了 3株酵母转化子H1 p、H2p和H1m。在 3株酵母转化子中 ,重组 β 内切葡聚糖酶I都能在酶自身信号肽序列引导下进行分泌型表达。在YPD培养基中 3株重组酵母生长速率大致相同 ,H1m ,H1 p与H2 p的内切葡聚糖酶活力分别为 70 .4,1 2 6.7和 1 2 5 .0U/mL。 展开更多
关键词 分泌型表达 酶基因 葡聚糖 启动子 拷贝数 重组质粒 酿酒酵母 转化子 电转化 信号肽序列
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β-1,4-葡聚糖内切酶基因在大肠杆菌中分泌表达 被引量：4
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作者 李湘玉 刘秦华 +6 位作者 李君风 白晰 T. Desta 王思然 董志浩 白云峰 邵涛 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期309-315,共7页
采用重叠延伸PCR合成技术将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌蛋白基因序列usp45(81 bp)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-1,4-葡聚糖内切酶成熟蛋白序列egl3(657 bp)连接成融合基因usp45-egl3,构建了分泌型重组质粒pMG36e-usp45-egl... 采用重叠延伸PCR合成技术将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌蛋白基因序列usp45(81 bp)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-1,4-葡聚糖内切酶成熟蛋白序列egl3(657 bp)连接成融合基因usp45-egl3,构建了分泌型重组质粒pMG36e-usp45-egl3及重组大肠杆菌E.coli DH5α/pMG36e-usp45-egl3。分析重组大肠杆菌的表达效果及表达产物降解纤维素的能力。结果表明,重组大肠杆菌DH5α/pMG36e-usp45-egl3经14 h培养能分泌酶活为226 mU/mL的β-1,4-葡聚糖内切酶,并有效地降解了羧甲基纤维素钠。其中分泌的β-1,4-葡聚糖内切酶降解羧甲基纤维素钠生成还原糖的速率为2.35 mg/(h·mL)。 展开更多
关键词 瑞氏木霉 β—1 4-葡聚糖内切酶 大肠杆菌 分泌表达
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定点突变技术提高内切葡聚糖酶基因F-10酶活性 被引量：4
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作者 唐自钟 刘默洋 +4 位作者 李雨霏 孙蓉 刘姗 陈惠 韩学易 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期870-876,共7页
利用高酶活F-10突变株内切葡聚糖酶基因进行定点突变,对91位(K91E)和369位(K369R)氨基酸进行突变,构建突变质粒(K91E);(K369R)和(K91E/K369R),转化大肠杆菌BL21,经筛选获得突变内切葡聚糖酶基因工程菌株K91E,K369R和K91E/K369R。经IPTG... 利用高酶活F-10突变株内切葡聚糖酶基因进行定点突变,对91位(K91E)和369位(K369R)氨基酸进行突变,构建突变质粒(K91E);(K369R)和(K91E/K369R),转化大肠杆菌BL21,经筛选获得突变内切葡聚糖酶基因工程菌株K91E,K369R和K91E/K369R。经IPTG诱导后,分离纯化酶学性质分析。结果表明:蛋白质相对分子质量为53 000;突变前后最适pH值未发生变化,为pH 6.8;突变体K369R和K91E/K369R的最适温度为50℃,而突变体K91E最适温度发生了很大的变化,为40℃;酶的比活力分别为202、162.8、77.9 U/mg,分别是原始酶(66U/mg)的3.0倍,2.4倍和1.2倍;三个突变酶的热稳定性有较大提高,70℃处理1 h后,原始酶的活性急剧下降,剩余活力为12%,而K91E的剩余活力为36%,K369R剩余活力为30%,K91E/K369R剩余活力为41%。当经80℃处理1 h后,K91E残余活力仍有22%。本研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能及应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。 展开更多
关键词 内切葡聚糖酶 定点突变 分离纯化 热稳定性 酶学性质 结构分析
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极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的高效表达 被引量：4
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作者 李相前 邵蔚蓝 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期1-3,共3页
海栖热袍菌 Thermotoga maritima 是嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的极耐热葡聚糖酶具有很好的热稳定性和潜在的可观工业用途。但嗜高温菌基因在大肠杆菌中表达水平较低,T．m 内切葡聚糖酶 Cel12B 基因带有信号肽,应用在线预测分析,通过 ... 海栖热袍菌 Thermotoga maritima 是嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的极耐热葡聚糖酶具有很好的热稳定性和潜在的可观工业用途。但嗜高温菌基因在大肠杆菌中表达水平较低,T．m 内切葡聚糖酶 Cel12B 基因带有信号肽,应用在线预测分析,通过 PCR 方法分别克隆 Cel12B 完整基因和不带信号肽基因至 pET-20b 载体, 构建重组质粒 pET-20b-Cel12B 和 pET-20b-Cel12B-WS,转化至大肠杆菌 JM109DE3诱导表达后,分析酶活,结果表明去除信号肽重组菌单位酶活是未去除信号肽重组菌11倍多。 展开更多
关键词 内切葡聚糖酶 海栖热袍菌 信号肽 表达
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