葡萄脱落酸受体VvPYL4互作蛋白的筛选及互作蛋白基因表达

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作者 刘丽 王辉 +2 位作者 关天舒 李柏宏 于舒怡 《生物技术通报》 北大核心 2025年第4期188-197,共10页

【目的】ABA受体PYRl/PYLs/RCARs在ABA信号转导通路中起着重要作用。通过酵母双杂交技术筛选葡萄VvPYL4的互作蛋白,探究VvPYL4在葡萄应答霜霉病菌胁迫信号通路中的作用。【方法】以霜霉病菌侵染‘贝达’葡萄叶片为材料,构建cDNA文库;构... 【目的】ABA受体PYRl/PYLs/RCARs在ABA信号转导通路中起着重要作用。通过酵母双杂交技术筛选葡萄VvPYL4的互作蛋白,探究VvPYL4在葡萄应答霜霉病菌胁迫信号通路中的作用。【方法】以霜霉病菌侵染‘贝达’葡萄叶片为材料,构建cDNA文库;构建诱饵表达载体pGBKT7-VvPYL4,通过酵母双杂交技术从cDNA文库中筛选与VvPYL4相互作用的蛋白;通过实时荧光定量PCR分析候选互作蛋白基因在葡萄霜霉病菌诱导下的表达模式,并通过双分子荧光互补技术进行互作蛋白的验证。【结果】构建的酵母双杂交cDNA文库库容为7.16×107 CFU/mL,重组率100%,插入片段大小在1000 bp左右。成功构建诱饵表达载体pGBKT7-VvPYL4,且在酵母细胞中无自激活活性。诱饵载体与酵母双杂交文库共转酵母AH109菌株后,经多次筛库、测序、BLAST比对和回转验证,最终获得53个候选互作蛋白,这些蛋白涉及信号转导、植物生长发育及环境胁迫响应等多个方面。基于实时荧光定量PCR分析,编码4个蛋白的基因均受葡萄霜霉病菌诱导表达。通过双分子荧光互补试验发现,在共转pSPYCEPP2C24和pSPYNE-PYL4表达载体的本氏烟草叶片中可观察到强烈的黄色荧光信号,表明PYL4与PP2C24蛋白之间能够发生相互作用。【结论】成功构建霜霉病菌侵染葡萄叶片的cDNA文库,并筛选出53个与VvPYL4相互作用的候选蛋白,其中4个编码蛋白的基因均响应葡萄霜霉病菌的胁迫诱导,验证了VvPYL4与PP2C24蛋白之间存在相互作用关系。 展开更多

关键词 葡萄霜霉病 脱落酸受体PYL4 cDNA文库筛选 酵母双杂交系统 双分子荧光互补 互作蛋白 蛋白磷酸酶2C

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双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作 被引量：5

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作者 崔喜艳 张继晓 +3 位作者 窦瑶 孙小杰 尹悦佳 刘相国 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2013年第7期49-53,59,共6页

【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达... 【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生的黄色荧光信号。【结论】证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作。 展开更多

关键词 SSⅠ PPDK1 双分子荧光互补技术(bifc) 瞬时转化 蛋白质互作

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pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒的构建及其在活细胞内的相互作用 被引量：2

3

作者 郭术俊 赵保明 +2 位作者 唐洁 胡建国 吕合作 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期137-141,共5页

目的构建pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察Olig2与Id4的相互作用。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增Olig2和Id4基因,分别定向克隆到p... 目的构建pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察Olig2与Id4的相互作用。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增Olig2和Id4基因,分别定向克隆到pBiFC-VN173和pBiFC-VC155载体中,获得pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒。对此2种质粒进行酶切鉴定、测序;用脂质体方法共转染pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4质粒到人结肠癌细胞系SW-1116细胞中,在荧光显微镜下观察Olig2与Id4之间的相互作用。结果通过酶切鉴定和测序表明成功构建了pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒;该质粒能够有效地共同转染到靶细胞,Olig2和Id4在靶细胞中能够高效表达,并可以相互结合出现BiFC荧光信号,且该信号主要分布于胞质中。结论成功构建了用于BiFC技术的真核表达载体,并在活细胞内检测到Olig2和Id4分子的相互结合。 展开更多

关键词 OLIG2 DNA结合抑制因子4 重组质粒 转染 细胞定位 双分子荧光互补技术

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基于荧光蛋白的生物探针设计策略及其应用

4

作者 张宁 田烨 《遗传》 北大核心 2025年第7期711-728,共18页

荧光蛋白的发现为细胞生物学研究带来了革命性进展。通过将荧光蛋白与目标蛋白融合,构建荧光生物探针,可以在活细胞和生物体内实时监测细胞事件的动态变化。荧光蛋白的独特理化特性,如光谱范围、发色团成熟速度、pH敏感性和稳定性等,为... 荧光蛋白的发现为细胞生物学研究带来了革命性进展。通过将荧光蛋白与目标蛋白融合,构建荧光生物探针,可以在活细胞和生物体内实时监测细胞事件的动态变化。荧光蛋白的独特理化特性,如光谱范围、发色团成熟速度、pH敏感性和稳定性等,为探针的设计提供了多样化的选择。基于这些特性,研究者开发了用于监测不同分子事件的多种荧光生物探针。本文系统总结了荧光蛋白探针设计的主要策略及其在生物学研究中的典型应用,为开发更高效、更专用的新型荧光生物探针以应对复杂生物学问题提供了参考。 展开更多

关键词 荧光蛋白 荧光生物探针 荧光时钟 循环重排荧光蛋白 双分子荧光互补 二聚化依赖荧光蛋白 荧光共振能量转移 光激活 光转换 光开关

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ZmJAZ与ZmMYC2的BiFC互作研究 被引量：3

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作者 吕迪 陈茹梅 周晓今 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期77-85,共9页

JAZ(jasmonate ZIM-domain)蛋白是茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径中关键的负调控因子,明确JAZ蛋白和MYC2之间的结合关系对整个JA信号通路至关重要。通过qRT-PCR筛选了在籽粒中较特异表达的ZmJAZ4、生殖器官中高表达的ZmJAZ8以及组成... JAZ(jasmonate ZIM-domain)蛋白是茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径中关键的负调控因子,明确JAZ蛋白和MYC2之间的结合关系对整个JA信号通路至关重要。通过qRT-PCR筛选了在籽粒中较特异表达的ZmJAZ4、生殖器官中高表达的ZmJAZ8以及组成型表达的ZmJAZ12,利用玉米叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,通过亚细胞定位和双分子荧光互作(bimolecular fluorescence complementation)研究了这些JAZ蛋白的定位以及是否可以与ZmMYC2相互作用。研究结果发现ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12均定位于细胞核,同时BiFC结果显示这些JAZ蛋白都可与ZmMYC2在细胞核中相互作用,证实了ZmJAZ家族蛋白可与JA信号通路关键转录因子ZmMYC2结合的功能,提示它们可通过与ZmMYC2的结合影响其转录调控活性。 展开更多

关键词 茉莉酸 JAZ蛋白 MYC2转录因子 双分子荧光互作(bifc)

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双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米MAPK5与bZIP72蛋白的相互作用 被引量：2

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作者 曹建美 《安徽农业科学》 CAS 2016年第14期152-154,161,共4页

[目的]分析玉米MAPK5与b ZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体p N-MAPK5和p C-b ZIP72,应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与b ZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5... [目的]分析玉米MAPK5与b ZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体p N-MAPK5和p C-b ZIP72,应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与b ZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5与Zmb ZIP72的Bi FC融合载体同时轰击洋葱表皮细胞,细胞核中能发出黄色荧光。[结论]Zm MAPK5与Zmb ZIP72在植物细胞核内相互作用。 展开更多

关键词 ZmMAPK5 ZmbZIP72 双分子荧光互补(bifc) 蛋白互作 ZmMAPK5 ZmbZIP72 bimolecular fluorescence complementation (bifc)

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基于BiFC技术验证IMM-H004对CKLF1/CCR4结合的影响 被引量：3

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作者 彭也 张钊 +1 位作者 楚世峰 陈乃宏 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1030-1035,共6页

目的利用BiFC双分子荧光互补技术研究香豆素衍生物IMM-H004对趋化素样因子CKLF1与其受体CCR4结合的影响。方法引入BiFC技术,将CKLF1趋化活性肽段C27与CCR4分别与Venus荧光蛋白的N端(VN173)和C端(VC155)相连,C27与CCR4的结合可以Venus黄... 目的利用BiFC双分子荧光互补技术研究香豆素衍生物IMM-H004对趋化素样因子CKLF1与其受体CCR4结合的影响。方法引入BiFC技术,将CKLF1趋化活性肽段C27与CCR4分别与Venus荧光蛋白的N端(VN173)和C端(VC155)相连,C27与CCR4的结合可以Venus黄色荧光的形式体现,重组载体共转染HEK293细胞,进行氧糖剥夺/复氧损伤造模,并给予0.1、1和10μmol·L^-1 IMM-H004,观察活细胞中荧光强度。结果通过测序比对验证CKLF1/CCR4-BiFC系统构建成功,并能转染HEK293细胞正常启动,在该系统中,与Control组相比,OGD/R造模后黄色荧光强度明显增加(P<0.01),给予不同浓度IMM-H004后荧光表达均明显降低(P<0.01),差异具有统计学意义。结论通过BiFC技术,在活细胞状态下直观观察到IMM-H004在脑缺血损伤模型中具有明显的神经保护作用,可拮抗氧糖剥夺/复氧损伤造模状态下CKLF1/CCR4的结合。 展开更多

关键词 香豆素衍生物 趋化素样因子1 趋化因子受体4 双分子荧光互补技术 缺血性脑卒中 氧糖剥夺/复氧复糖

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木薯花叶病毒AC4蛋白与AtPARN互作研究 被引量：3

8

作者 刘琳玉 赵平娟 +3 位作者 符艳 刘志昕 任艳利 张秀春 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第1期197-204,共8页

木薯(Manihot esculenta Crantz)作为重要的热带作物,是全球六大粮食作物之一,并为全球近七亿人口提供主粮,然而病毒侵染引起的病害在全球范围内严重威胁木薯产业的发展。木薯花叶病毒病(cassava mosaic disease,CMD)是最有威胁的病害之... 木薯(Manihot esculenta Crantz)作为重要的热带作物,是全球六大粮食作物之一,并为全球近七亿人口提供主粮,然而病毒侵染引起的病害在全球范围内严重威胁木薯产业的发展。木薯花叶病毒病(cassava mosaic disease,CMD)是最有威胁的病害之一,造成严重的经济损失。斯里兰卡木薯花叶病毒(SriLankancassavamosaicvirus,SLCMV)是引发木薯花叶病的病原物之一,SLCMV是典型的双组分双生病毒,其基因组由DNA-A和DNA-B两个环状组分组成。无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)是真核细胞mRNA降解的主要途径之一,也是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。越来越多的研究显示,NMD不仅是真核生物重要的mRNA数量、质量调控机制,还与转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)同样能降解病毒RNA,是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。NMD的mRNA衰减过程包括PTC的识别、脱腺苷酸、脱帽和最后的核酸外切酶降解4个过程,UPF1、PARN、DCP2和XRN4分别是上述4个过程中的关键蛋白。病毒是专性寄生生物,必须逃避或耐受寄主细胞的降解,才能成功感染。聚腺苷酸特异性核糖核酸酶[poly(A)-specific ribonuclease,PARN]是NMD信号通路的一个关键因子。目前,关于SLCMV抵御寄主NMD的分子机制尚不明确。本研究采用酵母双杂交(yeast two-hybrid system)和荧光双分子互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验证明斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)编码的沉默抑制子AC4与拟南芥PARN相互作用。据此推测SLCMV AC4蛋白可能通过与AtPARN相互作用而抑制寄主NMD的病毒防御功能帮助病毒逃避或耐受寄主细胞的降解。研究结果为阐明木薯花叶病毒调控寄主NMD抗病毒防御功能的分子机理奠定基础。 展开更多

关键词 斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV) AC4蛋白 聚腺苷酸特异性核糖核酸酶(PARN) 酵母双杂交(Y2H) 荧光双分子互补(bifc)

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木薯MeHsfB3b转录因子与MeFKBP20蛋白互作关系验证

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作者 王超群 李琳琳 +3 位作者 陈银华 张肖飞 姚远 耿梦婷 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第3期450-458,共9页

热激转录因子MeHsfB3b是调控木薯抗细菌性枯萎病的重要节点,前期通过酵母双杂交技术获得MeHsfB3b的候选互作蛋白MeFKBP20,该蛋白属于FKBP型肽脯氨酰顺反异构酶基因家族。本研究克隆获得MeFKBP20基因全长为561 bp,编码186个氨基酸,蛋白... 热激转录因子MeHsfB3b是调控木薯抗细菌性枯萎病的重要节点,前期通过酵母双杂交技术获得MeHsfB3b的候选互作蛋白MeFKBP20,该蛋白属于FKBP型肽脯氨酰顺反异构酶基因家族。本研究克隆获得MeFKBP20基因全长为561 bp,编码186个氨基酸,蛋白质分子质量为19.99 kDa,具有FKPB_C结构域。表达模式分析发现:MeFKBP20基因在木薯成熟叶片及根部高表达,在幼叶和叶柄的表达量较低;并能够迅速响应病原菌XpmCHN11诱导,持续保持较高的表达丰度,推测其参与了木薯响应病原菌侵染的过程。利用酵母双杂交点对点、双分子荧光互补实验证明MeHsfB3b蛋白通过在201~241 aa区域与MeFKBP20蛋白作用。本研究结果有助于进一步解析MeHsfB3b基因调控木薯对细菌性枯萎病的抗病机理。 展开更多

关键词 热激转录因子 FKBP型肽脯氨酰顺反异构酶 酵母双杂交 双分子荧光互补

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小麦mRNA剪接因子TaSR与TaHis的互作鉴定及其基因表达分析

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作者 宋普文 邓佳乐 +5 位作者 杜玉新 陈家美 敬月婷 刘俊彤 李澳 胡海燕 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第3期166-172,共7页

为研究TaHis基因对小麦赤霉病的抗性机制,首先克隆了TaHis基因全长编码序列,构建了pGBKT7-TaHis诱饵载体,通过酵母双杂交技术对赤霉病诱导的小麦穗部酵母双杂交文库进行筛选,获得互作蛋白后利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术验证... 为研究TaHis基因对小麦赤霉病的抗性机制,首先克隆了TaHis基因全长编码序列,构建了pGBKT7-TaHis诱饵载体,通过酵母双杂交技术对赤霉病诱导的小麦穗部酵母双杂交文库进行筛选,获得互作蛋白后利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术验证蛋白质之间的互作,并利用RT-qPCR技术对抗感小麦材料中TaHis互作蛋白的赤霉病诱导表达模式进行分析。结果表明,成功构建了pGBKT7-TaHis诱饵载体,经过酵母双杂交文库筛选后,在四缺选择培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上获得了18个酵母单克隆。测序后Blast分析发现,共获得5个可能与TaHis互作的蛋白质,其中在6个酵母单克隆中均鉴定到富含丝氨酸/精氨酸的mRNA剪接因子SR45a类蛋白(TaSR)编码序列。以百农4299为材料,克隆了TaSR基因全长编码区,并构建了pGADT7-TaSR载体,酵母双杂交试验表明,pGADT7-TaSR和pGBKT7-TaHis共转化的酵母细胞在四缺培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA)上可以生长且显蓝色,表明TaSR和TaHis在酵母细胞中直接互作;构建了YC-TaHis、YN-TaSR载体,双分子荧光互补试验表明,共转化YC-TaHis和YN-TaSR的烟草细胞中产生强烈荧光信号,进一步验证了TaSR与TaHis的互作。RT-qPCR分析显示,TaSR在抗性材料百农4299中受赤霉病诱导后上调表达,在感病材料百农607中受赤霉病诱导后下调表达,表明TaSR基因表达量与小麦赤霉病抗性呈正相关。综上,小麦TaSR与TaHis存在相互作用,且TaSR基因表达量与小麦赤霉病抗性呈正相关。 展开更多

关键词 小麦赤霉病 TaHis TaSR 酵母双杂交 双分子荧光互补 RT-QPCR

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双分子荧光互补技术 被引量：15

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作者 樊晋宇 崔宗强 张先恩 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期767-774,共8页

双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术.该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相... 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术.该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新形成能具有活性的荧光蛋白.BiFC方法简单直观,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位相互作用蛋白质的位点.多色BiFC系统共用或与荧光共振能量转移(FRET)技术联用,还可以检测细胞内多个蛋白质的相互作用. 展开更多

关键词 双分子荧光互补(bifc) 蛋白质相互作用 检测 定位

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不结球白菜BrCDF1的克隆和蛋白亚细胞定位及其与BrFKF1蛋白的互作验证 被引量：4

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作者 吴小婷 邵帅旭 +4 位作者 李英 张昌伟 侯喜林 沈振国 刘同坤 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期812-819,共8页

[目的]本文旨在揭示CDF1基因在不结球白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)抽薹开花过程中的调控机制,验证其是否与FKF1蛋白发生互作。[方法]以‘苏州青’为材料,采用同源克隆方法获得BrCDF1基因全长序列,并与其他物种进行氨基酸序列比对;... [目的]本文旨在揭示CDF1基因在不结球白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)抽薹开花过程中的调控机制,验证其是否与FKF1蛋白发生互作。[方法]以‘苏州青’为材料,采用同源克隆方法获得BrCDF1基因全长序列,并与其他物种进行氨基酸序列比对;将BrCDF1与报告基因YFP融合构建亚细胞定位载体p Early Gate101-BrCDF1-YFP,采用农杆菌介导的方法将其瞬时表达于本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中;激光共聚焦显微镜观察,利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证不结球白菜BrCDF1和BrFKF1蛋白是否存在互作。[结果]BrCDF1基因含有876 bp开放阅读框,编码292个氨基酸。与甘蓝型油菜(Brassica napus)、野甘蓝(原变种)(Brassica oleracea var.oleracea)、萝卜(Raphanus sativus)的氨基酸序列比对结果显示:BrCDF1在进化过程中的保守程度分别为91.11%、88.25%、84.76%,保守性较高。BrCDF1蛋白定位于细胞核中,BrCDF1和BrFKF1之间存在相互作用。[结论]BrCDF1定位于细胞核,并且与BrFKF1互作,在进化过程中保守性较高,并可能参与了不结球白菜的光周期开花途径。 展开更多

关键词 不结球白菜 BrCDF1 亚细胞定位 酵母双杂交 双分子荧光互补

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水稻条纹病毒NS3蛋白与水稻3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)间的互作 被引量：3

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作者 肖冬来 贾东升 +4 位作者 吴建国 杜振国 谢荔岩 吴祖建 谢联辉 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期493-496,共4页

水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)NS3蛋白为病毒的沉默抑制子。利用酵母双杂交技术,从水稻cDNA文库中筛选出一个与RSV NS3蛋白互作的基因片段。推测该基因的功能是编码水稻3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge... 水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)NS3蛋白为病毒的沉默抑制子。利用酵母双杂交技术,从水稻cDNA文库中筛选出一个与RSV NS3蛋白互作的基因片段。推测该基因的功能是编码水稻3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)。双分子荧光互补实验进一步验证了NS3与GAPDH存在互作。瞬时表达实验表明,GAPDH与GFP基因融合蛋白在本氏烟表皮细胞细胞质中大量积累。此外,讨论了GAPDH蛋白在RSV侵染水稻过程中可能的功能。 展开更多

关键词 水稻条纹病毒 蛋白功能 互作 酵母双杂交 双分子荧光互补

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蛋白质相互作用实验技术的最新进展 被引量：7

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作者 王明强 武金霞 +3 位作者 张玉红 韩凝 边红武 朱睦元 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1274-1282,共9页

蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或(和)非生物胁迫的分子机制及其调控网络的重要途径。文章综述了近年来发展起来的研究蛋白质相互作用的常用实验性方法,如酵母双杂交系统、串联亲和纯化、免疫共沉淀、G... 蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或(和)非生物胁迫的分子机制及其调控网络的重要途径。文章综述了近年来发展起来的研究蛋白质相互作用的常用实验性方法,如酵母双杂交系统、串联亲和纯化、免疫共沉淀、GST Pull-down、双分子荧光互补、荧光共振能量转移、表面等离子共振分析,介绍了其原理、发展进程,并分析了其优缺点。 展开更多

关键词 蛋白质相互作用 酵母双杂交系统 串联亲和纯化 免疫共沉淀 GST Pull—down 双分子荧光互补 荧光共振能量转移 表面等离子共振分析

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玉米AGPasebt2与GPN1蛋白互作的双分子荧光互补技术研究 被引量：1

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作者 崔喜艳 赵吉元 +3 位作者 胡广宇 窦瑶 刘相国 韩四平 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2015年第6期99-104,共6页

【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-... 【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,并用2种载体共同瞬时侵染烟草叶肉细胞,48h后在激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2与GPN1的相互作用。【结果】AGPase-bt2基因长1 428bp,GPN1基因长1 497bp。双酶切鉴定结果表明,326-CYCHA-AGPasebt2、326-CYNEE-GPN1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;携带有共转化基因的烟草叶肉细胞在激光共聚焦显微镜下观察到明显的黄色荧光现象,且黄色荧光与叶绿体自发的红色荧光位置重合。【结论】AGPase-bt2与GPN1在植物细胞中真实地存在蛋白互作。 展开更多

关键词 AGPasebt2 GPN1 双分子荧光互补技术 蛋白质互作

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荧光双分子互补分析Ezrin与L-periaxin的互作模式 被引量：2

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作者 彭婷婷 王慧 石亚伟 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期38-46,共9页

腓骨肌萎缩症4F亚型是Periaxin基因的突变所导致一种脱髓鞘型遗传病.Periaxin蛋白是外周神经系统中特异且大量表达的蛋白,在髓鞘成熟与维护中发挥重要作用.而Ezrin是一种膜骨架连接蛋白,在细胞形态的维持、运动、黏附等方面发挥重要作用... 腓骨肌萎缩症4F亚型是Periaxin基因的突变所导致一种脱髓鞘型遗传病.Periaxin蛋白是外周神经系统中特异且大量表达的蛋白,在髓鞘成熟与维护中发挥重要作用.而Ezrin是一种膜骨架连接蛋白,在细胞形态的维持、运动、黏附等方面发挥重要作用.在前期已证实L-periaxin与Ezrin间存在蛋白互作的基础上,本文通过分子荧光互补实验,结合免疫荧光定位实验、免疫共沉淀等技术,进一步分析并揭示了L-periaxin蛋白与Ezrin蛋白之间的互作方式,具体为L-periaxin(1-200 aa)与Ezrin(1-296 aa)以及L-periaxin(1060-1461 aa)与Ezrin(475-585 aa)以"头对头"与"尾对尾"的方式发生相互作用.Ezrin可能是一种引导L-periaxin在施万细胞膜上堆积的新的分子配体,二者可能通过蛋白分子间更加紧密的方式完成在细胞膜处的堆积,参与到髓鞘的维护中. 展开更多

关键词 L-periaxin EZRIN “头对头”与“尾对尾” 蛋白相互作用 荧光双分子互补

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双分子荧光互补试验研究水稻NH1家族蛋白之间相互作用 被引量：1

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作者 白薇 孙海莲 +3 位作者 Mawsheng Chern Randy Ruan Pam Ronald 樊明寿 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第2期30-34,共5页

NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Sys-temic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 homo-logue 1)(NPR1的同源... NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Sys-temic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 homo-logue 1)(NPR1的同源物)可增强抗病性。水稻基因组中还有4个NPR1旁系同源物(Paralog),为NH1的家族蛋白。本试验利用双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC,or split YFP)研究了水稻NH1家族蛋白之间在活体内的相互作用,发现除NH2外,NH1、NH3、NH4和NH5都会和自身的蛋白互作,产生荧光信号,并且它们还会和家族成员的其他蛋白相互结合产生荧光信号。 展开更多

关键词 水稻 NH1家族蛋白 双分子荧光互补试验 蛋白互作

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利用SpyTag/SpyCatcher体系提高毕赤酵母重组蛋白生产能力 被引量：1

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作者 韩双艳 李静文 王媛媛 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第1期143-154,共12页

毕赤酵母是一种甲基营养型酵母,可以利用甲醇作为唯一的碳源和能源,是应用最为广泛的真核外源蛋白表达系统之一。毕赤酵母的甲醇利用率和同化效率较低,高浓度甲醇对细胞有毒性,其中间代谢产物甲醛、甲酸等毒性物质的积累会严重抑制细胞... 毕赤酵母是一种甲基营养型酵母,可以利用甲醇作为唯一的碳源和能源,是应用最为广泛的真核外源蛋白表达系统之一。毕赤酵母的甲醇利用率和同化效率较低,高浓度甲醇对细胞有毒性,其中间代谢产物甲醛、甲酸等毒性物质的积累会严重抑制细胞生长,限制目的蛋白的产量。本研究拟在毕赤酵母过氧化物酶体中,利用多酶组装技术在甲醇代谢关键酶之间构建底物通道,减少甲醛积累,增大同化途径通量,提高甲醇耐受性,提高毕赤酵母表达外源蛋白能力,获得高效利用甲醇的毕赤酵母人工细胞。研究首先采用双分子荧光互补(BiFC)分析技术验证了多酶组装技术—SpyTag/SpyCatcher体系在毕赤酵母中自组装的可行性,随后利用SpyTag和SpyCatcher成功实现了甲醇氧化酶(AOX)和二羟丙酮合酶(DAS)在胞内自组装形成双酶复合体;在此基础上,引入绿色荧光蛋白EGFP作为报告蛋白,考察表达自组装双酶复合体的重组毕赤酵母利用甲醇进行细胞生长和重组蛋白合成的能力。结果显示,在2%(体积分数)甲醇培养基中,相比原始菌株,表达双酶组装体系的重组菌株的生物量提高了2.3倍,单位D(600)细胞表达的EGFP荧光强度提高了4.51倍,是未组装菌株的2.76倍,EGFP产量约为1.52 mg/mL。 展开更多

关键词 毕赤酵母 甲醇代谢 双酶组装 SpyTag/SpyCatcher 双分子荧光互补

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毛果杨中与PtMKK4互作的PtMPKs的筛选及验证

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作者 王磊 宿红艳 +2 位作者 顾亮 常志远 陈娜 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第10期60-66,共7页

【目的】在外界刺激传递到胞内引起细胞响应的信号转导网络中,促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径处于中心环节。该途径由MAPKKK,MAPKK和MAPK 3种蛋白激酶组成,各组分之间以逐级磷酸化的方式构成信号放大途径,特异感受上游刺激,将信号... 【目的】在外界刺激传递到胞内引起细胞响应的信号转导网络中,促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径处于中心环节。该途径由MAPKKK,MAPKK和MAPK 3种蛋白激酶组成,各组分之间以逐级磷酸化的方式构成信号放大途径,特异感受上游刺激,将信号放大并向下传递给靶蛋白。迄今尚未在杨树中确定一条完整的MAPK信号通路。毛果杨MAPKK成员PtMKK4在干旱信号转导中发挥重要作用,筛选、鉴定其进一步激活的靶标MAPKs将为深入理解MAPK级联途径调控植物逆境响应机制提供重要信息。【方法】利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术筛选、鉴定与PtMKK4互作的MAPKs,并采用半定量PCR方法对筛选到的PtMPKs在干旱和高盐胁迫处理下表达水平的变化进行分析。【结果】分别构建pGBKT7-PtMKK4诱饵表达载体和pGADT7-Pt MPKs猎物表达载体,共转化酵母Y2H感受态细胞。仅共转化p GBKT7-Pt MKK4和pGADT7-PtMPK6-1的酵母菌可在营养缺陷型筛选培养基SD/-Ade/-Trp/-Leu/-His和SD/-Ade/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal中生长,且在SD/-Ade/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal中生长的菌落显示蓝色。双分子荧光互补试验进一步证实PtMKK4和PtMPK6-1存在蛋白互作。此外,与PtMKK4相似,PtMPK6-1可被20%PEG和200 mmol·L-1NaCl诱导表达。【结论】在毛果杨MAPK级联途径中,PtMPK6-1可能为PtMKK4激活的靶标。 展开更多

关键词 毛果杨 MAPK级联途径 酵母双杂交 双分子荧光互补

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玉米质体型AGPase小亚基和糖酵解关键酶PPDK1互作关系的研究

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作者 崔喜艳 王阔 +4 位作者 张继晓 鹿丹 范贝 尹悦佳 刘相国 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第7期47-52,60,共7页

【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转... 【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶肉细胞,激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2和PPDK1的相互作用。【结果】双酶切试验表明,326-CYCHA-AGPase-bt2、326-CYNEE-PPDK1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;浸染烟草叶片后,AGPase-bt2和PPDK1在叶肉细胞中高效表达,出现BiFC荧光信号。【结论】AGPase-bt2和PPDK1在植物细胞内存在真实互作关系。 展开更多

关键词 AGPase-bt2 PPDK1 双分子荧光互补技术 蛋白质互作

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