定性PCR方法检测转基因玉米MON810转化事件的研究 被引量：5

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作者 易小平 贺萍萍 +5 位作者 夏启玉 肖苏生 谢翔 杨小亮 李美英 郭安平 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2014年第12期2384-2390,共7页

转基因玉米MON810(Yield Gard R)是孟山都公司通过DNA重组技术和微注射轰击研发的一种具有对欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nublialis)有特殊抗性的转基因玉米品系,目前在世界各地已经得到广泛种植,为加强对该品系玉米的安全管理,本研究旨在... 转基因玉米MON810(Yield Gard R)是孟山都公司通过DNA重组技术和微注射轰击研发的一种具有对欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nublialis)有特殊抗性的转基因玉米品系,目前在世界各地已经得到广泛种植,为加强对该品系玉米的安全管理,本研究旨在建立MON810品系玉米的转化事件特异性定性PCR检测方法。根据MON810的插入序列信息,在3′端的侧翼序列处设计定性PCR检测的引物,检测MON810在其他几种常见转基因作物混合样品的特异性。结果表明,该方法具有很好的特异性。同时检测该引物系统的扩增灵敏度,结果表明,检测引物的灵敏度可达0.1%。建立的MON810特异定性PCR检测方法经全国7家实验室的验证,进一步证实该方法能够特异地检测出样品中的MON810转化事件,检测方法的灵敏度可达0.1%,且检测结果具有良好的可重复性和可重现性。MON810转化事件定性PCR检测方法的建立可满足于抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种生物安全管理的需要。 展开更多

关键词 转基因玉米MON810 定性pcr 灵敏度 特异性

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应用复合PCR检测水稻种子的转基因成分 被引量：11

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作者 李伟丰 杨朗 黄鹂 《种子》 CSCD 北大核心 2007年第1期32-35,共4页

根据转基因水稻中常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35 S启动子、胭脂碱合成酶(NoS)终止子、β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、潮霉素磷酸转移酶基因(Hpt)、新霉素磷酸转移酶基因(NptII)和B t毒蛋白基因(B t Cry 1 Ab)的序列,设计合成6对不同的引物... 根据转基因水稻中常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35 S启动子、胭脂碱合成酶(NoS)终止子、β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、潮霉素磷酸转移酶基因(Hpt)、新霉素磷酸转移酶基因(NptII)和B t毒蛋白基因(B t Cry 1 Ab)的序列,设计合成6对不同的引物,用简单PCR方法检测了水稻种子中的转基因成分,同时建立应用一次PCR反应同时扩增检测两种或多种外源基因的复合PCR方法。通过对水稻样品进行PCR扩增,分析、比较复合PCR的检测结果与简单PCR的扩增结果,发现两者结果完全一致。表明复合PCR方法不但可以提高检测效率、降低检测成本,还可以有效防止假阳性,是一种值得推广的方法。 展开更多

关键词 转基因水稻 基因 复合pcr

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非同位素的PCR-RNA转录本分子杂交法检测急淋微小残留病

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作者 肖燕 费洪宝 +2 位作者 梁欣荃 刘树茂 杨爱德 《同济医科大学学报》 CSCD 1998年第6期467-469,480,共4页

以T细胞抗原受体γ链重排基因（TCRγ）为标志,运用分别与V区和J区片段的保守序列一致,并带有T_7RNA聚合酶启动子序列的引物,将急性淋巴细胞白血病（ALL）初诊期的骨髓标本进行PCR（聚合酶链反应）.并将其产物转录成为RNA,以该RNA为探针... 以T细胞抗原受体γ链重排基因（TCRγ）为标志,运用分别与V区和J区片段的保守序列一致,并带有T_7RNA聚合酶启动子序列的引物,将急性淋巴细胞白血病（ALL）初诊期的骨髓标本进行PCR（聚合酶链反应）.并将其产物转录成为RNA,以该RNA为探针,与ALL缓解期骨髓标本DNA的PCR产物所转录的 RNA杂交,杂交体用RNA酶消化,消化产物行聚丙烯酰酰凝胶电泳（PAGE）,尔后硝酸银染色观察检测结果。实验表明:该方法特异性强.灵敏度可达10^(-5)水平.具有快速、经济、没有同位素污染的优点,便于临床运用。 展开更多

关键词 白血病 微小残留病 ALL 聚合酶链反应 rNA杂交

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猪繁殖与呼吸综合征病毒变异野毒株与JXA1-R疫苗毒株快速鉴别方法的建立 被引量：5

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作者 何玲 裴仉福 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第1期198-201,共4页

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)变异野毒JXA1的基因变异序列和疫苗株JXA1-R的基因遗传标志设计合成了2对特异性引物,结合快速RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立了JXA1变异野毒与... 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)变异野毒JXA1的基因变异序列和疫苗株JXA1-R的基因遗传标志设计合成了2对特异性引物,结合快速RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立了JXA1变异野毒与JXA1-R疫苗毒的快速鉴别体系,其目的片段大小分别为4002、90 bp,该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒的PCR检测结果均为阴性;对JXA1变异野毒与JXA1-R疫苗毒RNA的最低检测量分别为103、104拷贝/μL。该方法敏感、特异,适用于临床样品的检测。 展开更多

关键词 PrrSV变异株 JXA1-r rT-pcr

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LDL-R基因多态性与丙型肝炎易感性的相关性分析

5

作者 张青杨 金丹宁 +2 位作者 金国江 康辉 尚红 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1109-1113,共5页

目的探讨低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因rs688 C/T、rs5925 C/T单核苷酸多态性(SNP)与丙型肝炎易感性之间的相关性。方法采用聚合酶链式反应(PCR)结合高分辨率熔解曲线(HRM-PCR)的方法,对179例丙型肝炎病毒(HCV)感染者和178名体检健康者... 目的探讨低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因rs688 C/T、rs5925 C/T单核苷酸多态性(SNP)与丙型肝炎易感性之间的相关性。方法采用聚合酶链式反应(PCR)结合高分辨率熔解曲线(HRM-PCR)的方法,对179例丙型肝炎病毒(HCV)感染者和178名体检健康者或无病毒性肝炎史的其他疾病患者基因rs688和rs5929两个位点的单核苷酸多态性进行检测。结果在HCV感染组和未感染HCV对照组之间,LDL-R SNP中rs688和rs5925分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论 rs688和rs5925这两个多态性位点可能与丙型肝炎感染无相关性。 展开更多

关键词 低密度脂蛋白受体 基因多态性 高分辨率熔解曲线 聚合酶链式反应 丙型肝炎

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纯合子NEO^r转基因小鼠品系的建立及鉴定 被引量：3

6

作者 曲玉秀 汤家铭 +2 位作者 连安 刘铁铮 成国祥 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2004年第2期76-80,共5页

目的　建立清洁级Neor 转基因小鼠纯合子品系。方法　通过胚胎移植生物净化方法获得 1 0只清洁级NeorF1 小鼠 ,按孟德尔遗传法则交配 ,用PCR、Southernblot杂交和交配实验检测相结合的方法筛选纯合子。结果　选育出 4只纯合子 ,并建系... 目的　建立清洁级Neor 转基因小鼠纯合子品系。方法　通过胚胎移植生物净化方法获得 1 0只清洁级NeorF1 小鼠 ,按孟德尔遗传法则交配 ,用PCR、Southernblot杂交和交配实验检测相结合的方法筛选纯合子。结果　选育出 4只纯合子 ,并建系。该纯合转基因小鼠与野生型小鼠交配制备的胎儿成纤维细胞具有G4 1 8抗性 ,可作为ES细胞基因打靶培养中的饲养层细胞。结论　通过微生物学和遗传学上对Neor 转基因小鼠进行质量控制 ,使Neor 转基因小鼠达到了清洁级 ,并建立纯合子品系。 展开更多

关键词 纯合子 Neo^r 转基因 小鼠 品系 生物净化 聚合酶链反应

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小鼠肾脏缺血-再灌注损伤miRNAs差异表达谱研究

7

作者 吴奥 王水良 +1 位作者 祝玲 杨顺良 《器官移植》 CAS CSCD 2017年第2期138-143,共6页

目的筛选小鼠肾脏缺血-再灌注损伤(IRI)差异性表达的微小核糖核酸(miRNAs),为进一步深入阐明肾脏IRI发生、发展的分子机制奠定基础。方法应用微型动脉夹夹闭小鼠双侧肾动脉制备急性肾缺血损伤模型,将15只小鼠分为IRI组和假手术组(E组),... 目的筛选小鼠肾脏缺血-再灌注损伤(IRI)差异性表达的微小核糖核酸(miRNAs),为进一步深入阐明肾脏IRI发生、发展的分子机制奠定基础。方法应用微型动脉夹夹闭小鼠双侧肾动脉制备急性肾缺血损伤模型,将15只小鼠分为IRI组和假手术组(E组),IRI组再分为A组(缺血时间45 min,再灌注时间24 h)、B组(缺血时间25 min,再灌注时间24 h)、C组(缺血时间45 min,再灌注时间4 h)、D组(缺血时间25 min,再灌注时间4 h),每组3只。采用肾脏组织形态学改变和肾功能评估结果来鉴定各组小鼠的IRI程度;采用miRNAs芯片聚类分析对小鼠IRI特定缺血时间(25、45 min)和再灌注时间(4、24 h)下肾脏差异性表达差异表达的miRNAs进行筛选鉴定;采用实时定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)对小鼠IRI后差异表达miRNAs芯片miR-695与miR-145进行验证。结果肾脏组织形态学改变和肾功能评估结果显示成功建立IRI模型。与假手术组相比,肾脏IRI组共检出71种差异性表达显著的miRNAs,其中30种下调表达,41种上调表达。q RT-PCR法检测结果表明,以E组特定miRNAs的表达量标准化为1,miR-695及miR-145在肾脏IRI组的相对表达量分别为11.82和0.31(均为P<0.05),与芯片结果基本一致。结论肾脏IRI后,miRNAs表达谱发生差异性改变,这些差异性表达的miRNAs将可作为肾脏IRI的分子标志物而具有潜在的临床及科研应用价值。 展开更多

关键词 肾组织 肾动脉夹闭 缺血-再灌注损伤 微小核糖核酸(mirNAs) 芯片 mir-695 MIr-145 基因差异表达谱 实时定量逆转录-聚合酶链反应

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羊羔美酒大曲中乳酸菌多样性及分子鉴定 被引量：6

8

作者 李艳 董振玲 +1 位作者 李佳 牟德华 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第13期167-171,共5页

目的:分离和鉴定羊羔美酒大曲中的乳酸菌,探寻其菌群多样性,为酿酒工艺条件改进提供参考。方法:将酒曲进行梯度稀释、富集培养、平板画线等分离纯化,获取乳酸菌单菌落。采用菌落特征和个体形态特征结合的方法进行乳酸菌形态鉴定。乳酸... 目的:分离和鉴定羊羔美酒大曲中的乳酸菌,探寻其菌群多样性,为酿酒工艺条件改进提供参考。方法:将酒曲进行梯度稀释、富集培养、平板画线等分离纯化,获取乳酸菌单菌落。采用菌落特征和个体形态特征结合的方法进行乳酸菌形态鉴定。乳酸菌的分子鉴定采用重复序列聚合酶链式反应(repetitive sequence-based polymerase chain reaction,Rep-PCR)技术和16S r DNA序列分析法。结果:从羊羔美酒大曲中共得到65株乳酸菌,形态学分为9类。用Rep-PCR技术在75%的相似性上将其区分为5类,经基因序列分析,鉴定为分属于4个属的乳酸菌,分别为:片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)。结论:传统微生物分离技术与现代分子鉴定技术相结合,可快速准确鉴定出羊羔美酒大曲中乳酸菌的菌群组成和多样性。 展开更多

关键词 羊羔美酒大曲 乳酸菌 分子鉴定 重复序列聚合酶链式反应 16S rDNA序列分析

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人乳头瘤病毒感染与P53及肺耐药蛋白表达在非小细胞肺癌中的关系及其临床意义 被引量：1

9

作者 郑少江 吴人亮 +2 位作者 郭峻莉 焦嫦亮 罗志飞 《海南医学院学报》 CAS 2005年第6期494-497,共4页

目的:探讨人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染在非小细胞肺癌(non-small-celllungcancer,NSCLC)发生中的病因学意义及其与P53蛋白和肺耐药蛋白(lungresistanceprotein,LRP)表达之间的相关性。方法:应用聚合酶链反应(PCR)、免疫... 目的:探讨人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染在非小细胞肺癌(non-small-celllungcancer,NSCLC)发生中的病因学意义及其与P53蛋白和肺耐药蛋白(lungresistanceprotein,LRP)表达之间的相关性。方法:应用聚合酶链反应(PCR)、免疫组化方法(IHC)分别检测76例NSCLC组织中HPVDNA及其E6、E7原癌蛋白,P53和LRP蛋白的表达情况。结果:NSCLC中HPVDNA及其E6、E7原癌蛋白的检出率分别为40.8%、43.4%,2种方法检测的符合率为78.9%;P53和LRP的阳性率分别为63.2%、59.2%,且HPV感染阳性组中P53蛋白阳性表达率(75.8%)显著高于阴性组(46.5%)(P<0.05);P53蛋白表达阳性组中LRP阳性表达率(68.8%)显著高于阴性组(42.9%)(P<0.05);而HPV感染阳性组与阴性组间LRP的表达无显著性差异(P>0.05)。HPV感染与高、中分化程度的NSCLC及吸烟有关;结论:HPV感染可能是NSCLC发生的另一重要病因学因素,且HPV感染可能导致P53基因突变,同时基因突变的P53可能促进肺癌耐药性的增加。 展开更多

关键词 乳头状瘤病毒 癌 非小细胞肺 基因 P53 蛋白质P53 聚合酶链反应 免疫组织化学

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TNF基因转导肿瘤浸润淋巴细胞的方法学研究

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作者 李彪如 徐铿 +3 位作者 钱关祥 张希衡 童善庆 陈诗书 《上海第二医科大学学报》 CSCD 1995年第3期185-189,共5页

在总结Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ建立的ＴＮＦ－ＮｅｏＲ缺陷型逆转录病毒转染肿瘤浸润细胞（ＴＩＬ）的基础上，选用美国国家卫生院重组ＤＮＡ咨询委员会（ＲＡＣ）批准的逆转录病毒（Ｍｏ－ＭｕＬＶ）的衍生物作载体，对肿瘤坏死因子转导Ｔ... 在总结Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ建立的ＴＮＦ－ＮｅｏＲ缺陷型逆转录病毒转染肿瘤浸润细胞（ＴＩＬ）的基础上，选用美国国家卫生院重组ＤＮＡ咨询委员会（ＲＡＣ）批准的逆转录病毒（Ｍｏ－ＭｕＬＶ）的衍生物作载体，对肿瘤坏死因子转导ＴＩＬ进行研究。实验结果提示：ＴＩＬ处于静息期与对数生长后期，当ＴＮＦ－ＮｅｏＲ缺陷型逆转录病毒转导ＴＩＬ细胞时，ＴＩＬ细胞增殖受到影响；最佳转导时间为ＴＩＬ分离培养后９～２５ｄ。各病毒感染复数值病毒转导对ＴＩＬ增殖倍数与生存天数影响不大，但病毒感染复数值越大，转导后ＴＩＬ起始呈抑制现象越大；然而Ｇ_（４１８）筛选后证实，病毒感染复数值越大，转导成功率越大。Ｌ_（９２９）细胞检测转导后ＴＩＬ呈高表达，ＰＣＲ检测ＴＮＦ目的基因已插入宿主ＤＮＡ中。 展开更多

关键词 肿瘤浸润 淋巴细胞 转导 肿瘤坏死因子 方法学

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人杀菌/渗透增强蛋白N端功能片段基因突变文库的构建和鉴定

11

作者 李晶琴 孔庆利 安云庆 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2017年第6期903-910,共8页

目的为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI_(23)对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI_(600)进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI_(... 目的为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI_(23)对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI_(600)进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI_(600)基因突变体库。方法通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI_(600)随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI_(600)的随机突变率。再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,将质粒进行HindⅢ/XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况。结果测序和基因比对显示,BPI_(600)经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3%;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI_(600),表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI_(600);在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI_(23)编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失。氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变。3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白。结论成功构建pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础。 展开更多

关键词 人杀菌 渗透增强蛋白 定向进化 易错pcr DNA改组

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