为建立牛副流感病毒5型(BPIV5)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增BPIV5 L基因的保守片段,构建重组质粒p MD18-T-BPIV5,并经PCR、双酶切与测序鉴定正确后作为标准品,经各反应条件优化后初步建立检测BPIV5的qPCR...为建立牛副流感病毒5型(BPIV5)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增BPIV5 L基因的保守片段,构建重组质粒p MD18-T-BPIV5,并经PCR、双酶切与测序鉴定正确后作为标准品,经各反应条件优化后初步建立检测BPIV5的qPCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品作为模板,利用优化的qPCR扩增,建立该方法的标准曲线,结果显示,重组质粒标准品的拷贝数与其Ct值呈良好的线性关系,相关系数为0.998,扩增效率为1.09。以BPIV5、牛肠道病毒(BEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺如病毒(BNOV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛冠状病毒(BCOV)的cDNA作为模板,采用该qPCR扩增,评估该方法的特异性;以10倍倍比稀释的重组质粒标准品pMD18-T-BPIV5作为模板,利用本研究建立的qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3种不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的qPCR方法在同一时间和不同时间分别进行批内和批间重复性试验。结果显示,该方法仅能特异性扩增BPIV5,其他相关病毒均为阴性结果;对质粒标准品的检测限为6.43拷贝/μL;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法和已发表的qPCR方法分别检测采自内蒙古东部部分牛场的80份鼻拭子样品,结果显示,两种方法对样品的阳性检测率均为10%(8/80),阴性样品的检测率均为90%(72/80),二者的阳性符合率和总符合率均达100%。本研究建立的检测BPIV5的qPCR方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,可以用于临床样品的检测,为BPIV5的检测和流行病学调查提供了一种新的检测手段。展开更多
为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38....为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。展开更多
为建立一种针对寨卡病毒的快速诊断方法,本研究根据寨卡病毒的3’端保守基因序列,设计合成1对引物,建立了检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法。结果显示:所建立的检测方法的Ct值与标准品在1.41×10^1~1.41×10^10^ copies/μL具有...为建立一种针对寨卡病毒的快速诊断方法,本研究根据寨卡病毒的3’端保守基因序列,设计合成1对引物,建立了检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法。结果显示:所建立的检测方法的Ct值与标准品在1.41×10^1~1.41×10^10^ copies/μL具有良好的线性关系,相关性为1,斜率为-3.502;灵敏性结果显示,该方法的检测限度为1.41×10^1 copies/μL,是普通PCR的10000倍;特异性结果显示,对CHIKV、DENV和JEV无特异性扩增,特异性强;重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于1%,重复性好。本研究建立的SYBR Green I real-time PCR检测方法,可用于寨卡病毒感染的快速诊断。展开更多
生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PC...生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR快速检测技术。建立的方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,其中生乳沙门氏菌检出限为102cfu.mL-1,方法的检测线性范围为102～108cfu.mL-1,相关系数(R2)为0.999,扩增效率为103%;乳制品沙门氏菌经16 h增菌后检出限达到1 cfu.[25 g(mL)]-1。该技术可用于生乳中沙门氏菌的高效筛查及定量检测,检测一个样品仅需3 h;同时,可用于乳制品的准确定性检测,检测周期为1 d;且方法重复性好、准确度高、操作简单,为乳制品企业快速检测沙门氏菌提供了有效的技术手段。展开更多
【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采...【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。展开更多
为了建立转基因产品新型检测技术,采用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术和三对特异引物,检测抗虫转基因水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)。结果表明,利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到转Cry1Ab/c基因...为了建立转基因产品新型检测技术,采用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术和三对特异引物,检测抗虫转基因水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)。结果表明,利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到转Cry1Ab/c基因抗虫水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)扩增所产生的荧光信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体。SYBR Green Ⅰ实时PCR技术是转基因成分检测的一种新方法。展开更多
文摘为建立牛副流感病毒5型(BPIV5)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增BPIV5 L基因的保守片段,构建重组质粒p MD18-T-BPIV5,并经PCR、双酶切与测序鉴定正确后作为标准品,经各反应条件优化后初步建立检测BPIV5的qPCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品作为模板,利用优化的qPCR扩增,建立该方法的标准曲线,结果显示,重组质粒标准品的拷贝数与其Ct值呈良好的线性关系,相关系数为0.998,扩增效率为1.09。以BPIV5、牛肠道病毒(BEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺如病毒(BNOV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛冠状病毒(BCOV)的cDNA作为模板,采用该qPCR扩增,评估该方法的特异性;以10倍倍比稀释的重组质粒标准品pMD18-T-BPIV5作为模板,利用本研究建立的qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3种不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的qPCR方法在同一时间和不同时间分别进行批内和批间重复性试验。结果显示,该方法仅能特异性扩增BPIV5,其他相关病毒均为阴性结果;对质粒标准品的检测限为6.43拷贝/μL;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法和已发表的qPCR方法分别检测采自内蒙古东部部分牛场的80份鼻拭子样品,结果显示,两种方法对样品的阳性检测率均为10%(8/80),阴性样品的检测率均为90%(72/80),二者的阳性符合率和总符合率均达100%。本研究建立的检测BPIV5的qPCR方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,可以用于临床样品的检测,为BPIV5的检测和流行病学调查提供了一种新的检测手段。
文摘为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。
文摘为建立一种针对寨卡病毒的快速诊断方法,本研究根据寨卡病毒的3’端保守基因序列,设计合成1对引物,建立了检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法。结果显示:所建立的检测方法的Ct值与标准品在1.41×10^1~1.41×10^10^ copies/μL具有良好的线性关系,相关性为1,斜率为-3.502;灵敏性结果显示,该方法的检测限度为1.41×10^1 copies/μL,是普通PCR的10000倍;特异性结果显示,对CHIKV、DENV和JEV无特异性扩增,特异性强;重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于1%,重复性好。本研究建立的SYBR Green I real-time PCR检测方法,可用于寨卡病毒感染的快速诊断。
文摘【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。
文摘为了建立转基因产品新型检测技术,采用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术和三对特异引物,检测抗虫转基因水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)。结果表明,利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到转Cry1Ab/c基因抗虫水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)扩增所产生的荧光信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体。SYBR Green Ⅰ实时PCR技术是转基因成分检测的一种新方法。
