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侵染甘薯的SPCSV、SPVG、SPFMV多重RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:15
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作者 李华伟 许泳清 +4 位作者 邱思鑫 刘中华 邱永祥 汤浩 余华 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1464-1470,共7页
为建立可同时检测甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)多重RT-PCR检测方法,本文根据SPCSV热激蛋白基因(hsp70)及SPVG、SPFMV外壳蛋白基因(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计特异性引物,通过引... 为建立可同时检测甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)多重RT-PCR检测方法,本文根据SPCSV热激蛋白基因(hsp70)及SPVG、SPFMV外壳蛋白基因(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计特异性引物,通过引物筛选,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能同时检测SPCSV、SPVG和SPFMV 3种病毒的多重RT-PCR检测方法。该体系能有效扩增出大小为304、433、601 bp 3个特异性片段。测序结果表明3种病毒与参考序列的一致性达94%-99%。应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏地同时检测单一或复合侵染3种甘薯病毒,为甘薯脱毒和病毒病诊断奠定基础。 展开更多
关键词 甘薯病毒 褪绿矮化病毒 G病毒 羽状斑驳病毒 多重RT-PCR 检测方法
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烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)的快速检测技术 被引量:2
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作者 张盼 宋国华 +5 位作者 乔奇 秦艳红 张德胜 田雨婷 郑文明 张振臣 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期84-87,104,共5页
建立了利用NCM-ELISA、RT-PCR和半巢式RT-PCR检测烟粉虱中SPCSV的方法,比较了3种检测方法的灵敏性。结果表明,NCM-ELISA最低能从16头带毒烟粉虱中检测出SPCSV;RT-PCR能稳定地从3头以上带毒烟粉虱中检测出SPCSV;半巢式RT-PCR能稳定地从... 建立了利用NCM-ELISA、RT-PCR和半巢式RT-PCR检测烟粉虱中SPCSV的方法,比较了3种检测方法的灵敏性。结果表明,NCM-ELISA最低能从16头带毒烟粉虱中检测出SPCSV;RT-PCR能稳定地从3头以上带毒烟粉虱中检测出SPCSV;半巢式RT-PCR能稳定地从单头烟粉虱中检测出SPCSV。检测灵敏性研究表明,用体外转录的RNA作为核酸模板,RT-PCR可检测的最低浓度为5.69×104拷贝/μL,半巢式RT-PCR为5.69×101拷贝/μL,说明半巢式RT-PCR检测方法的灵敏性比RT-PCR高1 000倍。 展开更多
关键词 甘薯褪绿矮化病毒 烟粉虱 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定 半巢式RT-PCR
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甘薯病毒病害(SPVD)的多重RT-PCR检测方法及其应用 被引量:21
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作者 张盼 兰新芝 +5 位作者 乔奇 张德胜 秦艳红 田雨婷 王爽 张振臣 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期86-90,100,共6页
根据甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了4对引物,以单一RT-PCR反应体系为基础... 根据甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了4对引物,以单一RT-PCR反应体系为基础,分别对影响多重RT-PCR扩增的退火温度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度等条件进行了优化,建立了能同时检测SPVD两种病原的多重RT-PCR方法。该方法能有效区分SPFMV的主要株系类型。灵敏性试验表明,建立的多重RT-PCR方法对SPFMV-CH2、SPFMV-CH和SPCSV的最低检测浓度分别为1.42×104、1.32×104拷贝/μL和2.47×104拷贝/μL。该方法可用于甘薯叶片和薯块中病毒的检测,为SPVD的监测预警提供了一个有用的工具。 展开更多
关键词 甘薯病毒病害 甘薯羽状斑驳病毒 甘薯褪绿矮化病毒 多重RT-PCR
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甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒复合侵染甘薯引起的细胞病理学研究 被引量:10
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作者 谢礼 吕明芳 +4 位作者 王芳 季志仙 吴列洪 严成其 陈剑平 《电子显微学报》 CAS CSCD 2013年第6期485-491,共7页
2011~2012年在浙江杭州连续发现感病甘薯植株具有甘薯病毒病SPVD的典型症状,透射电镜观察发现其叶片包含有长度为600~900 nm,直径为12 nm的线状病毒粒子。使用特异性引物进行RT-PCR扩增及测序,其病原为甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato ... 2011~2012年在浙江杭州连续发现感病甘薯植株具有甘薯病毒病SPVD的典型症状,透射电镜观察发现其叶片包含有长度为600~900 nm,直径为12 nm的线状病毒粒子。使用特异性引物进行RT-PCR扩增及测序,其病原为甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)复合侵染。运用透射电镜研究SPVD引起的细胞病理学变化,观察到叶肉细胞的细胞质中含有马铃薯Y病毒属特征性柱状内含体,其结构分类为Ⅳ型;线状病毒样粒子以束状平行排列成聚集体的方式存在于细胞质中;叶绿体伸出伪足状结构包裹线粒体。在维管束细胞的筛管和伴胞中观察到弯曲线状病毒样粒子形成的聚集体,其粒子排列交错,与叶肉细胞中平行排列的病毒样粒子聚集体不同,符合毛形病毒属特征。另外还在维管束和叶肉细胞结合的部位发现复合侵染的细胞病理学特征。本研究表明危害甘薯生产的SPVD已扩散蔓延到浙江省。 展开更多
关键词 甘薯病毒病(SPVD) 甘薯羽状斑驳病毒 甘薯褪绿矮化病毒 复合侵染 细胞病理学
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甘薯褪绿矮化病毒外壳蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 被引量:3
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作者 秦艳红 乔奇 +4 位作者 张德胜 田雨婷 王爽 王永江 张振臣 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2013年第6期85-87,120,共4页
克隆甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行诱导表达。根据已报道的甘薯褪绿矮化病毒西非(WA)株系基因组核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆了SPCSV四川分离物基因组RNA2上1 902bp大小的... 克隆甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行诱导表达。根据已报道的甘薯褪绿矮化病毒西非(WA)株系基因组核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆了SPCSV四川分离物基因组RNA2上1 902bp大小的片段。序列分析表明,该片段包括部分p60基因序列、完整的p8基因和CP基因(major CP)序列及部分mCP基因(minor CP)序列。CP基因由774个核苷酸组成,编码257个氨基酸残基,与已发表的SPCSV WA株系Can181-9分离物相比,其核苷酸和氨基酸序列一致性分别为99.48%和99.22%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为38kD,为SPCSV抗血清的制备及其血清学检测技术的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 甘薯褪绿矮化病毒 基因克隆 序列分析 外壳蛋白 原核表达
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甘薯褪绿矮化病毒RNase3蛋白的原核表达及抗血清制备
6
作者 秦艳红 乔奇 +4 位作者 王爽 张德胜 王永江 田雨婷 张振臣 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期138-141,共4页
以本实验室保存的重组质粒为模板,利用PCR方法扩增获得了甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的RNase3基因,RNase3基因由690个核苷酸组成,编码229个氨基酸。将RNase3基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对诱导产物进... 以本实验室保存的重组质粒为模板,利用PCR方法扩增获得了甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的RNase3基因,RNase3基因由690个核苷酸组成,编码229个氨基酸。将RNase3基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE分析。结果表明,RNase3在大肠杆菌中能高效表达,融合蛋白分子量约为26.5kD。以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPCSV-RNase3的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清对RNase3融合蛋白的效价达10万倍。 展开更多
关键词 甘薯褪绿矮化病毒 RNase3基因 原核表达 抗血清
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甘薯病毒病害(SPVD)的分子生物学研究进展 被引量:7
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作者 孙钟毓 龚莺 +2 位作者 赵琳 石江 毛碧增 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期71-77,共7页
甘薯病毒病害(SPVD)是最主要的甘薯病毒病害之一,研究表明甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)共同侵染形成SPVD。本文综述了SPFMV和SPCSV这2种病毒的生物学特性、检测方法、基因组结构与遗传变异等方面的研究进展,为阐... 甘薯病毒病害(SPVD)是最主要的甘薯病毒病害之一,研究表明甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)共同侵染形成SPVD。本文综述了SPFMV和SPCSV这2种病毒的生物学特性、检测方法、基因组结构与遗传变异等方面的研究进展,为阐明多种病毒混合侵染机制和防控措施提供了一定的理论依据。 展开更多
关键词 甘薯病毒病 甘薯羽状斑驳病毒 甘薯褪绿矮化病毒 沉默抑制蛋白 综合防控
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甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒检测方法的建立 被引量:1
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作者 陈涛 薛婷 +3 位作者 杨志坚 陈选阳 陈由强 陈建楠 《福建农业科技》 CAS 2023年第6期11-21,共11页
为了建立甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯矮化褪绿病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,提高检测灵敏度,实现结果的可视化。根据SPFMV外壳蛋白... 为了建立甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯矮化褪绿病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,提高检测灵敏度,实现结果的可视化。根据SPFMV外壳蛋白基因(CP)的核苷酸序列和SPCSV的热休克蛋白基因(Hsp 70)的核苷酸序列设计4条RT-LAMP特异性引物,采取单因素优化试验,对RT-LAMP反应体系中的多个因素包括时间、温度、BST聚合酶、Mg^(2+)、RNase抑制剂、dNTPs和Betaine浓度优化,恒温扩增60 min。经琼脂糖凝胶电泳分析,SYBR Green I可视化显色,结果表明:SPFMV的优化反应体系为:FIP/BIP 2μL、F3/B30.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO 41.5μL、RNase抑制剂1.0μL、Betaine 7μL,62℃60 min。SPCSV的优化反应体系为:FIP/BIP 2μL、F3/B30.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO 41.5μL、RNase抑制剂1.2μL、Betaine 7μL,64℃60 min。进一步利用SPFMV全基因组的4个片段(SPFMV-1、SPFMV-2、SPFMV-3、SPFMV-4)、SPCSV-Hsp 70和RGNNV进行特异性检验,分别建立了SPFMV和SPCSV的特异性RT-LAMP检测方法,扩增出了具有RT-LAMP的典型瀑布状条带,与凝胶电泳和SYBR Green I显色结果一致,SPFMV和SPCSV的灵敏度检测下限分别为:1×10^(-6)、1×10^(-3)ng·μL^(-1),该方法检测灵敏度高,实现了结果的可视化。对田间甘薯苗和离体组织培养甘薯苗进行检测验证,SPFMV-RT-LAMP检测方法成功率为100%,SPCSV-RT-LAMP检测方法的成功率为95%,表明研发的SPFMV和SPCSV的RT-LAMP检测方法适用于SPFMV和SPCSV的快速检测。 展开更多
关键词 甘薯 甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV) 甘薯矮化褪绿病毒(spcsv) 环介导等温扩增技术(RT-LAMP) 建立
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3种甘薯病毒多重PCR检测方法的建立与应用 被引量:3
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作者 李文宗 梁鑫 +2 位作者 杨露露 王润豪 王磊 《安徽农业科学》 CAS 2022年第22期89-93,126,共6页
针对甘薯卷叶病毒(SPLCV)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)的外壳蛋白(CP)基因序列,设计了3种病毒的3对特异性引物,扩增大小分别为180、295、774 bp,通过对引物添加量、退火温度、循环数等反应条件的优化,完善了能... 针对甘薯卷叶病毒(SPLCV)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)的外壳蛋白(CP)基因序列,设计了3种病毒的3对特异性引物,扩增大小分别为180、295、774 bp,通过对引物添加量、退火温度、循环数等反应条件的优化,完善了能同时扩增出SPLCV、SPFMV、SPCSV 3种病毒的多重PCR体系,可以实现同时对甘薯3种病毒104拷贝水平的检测,并具有良好的特异性。利用该技术体系,对不同田间样品进行了检测,PCR产物测序表明,3种病毒序列与已知的参考序列同源率一致性分别达到94%、94%、97%及以上。建立能够同时进行3种病毒检测的多重PCR检测技术体系,可以快速准确地进行甘薯脱毒苗病毒检测和田间样品的诊断。 展开更多
关键词 甘薯 甘薯卷叶病毒(SPLCV) 甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV) 甘薯褪绿矮化病毒(spcsv) 多重PCR
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甘薯4种RNA病毒多重RT-PCR检测方法的建立 被引量:6
10
作者 冯丽婷 张剑峰 迟胜起 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2022年第4期206-211,共6页
针对甘薯生产上发生为害严重的甘薯RNA病毒-甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC),建立了多重RT-PCR检测方法。首先根据GenBank中收录的这些病毒的外壳蛋白(CP)基因的保守序列,利用Prem... 针对甘薯生产上发生为害严重的甘薯RNA病毒-甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC),建立了多重RT-PCR检测方法。首先根据GenBank中收录的这些病毒的外壳蛋白(CP)基因的保守序列,利用Premier 5.0软件分别设计并合成了上述4种病毒的特异性引物;以4种病毒的下游特异性引物合成的cDNA为模板,在同一体系中同时加入上述4种甘薯病毒引物进行PCR扩增,初步建立这4种甘薯RNA病毒的最佳多重RT-PCR体系;通过对该多重RT-PCR体系的退火温度、延伸时间、dNTPs量、模板量、引物浓度等条件的优化,建立了能够同时检测这4种甘薯RNA病毒的最优四重RT-PCR检测体系,并对优化的多重RT-PCR体系进行了挑战测试和灵敏度测试。试验结果显示,优化的多重RT-PCR体系,各病毒引物之间不会出现交叉干扰,所扩增的4条目的条带清晰,能够明确区分上述4种甘薯病毒;挑战检测和灵敏度测试显示,此检测体系特异性强且灵敏度高。所建立的上述4种甘薯RNA病毒的多重RT-PCR检测方法能同时检测4种甘薯病毒,不仅准确灵敏,而且降低了检测成本,提高了病毒检测效率。 展开更多
关键词 甘薯 SPFMV spcsv SPVG SPVC 多重RT-PCR
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甘薯羽状斑驳病毒和褪绿矮化病毒重组双CP融合基因的原核表达和抗血清的制备
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作者 李恩广 郭宝太 +4 位作者 杨雪 朱虹 王晶珊 乔利仙 隋炯明 《青岛农业大学学报(自然科学版)》 2019年第4期275-279,共5页
由褪绿矮化病毒(SPCSV)和羽状斑驳病毒(SPFMV)协生共侵染引起病毒病(SPVD)是甘薯最严重的病害之一。为了建立一种高效的甘薯病毒病SPVD检测体系,本研究构建了SPCSV和SPFMV重组双CP基因的原核表达载体pET22b-SPVD-CP,该重组菌在20℃条件... 由褪绿矮化病毒(SPCSV)和羽状斑驳病毒(SPFMV)协生共侵染引起病毒病(SPVD)是甘薯最严重的病害之一。为了建立一种高效的甘薯病毒病SPVD检测体系,本研究构建了SPCSV和SPFMV重组双CP基因的原核表达载体pET22b-SPVD-CP,该重组菌在20℃条件下经IPTG诱导,获得了68 kDa的融合蛋白(重组双CP)。利用高纯度重组双CP为抗原免疫家兔,获得了SPVD的抗血清,间接ELISA检测显示抗体稀释度在1∶512 K的范围内,制备的抗体与抗原具有较强的结合活性。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备SPVD抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 甘薯羽状斑驳病毒 甘薯褪绿矮化病毒 重组双CP基因 原核表达 抗血清
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