H1和H3亚型猪流感病毒二重TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法的建立

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作者 王建华 陈小金 +8 位作者 张俊哲 王玉玲 肖妍 赵丹 谭旭菲 王乃福 陈本龙 董志珍 赵祥平 《中国动物检疫》 CAS 2016年第10期90-94,共5页

根据H1和H3亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖... 根据H1和H3亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（SFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）无交叉扩增反应;用该方法检测H1和H3亚型SIV的HA基因的RNA标准对照（SIV-H1-RNA,SIV-H3-RNA）,最适线性检测范围分别为3.7×10~1~3.7×10~8拷贝数/反应和3.4×10~0~3.4×10~8拷贝数/反应,最低检出限分别为38和34个拷贝数;该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示其具有良好的可重复性。用该方法对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪鼻拭子样本进行SIV检测发现,进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性,12份国内猪鼻拭子样本的H1亚型SIV检测结果为阳性,5份国内猪鼻拭子样本的H3亚型SIV检测结果为阳性。本方法的建立为H1和H3亚型SIV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多

关键词 猪流感病毒 H1亚型 H3亚型 taqman探针 荧光rt-pcr

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PEDV和TGEV双重TaqMan荧光定量一步法RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：13

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作者 侯月娥 伍建敏 李中圣 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2017年第1期19-25,共7页

本文通过对猪腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)基因组生物信息学分析,分别在两种病毒基因保守区设计特异性探针和Real-Time PCR引物,并建立了检测PEDV和... 本文通过对猪腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)基因组生物信息学分析,分别在两种病毒基因保守区设计特异性探针和Real-Time PCR引物,并建立了检测PEDV和TGEV的双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,本研究建立的方法对其他常见病毒无交叉检出,具有较强的特异性;应用本方法对PEDV和TGEV检测灵敏度均可达101个拷贝。应用本法组装PEDV和TGEV双重实时荧光定量PCR试剂盒,该试剂盒批次内、批次间的变异系数CV(coefficient of variation,CV)分别低于0.58%和3.7%。应用该试剂盒对97份病例进行检测,阳性率提高了14.93%。本研究建立的一步法荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高、定量且重复性和稳定性好等优点,在PEDV和TGEV感染的快速鉴别诊断,以及流行病学调查方面都有广阔的应用前景。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 双重taqman实时荧光定量rt-pcr

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尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量：4

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作者 王建华 赵祥平 +7 位作者 董志珍 肖妍 王玉玲 张俊哲 陈小金 王乃福 陈本龙 赵丹 《动物医学进展》 北大核心 2016年第1期11-16,共6页

根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果... 根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL^4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL^5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多

关键词 尼帕病毒 猪流感病毒 taqman-MGB探针 双重荧光定量rt-pcr

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H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：4

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作者 王博 王慧煜 +4 位作者 赵宝华 罗静 王承民 何宏轩 韩雪清 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第10期3035-3041,共7页

为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该... 为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法敏感性高,可检测到最低拷贝数为102拷贝/μL;重复性良好,重复孔Ct值的变异系数均在5%以下;特异性好,除H1和H3亚型SIV外,H4、H5、H7、H9亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒检测均为阴性;在田间样品中成功检出1株H1和1株H3亚型SIV,检出率为1.16%。该方法准确、快速、灵敏、特异,可为H1、H3亚型SIV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。 展开更多

关键词 H1和H3亚型猪流感病毒(SIV) 双重实时荧光定量rt-pcr taqman探针

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一种鉴别尼帕病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立 被引量：1

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作者 王建华 董志珍 +2 位作者 王玉玲 肖妍 赵祥平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第2期348-355,共8页

为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒（NiV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、... 为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒（NiV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因的RNA标准对照（NiV-M-RNA和HP-PRRSV-nsp2-RNA）,线性范围分别为4.6×101-4.6×107和4.1×101-4.1×108拷贝/μL;最低检出限分别为46和4.1拷贝;该方法组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示出良好的可重复性;该方法仅对NiV和HP-PRRSV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪流感病毒（SIV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV2）发生交叉反应。用该方法对236份猪实际样品进行NiV和HP-PRRSV核酸检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性。本研究建立的方法为猪实际样本中NiV和HP-PRRSV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多

关键词 尼帕病毒 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 taqman-MGB探针 二重荧光rt-pcr方法

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鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：3

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作者 孔刚锐 吴志明 +7 位作者 闫若潜 赵明军 王东方 赵雪丽 闫志玲 程俊贞 陈慧娟 靳利粉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第12期27-33,共7页

据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV)的非结构蛋白2(Nsp2)基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条... 据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV)的非结构蛋白2(Nsp2)基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条件,建立鉴别HP/LP-PRRSV二重TaqMan MGB实时荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescent quantitative RTPCR)检测方法;对该二重实时荧光定量RT-PCR方法进行了敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测,同时与建立的HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行了对比试验。结果显示,成功建立了鉴别HP/LPPRRSV的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法,HP/LP-PRRSV标准曲线的循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达101拷贝/μL;特异性高,对HP/LP-PRRSV阳性对照扩增呈阳性反应,而对5个对照病原均呈阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测,阳性检出率为92%,较普通二重RT-PCR方法阳性检出率高。 展开更多

关键词 高 低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重实时荧光定量RT—PCR taqman MGB荧光探针 检测 应用

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仙台病毒核酸快速检测方法的建立和应用 被引量：3

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作者 熊炜 林颖峥 +6 位作者 魏晓锋 郭雨燕 张强 刘俊平 李健 胡建华 黄忠荣 《中国动物传染病学报》 CAS 2014年第4期23-28,共6页

仙台病毒(Sendai virus,SeV)是一种常见的可引起啮齿类动物呼吸道疾病的病原,感染迅速,并且隐性感染率高,一旦感染较难从鼠群中清除,从而影响动物健康。为满足对入境噬齿类实验动物和野生动物仙台病毒快速检测的需要,本研究针对SeV编码... 仙台病毒(Sendai virus,SeV)是一种常见的可引起啮齿类动物呼吸道疾病的病原,感染迅速,并且隐性感染率高,一旦感染较难从鼠群中清除,从而影响动物健康。为满足对入境噬齿类实验动物和野生动物仙台病毒快速检测的需要,本研究针对SeV编码基质蛋白和融合糖蛋白基因的保守序列设计引物和荧光探针,建立了仙台病毒RT-PCR和Real-time RT-PCR检测方法。将建立的方法应用于仙台病毒感染鼠不同临床样品和组织培养物的检测,证实两种核酸检测方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,适合应用于出入境口岸实验和野生噬齿类动物仙台病毒疫情的快速检测。 展开更多

关键词 仙台病毒 real-time rt-pcr taqman探针

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猴嗜T淋巴细胞病毒l型核酸快速检测方法的建立 被引量：2

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作者 熊炜 蒋静 +5 位作者 张强 盘宝进 李健 魏晓锋 黄忠荣 胡建华 《中国动物检疫》 CAS 2013年第9期64-67,共4页

猴嗜T淋巴细胞病毒l型(Simian T-cell lymphotropic virus type 1,STLV-1)是无特定病原体(SPF)猴必须排除的病毒之一,其潜伏期较长,主要侵害猴的免疫系统。为强化口岸对进出境野生及实验用灵长类动物STLV-1感染情况的监测和流行病学调查... 猴嗜T淋巴细胞病毒l型(Simian T-cell lymphotropic virus type 1,STLV-1)是无特定病原体(SPF)猴必须排除的病毒之一,其潜伏期较长,主要侵害猴的免疫系统。为强化口岸对进出境野生及实验用灵长类动物STLV-1感染情况的监测和流行病学调查,本研究建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR检测STLV-1的方法,并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行了确认。 展开更多

关键词 猴 猴嗜T淋巴细胞病毒l型 rt-pcr real-time rt-pcr taqman探针

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淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒快速核酸检测方法 被引量：1

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作者 熊炜 林颖峥 +5 位作者 魏晓锋 王艳 张强 李健 胡建华 黄忠荣 《中国动物检疫》 CAS 2015年第4期75-78,共4页

为加强口岸对进境野生及实验用啮齿类动物中淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)筛查和流行病学调查,本研究建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR快速高通量检测LCMV的方法,证实两种核酸检测方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,适于快速检测L... 为加强口岸对进境野生及实验用啮齿类动物中淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)筛查和流行病学调查,本研究建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR快速高通量检测LCMV的方法,证实两种核酸检测方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,适于快速检测LCMV。 展开更多

关键词 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 rt-pcr real-time rt-pcr taqman探针

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新疆伊犁地区马的尼帕病毒感染情况研究

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作者 刘妍汐 谢鹏 +7 位作者 曾志磊 翟红 徐鸣明 张英英 余建萍 陈晓 彭丹 朱丹 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2008年第z1期27-29,共3页

目的:探讨尼帕病毒(Nipah virus,NiV)在新疆伊犁地区马群中的自然感染情况。方法:采用尼帕病毒一步法实时定量逆转录聚合酶链反应(One step real time reverse transcriptase polymerase chain reaction,Real-time RT-PCR)检测120匹马... 目的:探讨尼帕病毒(Nipah virus,NiV)在新疆伊犁地区马群中的自然感染情况。方法:采用尼帕病毒一步法实时定量逆转录聚合酶链反应(One step real time reverse transcriptase polymerase chain reaction,Real-time RT-PCR)检测120匹马外周血液单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中的NiVN基因片段,对阳性产物进行基因序列测定、同源性和氨基酸顺序分析。结果:所检测120匹马PBMCsNiVN基因片段阳性率为0%(0/120)。结论:本研究未发现新疆伊犁地区马中存在尼帕病毒自然感染。 展开更多

关键词 尼帕病毒 real-time rt-pcr 一步法 taqman探针

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定量检测马动脉炎病毒方法的建立

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作者 杨松 梁成珠 +1 位作者 高宏伟 陈溥言 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第9期115-118,共4页

为建立快速、敏感、准确的马动脉炎病毒检测方法,笔者选取病毒基因组中高度保守的ORF7序列设计引物和Taq-Man探针,分别使用马动脉炎病毒的总RNA和含有选定检测序列的克隆标准品进行一步法实时定量RT-PCR,绘制扩增曲线,两曲线斜率之差小... 为建立快速、敏感、准确的马动脉炎病毒检测方法,笔者选取病毒基因组中高度保守的ORF7序列设计引物和Taq-Man探针,分别使用马动脉炎病毒的总RNA和含有选定检测序列的克隆标准品进行一步法实时定量RT-PCR,绘制扩增曲线,两曲线斜率之差小于0.1,证明两者的扩增效率相同,可用选定检测序列的克隆标准品对马动脉炎病毒进行定量检测。 展开更多

关键词 定量检测 real-time taqman rt-pcr 马动脉炎病毒

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