戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是造成急性肝炎最常见的原因之一。HEV基因组由5′非编码区、3个开放阅读框(ORF1、ORF2、ORF3)和3′非编码区组成,仅在HEV-1中发现了ORF4,并与ORF1重叠。各种编码蛋白在HEV的复制和感染中发挥着不...戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是造成急性肝炎最常见的原因之一。HEV基因组由5′非编码区、3个开放阅读框(ORF1、ORF2、ORF3)和3′非编码区组成,仅在HEV-1中发现了ORF4,并与ORF1重叠。各种编码蛋白在HEV的复制和感染中发挥着不同的作用,而HEV的复制是由ORF1编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)所介导的。HEV RdRp是由多个蛋白亚基组成的复合酶,具有7个保守基序,这些保守基序在RNA合成过程中发挥核苷酸识别、合成、延伸、修饰和稳定等作用,保证了RdRp的功能,在HEV的复制和转录中起到关键作用。因此,以RdRp作为抗HEV药物作用靶点的治疗方案具有很好的应用前景,是目前药物开发的一种主流思路。目前,已发现利巴韦林、索非布韦、2′-C-甲基胞苷(2CMC)等核苷类RdRp抑制剂和锌、GPC-N114等非核苷类RdRp抑制剂对HEV有较强的抑制作用,可作为潜在的抗HEV药物进行深入研究。笔者对HEV编码蛋白和HEV RdRp的结构与功能进行阐述,总结目前发现的对HEV有抑制作用的RdRp抑制剂,以期为HEV的药物开发提供一种新的思路。展开更多
目的构建含T7RNA聚合酶(T7RNA Polymerase,T7RNP)的真核表达载体,同时构建含T7启动子、增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和T7RNP转录终止信号的载体,并通过观察EGFP的表达推测T7RNP表达和T7表达系统介导基...目的构建含T7RNA聚合酶(T7RNA Polymerase,T7RNP)的真核表达载体,同时构建含T7启动子、增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和T7RNP转录终止信号的载体,并通过观察EGFP的表达推测T7RNP表达和T7表达系统介导基因转录的功能。方法根据编码T7RNP的基因序列,应用PCR技术从含有T7RNP基因的E.coli BL21(DE3)基因组中扩增编码T7RNP的基因片段,克隆至载体pcDNA3·1(+)。同时从px8δt载体和pGEM-Teasy/EGFP上切下T7RNP识别的终止信号(terminator,TER)和编码EGFP的基因,克隆至载体pcD-NAII。将获得的两个重组质粒共转染BHK细胞。48h后,通过观察EGFP基因在真核细胞内的表达情况,推测T7RNP基因的表达及表达后识别T7启动子介导基因转录功能。结果成功构建了含T7RNP编码基因的真核表达载体pcDNA3·1(+)/T7RNP和原核表达载体pcDNAII/EG-FP/TER,共转染BHK细胞后,可观察到EGFP表达的绿色荧光。结论T7RNP能顺利在真核细胞内表达,并通过与T7启动子和TER的相互作用,成功实现了EGFP基因的转录和表达。展开更多
文摘目的利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman RNAⅢ基因敲除株,探究RNAⅢ敲除对金葡菌γ-溶血素表达调控的影响。方法分别扩增RNAⅢ基因的上下游同源臂,根据同源重组原理,构建pBT2基因敲除载体,利用同源重组技术,构建RNAⅢ敲除株。并对野生株和敲除株γ-溶血素的转录水平和蛋白水平进行研究。结果实时荧光定量PCR结果显示RNAⅢ敲除株γ-溶血素A/B/C亚基的转录水平较野生株显著降低, Western blot检测结果也显示敲除株γ-溶血素蛋白表达水平较野生株明显减少。结论 RNAⅢ敲除可显著影响金葡菌γ-溶血素的表达。
