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基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法
1
作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第2期268-275,共8页
玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有... 玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有试剂集中在一个试管中进行反应,并通过侧向流动试纸条(LFD)检测反应结果。本研究筛选得到的最佳反应条件为,引物添加量2.8μL、FB报告分子浓度100 nmol/L、RT-RAA系统反应时间20 min、CRISPR/Cas12a系统反应时间20 min。本研究构建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法特异性强、灵敏度高,且所用试验材料方便携带和运输,适用于现场检测。 展开更多
关键词 玉米矮花叶病毒 反转录重组酶介导等温核酸扩增(rt-RAA)技术 CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条
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基于N基因的RT-LAMP技术检测PEDV、TGEV、PDCoV三种猪腹泻冠状病毒的研究
2
作者 邓可辉 陈志飞 +6 位作者 俞婷 王志林 王修武 郭智轩 李松倍 魏文康 贺东生 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期70-79,共10页
本研究成功建立了检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)3种猪冠状病毒的反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),为现场快速诊断提供技术支持。根据GenBank公布的PEDV、TGEV、PDCoV的N基因保守序... 本研究成功建立了检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)3种猪冠状病毒的反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),为现场快速诊断提供技术支持。根据GenBank公布的PEDV、TGEV、PDCoV的N基因保守序列作为靶序列设计了3套LAMP检测引物,并通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及临床样品检测,分别建立了3种快捷、敏感的猪冠状病毒RT-LAMP检测方法。结果显示:所建立的PEDV、TGEV、PDCoV 3种冠状病毒RT-LAMP检测方法的最佳反应温度分别为65℃、63℃、63℃,3种检测方法均可在45 min左右完成恒温扩增,扩增出特异性阶梯状条带,且不依赖于PCR仪等昂贵设备,仅需普通恒温装置即可反应。所建立的检测方法对PEDV、TGEV、PDCoV分别可以达到的检测下限为20、23、10拷贝/μL,敏感性较好;所建立的3种检测方法分别只检测出PEDV、TGEV、PDCoV,且与常见的猪源性病毒均无交叉反应,特异性好。用所建立的3种RT-LAMP检测方法对45份猪腹泻病料进行检测,PEDV、TGEV、PDCoV阳性率分别为33.33%(15/45)、22.22%(10/45)、13.33%(6/45),均比常规RT-PCR检测阳性率高。与常规RT-PCR相比较,本研究建立的方法操作简便快速、经济,且检测设备门槛低,更适用于基层临床检测。 展开更多
关键词 猪 冠状病毒 反转录环介导等温扩增 检测方法
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齿兰环斑病毒RT-RPA荧光实时检测体系的构建与应用
3
作者 吴洁秋 庄华才 +4 位作者 谭志勇 李早文 范俊强 傅海平 徐匆 《热带作物学报》 北大核心 2025年第7期1745-1753,共9页
齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是危害兰花的主要致病病毒之一,该病毒导致兰花叶片黄化、出现斑块,花朵畸形,对兰花的观赏性和商业价值影响极大。为实现ORSV的早期快速检测,本研究根据Gen Bank数据库中兰花齿兰环斑... 齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是危害兰花的主要致病病毒之一,该病毒导致兰花叶片黄化、出现斑块,花朵畸形,对兰花的观赏性和商业价值影响极大。为实现ORSV的早期快速检测,本研究根据Gen Bank数据库中兰花齿兰环斑病毒外壳蛋白cp基因的保守区域设计、筛选RT-RPA引物和探针,优化扩增条件,建立基于RPA的ORSV快速检测技术;对RT-RPA特异性和灵敏性进行测定,并通过开展田间样品检测试验,以验证该检测技术在生产上的应用可行性。结果表明:RT-RPA的最佳扩增引物组合为F1/R1,荧光探针为P1,最佳扩增温度为41℃,扩增时间为20 min;特异性良好,对建兰花叶病毒、黄瓜花叶病毒无交叉反应;灵敏度较高,ORSV核酸最低检测浓度达到2.8×10^(–5 )ng/μL。田间样品检测中,采用齿兰环斑病毒为阳性对照,dd H_(2)O为阴性对照,20份蝴蝶兰样本均检出ORSV,与Taq Man探针RT-q PCR (real time quantitative PCR)检测结果一致。本研究建立的ORSV RT-RPA荧光实时检测技术,具有快速、灵敏、准确和简便的优点,且适用于田间样品检测,为兰花病害预防、切断感染源和控制ORSV的传播提供有效方法,有助于兰花产业的健康发展。 展开更多
关键词 兰花 齿兰环斑病毒 反转录-重组酶聚合酶扩增(rt-RPA) 检测
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基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立 被引量：4
4
作者 于晶雪 韦珊珊 +9 位作者 覃绍敏 吴健敏 杨丽华 陈凤莲 许力士 秦树英 华俊 韦珏 方芳 刘金凤 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3237-3246,共10页
[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]... [目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(rt-RAA) CRISPR/Cas12系统
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H1亚型禽流感病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的建立及应用 被引量：2
5
作者 曾婷婷 李孟 +9 位作者 谢芝勋 李丹 谢丽基 罗思思 张民秀 王盛 谢志勤 范晴 阮志华 粟永春 《江西农业学报》 CAS 2024年第3期61-66,共6页
以H1亚型AIV的HA基因为研究对象,采用重组聚合酶核酸等温扩增技术(RPA),通过RT-PCR方法优选出1套引物,进而优化体系的反应温度、最佳探针及引物浓度,使用优化后的最佳反应体系进行敏感性及特异性试验,并探索该方法能达到的最短反应时间... 以H1亚型AIV的HA基因为研究对象,采用重组聚合酶核酸等温扩增技术(RPA),通过RT-PCR方法优选出1套引物,进而优化体系的反应温度、最佳探针及引物浓度,使用优化后的最佳反应体系进行敏感性及特异性试验,并探索该方法能达到的最短反应时间,利用侧向流动免疫(LFD)试纸条观测反应后的结果,最终建立检测H1亚型AIV的RT-RPA-LFD快速检测方法。结果表明:建立的RT-RPA-LFD快速检测方法在探针工作浓度为0.14 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10^(2)copies/反应的H1亚型AIV RNA,其他常见家禽病原体未见阳性反应。该方法与RT-PCR及鸡胚分离鉴定测序结果完全一致,可满足H1亚型AIV临床快速鉴别诊断的需求,为基层兽医现场快速检测提供技术支撑。 展开更多
关键词 H1亚型AIV 等温扩增技术 快速检测 rt-RPA-LFD
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牛病毒性腹泻病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和临床应用
6
作者 袁野 董雅琴 +9 位作者 张慧 刘爽 崔进 尼博 魏荣 顾丛丛 段纲 张锋 李晓成 代飞燕 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期139-145,共7页
为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展... 为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示:所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 荧光rt-PCR 诊断 流行病学调查
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逆向蒸发-超声微波协同制备原花青素纳米脂质体及其稳定性与抗氧化活性分析
7
作者 任红涛 周宁 +5 位作者 余秋颖 袁冲 胡珂欣 李军伟 陈琳琳 王娜 《食品工业科技》 北大核心 2025年第16期235-248,共14页
为提高原花青素的稳定性和抗氧化活性,以大豆卵磷脂和胆固醇为原料,利用逆向蒸发-超声微波协同技术制备原花青素纳米脂质体。通过单因素实验考察原花青素浓度、卵磷脂与胆固醇质量比(脂胆比)、旋蒸温度、超声功率、微波功率、微波时间... 为提高原花青素的稳定性和抗氧化活性,以大豆卵磷脂和胆固醇为原料,利用逆向蒸发-超声微波协同技术制备原花青素纳米脂质体。通过单因素实验考察原花青素浓度、卵磷脂与胆固醇质量比(脂胆比)、旋蒸温度、超声功率、微波功率、微波时间六因素对包封率、DPPH自由基清除率、粒径、多分散指数(PDI)与ζ电位的影响,随后利用Plackett-Burman与响应面试验设计优化脂质体制备工艺,并探究其结构、稳定性与体外抗氧化活性。结果:原花青素浓度0.6 mg·mL^(-1)、脂胆比7:1、旋蒸温度45℃、超声功率180 W、微波功率200 W、微波时间83 s时,包封率94.84%、DPPH自由基清除率69.07%、粒径182.96 nm、PDI 0.247、ζ电位-18.43 mV;透射电镜结果显示原花青素纳米脂质体具有单层、多层和多囊结构;原花青素纳米脂质体在pH为8.0、20℃以下避光储存更稳定;金属离子对原花青素纳米脂质体保存率影响低于原花青素溶液,影响顺序为Fe^(3+)>Mg^(2+)>K^(+);体外模拟胃肠液消化实验表明脂质体具有较好的缓释作用;体外抗氧化性结果表明经纳米脂质体封装后原花青素的抗氧化能力增强。研究表明逆向蒸发-超声微波协同技术有效提升了原花青素在纳米脂质体中的封装效率与抗氧化活性。 展开更多
关键词 逆向蒸发-超声微波协同技术 原花青素 纳米脂质体 抗氧化 稳定性
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RT-PCR技术检测猪瘟病毒的应用研究 被引量：34
8
作者 罗廷荣 莫扬 +7 位作者 吴文德 黄玉华 黄伟坚 秦爱珍 刘芳 温荣辉 陆芹章 余克伦 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期307-309,312,共4页
本试验应用反转录_聚合酶链式反应 (RT_PCR)对猪瘟进行诊断应用研究。应用RT_PCR对来自广西不同地区的 135份疑似猪瘟病料进行检测 ,84份诊断为阳性 ,阳性率 6 2 2 %。从百色、柳州地区等采集的健康猪扁桃体和淋巴结共 2 76份 ,经RT_PC... 本试验应用反转录_聚合酶链式反应 (RT_PCR)对猪瘟进行诊断应用研究。应用RT_PCR对来自广西不同地区的 135份疑似猪瘟病料进行检测 ,84份诊断为阳性 ,阳性率 6 2 2 %。从百色、柳州地区等采集的健康猪扁桃体和淋巴结共 2 76份 ,经RT_PCR检测 ,37份为阳性 ,阳性率为 13 4 %。其中健康猪扁桃体带毒较高 ,2 4 6份扁桃体中有 35份阳性 ,占 14 2 %。采自柳州健康猪的 2 6份淋巴结材料全为阴性 ,只有邕宁县的 1份健猪淋巴结阳性。结果表明 ,RT_PCR技术可应用于猪瘟的临床诊断。 展开更多
关键词 猪瘟 反转录-聚合酶链式反应 诊断
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RT-PCR快速诊断禽流感 被引量：21
9
作者 刘明 于康震 +3 位作者 崔尚金 孔宪刚 唐秀英 徐宜为 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 2000年第S1期176-177,共2页
根据禽流感病毒ＮＰ基因的序列分析结果，设计了一对ＮＰ基因特异的引物。采用该对引物，不经病毒分离，直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中提取核酸， ＲＴ～ＰＣＲ可以扩增出 ３２６ｂｐ的 ＮＰ基因片段。采用... 根据禽流感病毒ＮＰ基因的序列分析结果，设计了一对ＮＰ基因特异的引物。采用该对引物，不经病毒分离，直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中提取核酸， ＲＴ～ＰＣＲ可以扩增出 ３２６ｂｐ的 ＮＰ基因片段。采用该技术对１４个亚型禽流感病毒标准参考株，４个亚型１２株国内分离野毒株，ＲＴ－ＰＣＲ检测的结果都呈阳性；对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒，ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果都呈阴性。禽流感病毒 Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（Ｈ５Ｎ１）和 Ａ／Ａｆｒｉｃａｎ　Ｓｔａｒｌｉｎｇ／Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈ７Ｎ１）实验感染鸡样品 ＲＴ－ＰＣＲ检测与鸡胚病毒分离阳性率分别为３４／４２、３２／４２； ２４／５５、２４／５５， 二者符合率大于９５％。 ＲＴ－ＰＣＲ最少可检测到１０ｐｇ的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，只用６个小时就可得出准确的诊断结果，证明ＲＴ－ＰＣＲ检测方法敏感特异，可用于禽流感的快速诊断。 展开更多
关键词 禽流感病毒 诊断 反转录-聚合酶链式反应
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逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒 被引量：17
10
作者 张崇淼 刘永军 +1 位作者 王晓昌 薛小平 《环境科学研究》 EI CAS CSCD 北大核心 2007年第3期137-141,共5页
建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成... 建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中. 展开更多
关键词 肠道病毒 逆转录-聚合酶链反应(rt-PCR) 通用引物 同时检测 水
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马铃薯Y病毒的RT-PCR检测 被引量：30
11
作者 李浩戈 吴元华 赵秀香 《沈阳农业大学学报》 CAS CSCD 1999年第3期244-246,共3页
通过两种方法提取了烟草病叶中PVY病毒的RNA，然后针对PVY^N的CP基因序列，设计合成了一对特异性引物，运用反转录PCR技术对提取的PVY－RNA进行了体外扩增，结果得到与预期大小相一致的780bp片段，而对照未得到任何产物，从而建立了运... 通过两种方法提取了烟草病叶中PVY病毒的RNA，然后针对PVY^N的CP基因序列，设计合成了一对特异性引物，运用反转录PCR技术对提取的PVY－RNA进行了体外扩增，结果得到与预期大小相一致的780bp片段，而对照未得到任何产物，从而建立了运用RT－PCR手段检测植物中PVY的又一有效途径，并运用此方法对东北三省部分地区马铃薯种薯中PVY的带毒情况进行了检测。 展开更多
关键词 反转录PCR 马铃薯 Y病毒 检测
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用DDRT-PCR技术克隆小鼠早期胚胎发育相关基因 被引量：17
12
作者 李文雍 郁卫东 +1 位作者 刘桂生 陈清轩 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期728-732,共5页
mRNA差异显示 (DDRT PCR)技术在哺乳动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用 ,因获得足够量的早期胚胎材料困难而受到限制 .通过对DDRT PCR技术各种条件参数进行优化组合 ,并对某些环节进行改良 ,以小鼠的MⅡ卵、2 细胞胚胎和 4 细胞... mRNA差异显示 (DDRT PCR)技术在哺乳动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用 ,因获得足够量的早期胚胎材料困难而受到限制 .通过对DDRT PCR技术各种条件参数进行优化组合 ,并对某些环节进行改良 ,以小鼠的MⅡ卵、2 细胞胚胎和 4 细胞胚胎为材料进行差异显示 ,仅以相当于5 0个卵细胞的量为起始材料 ,便得到了理想的差示结果 .从差异条带中挑取感兴趣的差异条带进行回收、阳性鉴定、亚克隆、序列分析、并在反向Northern杂交基础上设计了鉴定实验 .结果发现 ,有一个片段差异显著且是阶段性特异表达 .经GenBank检索 ,发现该片段仅有同源的EST ,其全长及功能尚不清楚 ,是一个功能未知基因 ,将该片段命名为ed1.反向Northern杂交结果表明 ,ed1在 2 细胞期胚胎中有表达 ,而在MⅡ卵及 4 细胞胚胎中均不表达 . 展开更多
关键词 DDrt-PCR技术 克隆 小鼠 相关基因 早期胚胎发育
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猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立 被引量：10
13
作者 刘中勇 曾小娜 +4 位作者 朱道中 房红莹 蒋启荣 吴志强 罗满林 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第6期71-74,共4页
本研究设计了4条针对猪瘟病毒6个位点的特异性引物,建立了一种灵敏、特异、快速的猪瘟病毒体外等温扩增(RT-LAMP)检测方法,所建立的方法能够特异地检测出猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的存在,检测PRV、PRRSV、PCV-2等病... 本研究设计了4条针对猪瘟病毒6个位点的特异性引物,建立了一种灵敏、特异、快速的猪瘟病毒体外等温扩增(RT-LAMP)检测方法,所建立的方法能够特异地检测出猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的存在,检测PRV、PRRSV、PCV-2等病毒均为阴性;灵敏度高,所建立的CSFV-RT-LAMP方法灵敏度为10-5,总RNA的检测阈值约为1pg;反应快速,整个扩增反应可在1h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察及电泳检测。本试验为猪瘟的现场快速检测提供更加简便、快速的方法,可以满足基层检疫的需要。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 环介导等温扩增技术
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猪流感病毒RT-PCR快速检测方法的建立 被引量：8
14
作者 杨焕良 乔传玲 +2 位作者 陈艳 辛晓光 陈化兰 《动物医学进展》 CSCD 2007年第1期42-45,共4页
根据猪流感病毒M基因序列设计了一对扩增M基因684 bp片段的特异性引物,建立了RT- PCR快速诊断猪流感的方法,采用该方法检测出H1、H3、H5和H9 4个亚型猪流感病毒标准参考株为阳性,猪副黏病毒、圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测... 根据猪流感病毒M基因序列设计了一对扩增M基因684 bp片段的特异性引物,建立了RT- PCR快速诊断猪流感的方法,采用该方法检测出H1、H3、H5和H9 4个亚型猪流感病毒标准参考株为阳性,猪副黏病毒、圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果呈阴性。RT-PCR最少可检测到1 000 EID_(50)的病毒量核酸,可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒。 展开更多
关键词 猪流感病毒 诊断 反转录-聚合酶链式反应
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乙脑病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：12
15
作者 高正琴 贺争鸣 +2 位作者 邢瑞昌 卫礼 王吉 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第4期279-282,共4页
目的　建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法　根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT ... 目的　建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法　根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT nestedPCR ,将PCR产物进行了克隆测序;同时对猪细小病毒(PPV)、猴空泡病毒4 0 (SV4 0 )及正常乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞提取核酸进行PCR ,并对2 10份临床样品进行了检测。结果　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞均扩增出10 15bp和6 2 2bp目的基因片段,而PPV、SV4 0及未感染JEV的乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞均未见特异性扩增条带,2 10份猪组织样品中未检出阳性样品。RT nestedPCR检测的最低限度为10PFU病毒。从样品核酸的提取到PCR扩增及检测结果的报告可在8小时内完成。结论　本研究建立的RT NestedPCR方法具有快速、特异、敏感、可靠的特点,可用于人用猪源性生物制品中外源性JEV的污染检测。 展开更多
关键词 乙脑病毒 反转录-嵌套式聚合酶链反应 检测
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RT-PCR检测健康猪扁桃体和流产死胎猪瘟病毒的应用及RFLP分析 被引量：14
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作者 罗廷荣 孙敬锋 +6 位作者 莫扬 刘芳 黄伟坚 陆芹章 温荣辉 秦爱珍 余克伦 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期192-195,共4页
本研究用反转录＿聚合酶链反应(RT＿PCR)技术对广西部分猪场的健康猪扁桃体材料以及流产胎儿和死胎中的猪瘟病毒(HCV)进行检测。70份健康猪扁桃体材料中阳性11份,阳性率达15 7%;52份流产胎儿及死胎材料中检出阳性9份,阳性率达17 3%。表... 本研究用反转录＿聚合酶链反应(RT＿PCR)技术对广西部分猪场的健康猪扁桃体材料以及流产胎儿和死胎中的猪瘟病毒(HCV)进行检测。70份健康猪扁桃体材料中阳性11份,阳性率达15 7%;52份流产胎儿及死胎材料中检出阳性9份,阳性率达17 3%。表明广西猪场中有比较严重的健康带毒情况。用限制性片段长度多态性分析法(RFLP)对25份阳性材料、HCLV和石门毒的引物A1/A2的PCR产物进行分析,发现HCLV、石门强毒和广西流行野毒的RT＿PCR扩增产物中均有RsaⅠ的一个识别序列,但HCLV上的识别序列所在位置不同。本研究表明,用引物A1/A2作RT＿PCR检测,并结合RFLP分析技术可把兔化弱毒和流行野毒区分开来,这将对预防猪瘟起到十分重要的作用。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 反转录-聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性分析法
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高低温双反应区平台工艺RTS在炼油领域的应用 被引量：5
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作者 丁石 习远兵 +3 位作者 张乐 张锐 刘清河 曹鹏 《石油炼制与化工》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期38-42,共5页
为了更好地实现深度脱硫、脱氮以及芳烃饱和等反应,开发了高低温双反应区平台工艺技术RTS。该平台工艺技术可以用于柴油质量升级、催化裂化柴油(LCO)加氢促进多环芳烃饱和、高氮含量或高终馏点喷气燃料低压加氢、重整预加氢掺炼二次加... 为了更好地实现深度脱硫、脱氮以及芳烃饱和等反应,开发了高低温双反应区平台工艺技术RTS。该平台工艺技术可以用于柴油质量升级、催化裂化柴油(LCO)加氢促进多环芳烃饱和、高氮含量或高终馏点喷气燃料低压加氢、重整预加氢掺炼二次加工石脑油等领域。工业装置运行数据表明:采用RTS技术处理掺炼质量比例25%左右的二次加工柴油馏分的原料时,得到的精制柴油硫质量分数小于10μg/g,多环芳烃质量分数小于5%,满足国Ⅵ柴油质量标准,且装置运转周期可达到3年以上,实现了长周期稳定运行。 展开更多
关键词 双反应区 rtS技术 馏分油 加氢脱硫 加氢脱氮
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竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达 被引量：4
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作者 张晓杰 鲁纯平 +2 位作者 唐建华 顾善兰 禹虹 《湖南医科大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第4期322-326,共5页
目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ... 目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ,但在长度上要比靶cDNA少 2 0个碱基。把该竞争性cD NA模板在体外转录出的竞争性RNA作为RT PCR的内标准 ,与白血病细胞株K5 6 2细胞的总RNA在同一体系内进行逆转录和PCR扩增 ,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开 ,然后对电泳图像进行光密度扫描 ,根据已知的竞争性RNA模板的量计算出GPI PLDmRNA的量 ,从而得到GPI PLD基因的绝对表达量。结果 :构建和制备了长度为 198bp的GPI PLD竞争性RNA模板 ,该模板与靶模板呈明显的竞争性RT PCR反应 ;测得K5 6 2细胞GPI PLD基因的表达水平为每纳克 (44 0± 2 0 )拷贝。结论 :成功地建立了一种定量检测GPI PLD基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,该方法具有灵敏、准确等优点。 展开更多
关键词 竞争性rt-PCR法 定量检测 糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因 表达 白血病
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猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因RT-LAMP检测方法的建立 被引量：14
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作者 赵彦宗 张显浩 +2 位作者 余小利 苏丹萍 贺东生 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第12期53-56,共4页
本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)M基因保守序列6个特异性部位设计了2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法。结果表明,该方法灵敏度比RT-PCR高... 本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)M基因保守序列6个特异性部位设计了2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法。结果表明,该方法灵敏度比RT-PCR高100倍;全部反应可在1 h内完成并可得到其特有的阶梯状条带,而且猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光而直接判定结果。该方法灵敏度高、特异性好,可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 M基因 环介导逆转录等温扩增
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猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立 被引量：9
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作者 郭抗抗 邓力 +3 位作者 井勇 张彦明 王晶钰 宁蓬勃 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2010年第6期13-18,共6页
【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒... 【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 猪瘟兔化弱毒疫苗 反转录-聚合酶链式反应 鉴别检测
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