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ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定
1
作者
代鹏钰
杨蕊
+2 位作者
章婷婷
马昕芸
刘会玲
《中国肿瘤生物治疗杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第7期669-674,共6页
目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM...
目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。
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关键词
α-烯醇化酶
昆虫杆状病毒表达系统
蛋白表达
酶活性位点缺失
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职称材料
重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达
被引量：
1
2
作者
谢秋玲
刘兰
+3 位作者
刘秀贵
张玲
徐丽慧
洪岸
《昆虫学报》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第7期743-748,共6页
【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β(PDGFRβ)链膜外区与人IgGFc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFas...
【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β(PDGFRβ)链膜外区与人IgGFc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFastbac-sPDGFRβ/Fc,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,使目的基因与杆状病毒基因组DNA发生位点特异性重组,获得重组病毒DNA,将其通过脂质体转染昆虫细胞Sf9获得重组病毒。将该重组病毒感染Sf9无血清细胞系,在Sf9细胞中表达sPDGFRβ/Fc,对表达产物进行Western blotting检测和Protein A亲合层析纯化,并进一步通过MTT法检测获得的重组蛋白生物学活性。【结果】重组病毒感染Sf9细胞后,经Western blotting分析,能检测到一条分子量约为97kDa的特异性条带,与目的蛋白大小相符。通过ProteinA亲和层析,获得了纯度达75%以上,表达量为1μg/mL细胞培养上清的重组融合蛋白,MTT结果显示该重组融合蛋白sPDGFRβ/Fc具有抑制PDGF刺激的Balb/c3T3细胞增殖的能力。【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc可在昆虫细胞中成功地得到表达。
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关键词
血小板源性生长因子受体
杆状病毒表达载体系统
昆虫细胞
重组蛋白
MTT法
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职称材料
题名
ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定
1
作者
代鹏钰
杨蕊
章婷婷
马昕芸
刘会玲
机构
甘肃中医药大学第一临床医学院妇科二
甘肃中医药大学甘肃省人民医院妇科二
出处
《中国肿瘤生物治疗杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第7期669-674,共6页
基金
国家自然科学基金(No.82260557)。
文摘
目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。
关键词
α-烯醇化酶
昆虫杆状病毒表达系统
蛋白表达
酶活性位点缺失
Keywords
enolase 1(ENO1)
baculovirus expression vector system(BEVS)
protein expression
loss of enzyme activity sites
分类号
Q556 [生物学—生物化学]
R730.2 [医药卫生—肿瘤]
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职称材料
题名
重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达
被引量：
1
2
作者
谢秋玲
刘兰
刘秀贵
张玲
徐丽慧
洪岸
机构
暨南大学生物工程研究所
广东省生物工程药物重点实验室
出处
《昆虫学报》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第7期743-748,共6页
基金
广东省科技计划项目(2008B030301349)
文摘
【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β(PDGFRβ)链膜外区与人IgGFc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFastbac-sPDGFRβ/Fc,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,使目的基因与杆状病毒基因组DNA发生位点特异性重组,获得重组病毒DNA,将其通过脂质体转染昆虫细胞Sf9获得重组病毒。将该重组病毒感染Sf9无血清细胞系,在Sf9细胞中表达sPDGFRβ/Fc,对表达产物进行Western blotting检测和Protein A亲合层析纯化,并进一步通过MTT法检测获得的重组蛋白生物学活性。【结果】重组病毒感染Sf9细胞后,经Western blotting分析,能检测到一条分子量约为97kDa的特异性条带,与目的蛋白大小相符。通过ProteinA亲和层析,获得了纯度达75%以上,表达量为1μg/mL细胞培养上清的重组融合蛋白,MTT结果显示该重组融合蛋白sPDGFRβ/Fc具有抑制PDGF刺激的Balb/c3T3细胞增殖的能力。【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc可在昆虫细胞中成功地得到表达。
关键词
血小板源性生长因子受体
杆状病毒表达载体系统
昆虫细胞
重组蛋白
MTT法
Keywords
Platelet-derived growth factor receptor （PDGFR）
baculovirns expression vector system （BEVS）
insect cell
recombinant protein
MTT assay
分类号
Q965 [生物学—昆虫学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定
代鹏钰
杨蕊
章婷婷
马昕芸
刘会玲
《中国肿瘤生物治疗杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2024
0
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达
谢秋玲
刘兰
刘秀贵
张玲
徐丽慧
洪岸
《昆虫学报》
CAS
CSCD
北大核心
2009
1
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职称材料
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