适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建 被引量：5

1

作者 罗维 赵墩 +1 位作者 蒋大良 余兴龙 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期404-408,共5页

为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A1... 为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A10细胞克隆培养PCV2,获得的病毒含量最高。将A10细胞进行第2轮细胞克隆,之后用同步接种法和异步接种法将PCV2感染A10细胞,并检测A10细胞接毒后的PCV2 DNA含量,2种接毒方法获得的最高PCV2基因组的拷贝数分别为3.0×109、6.2×109/mL,高于用PK15混合细胞培养PCV2所获得的最高PCV2基因组拷贝数(107/mL)。综合以上结果,构建的PK15均质细胞克隆株比PK15混合细胞更适合PCV2的培养。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2(PCV2) pk15细胞 细胞克隆 定量PCR 同步接毒 异步接毒

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3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究 被引量：4

2

作者 张万锋 黑伟 +8 位作者 何志强 刘敏 孟珊 高鹏飞 蔡春波 杨阳 郭晓红 曹果清 李步高 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第5期1352-1359,共8页

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧... 试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P<0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P>0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P<0.01),脂质体方法显著低于对照组(P<0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P>0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。 展开更多

关键词 pk15细胞 NR2F2基因 脂质体转染 电穿孔转染 慢病毒转染

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逆转录病毒载体介导的T7RNA聚合酶在猪源细胞PK15及SK6中的稳定表达 被引量：2

3

作者 吴锦艳 田宏 +4 位作者 郑海学 陈妍 靳野 尚佑军 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期527-532,共6页

本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞... 本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获重组病毒并用该病毒在Polybrene的介导下分别感染PK15和SK6细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。对此阳性细胞进行传代,并对不同代次细胞中的T7RNA聚合酶基因进行扩增,确定其遗传稳定性。用直接荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞中T7RNA聚合酶基因的表达及其活性。结果表明T7RNA聚合酶能够被稳定地整合进靶细胞基因组内,细胞系内的T7RNA聚合酶具有较好的转录活性,其活性传代不减弱。免疫荧光检测发现所表达的T7RNAP蛋白具有良好的反应原性。本研究表明T7RNA聚合酶基因稳定整合进猪源细胞,该基因的稳定整合为建立高效体内病毒拯救系统提供了良好的工具。 展开更多

关键词 T7RNA聚合酶基因 逆转录病毒载体 pk15细胞 SK6细胞 稳定表达

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不同培养基对PK15细胞增殖影响的研究 被引量：3

4

作者 付世新 李晓龙 +1 位作者 王长远 刘国文 《黑龙江八一农垦大学学报》 2004年第1期62-64,共3页

采用无血清液体培养基、DMEM培养基和MEM培养基进行PK15细胞的培养,观察细胞增殖及传代效果,确定无血清液体培养基的营养功能。结果表明:无血清液体培养基只能维持第一代细胞的生长,不能用于第二代后的培养,效果不如DMEM、MEM培养基,且... 采用无血清液体培养基、DMEM培养基和MEM培养基进行PK15细胞的培养,观察细胞增殖及传代效果,确定无血清液体培养基的营养功能。结果表明:无血清液体培养基只能维持第一代细胞的生长,不能用于第二代后的培养,效果不如DMEM、MEM培养基,且差异显著。 展开更多

关键词 培养基 pk15细胞 增殖 营养 猪传代肾细胞

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铜对猪传代肾细胞(PK15)增殖的影响 被引量：3

5

作者 付世新 罗春海 刘海瑞 《黑龙江八一农垦大学学报》 2008年第2期47-50,共4页

为了解铜对猪肾细胞增殖和代谢的影响,了解铜促生长机理,采用猪传代肾细胞PK15,在培养液中添加不同铜水平对PK15细胞进行体外培养,计算了PK15细胞的增殖率和3H-TdR掺入率。结果表明PK15细胞对铜刺激敏感,铜可有效促进PK15细胞增殖,铜添... 为了解铜对猪肾细胞增殖和代谢的影响,了解铜促生长机理,采用猪传代肾细胞PK15,在培养液中添加不同铜水平对PK15细胞进行体外培养,计算了PK15细胞的增殖率和3H-TdR掺入率。结果表明PK15细胞对铜刺激敏感,铜可有效促进PK15细胞增殖,铜添加组细胞增殖率和3H-TdR掺入率显著,高于对照组(p<0.05),且以培养液中添加31.2μmol.L-1Cu PK15细胞的增殖作用最强。 展开更多

关键词 铜:pk15细胞 细胞增殖

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NR2F2基因调控猪PK15细胞增殖和凋亡的研究

6

作者 张万锋 赵天枝 +7 位作者 李娇 尤紫薇 杨阳 蔡春波 高鹏飞 曹果清 郭晓红 李步高 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3242-3251,共10页

旨在探究NR2F2基因对猪PK15细胞增殖和凋亡的影响。本研究在猪PK15细胞中过表达NR2F2基因,通过qRT-PCR、Western blot、CCK-8、EdU、流式细胞术、划痕试验等方法检测了过表达NR2F2基因对细胞增殖的影响;采用CO-IP技术验证NR2F2与Smad4... 旨在探究NR2F2基因对猪PK15细胞增殖和凋亡的影响。本研究在猪PK15细胞中过表达NR2F2基因,通过qRT-PCR、Western blot、CCK-8、EdU、流式细胞术、划痕试验等方法检测了过表达NR2F2基因对细胞增殖的影响;采用CO-IP技术验证NR2F2与Smad4蛋白结合能力;用qRT-PCR方法检测了NR2F2基因对Smad 4基因表达以及下游基因Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D 1表达的影响;挽救试验过表达NR2F2基因且干扰Smad 4基因检测下游基因及增殖基因Ki67、PCNA的表达。结果发现,过表达NR2F2基因极显著上调了Ki 67基因的表达(P<0.01),显著上调了PCNA的表达(P<0.05),促进了细胞周期的进程,抑制了细胞凋亡,促进了细胞的增殖。CO-IP结果证明了NR2F2与Smad4蛋白物理性结合,且发现过表达NR2F2基因后,Smad 4基因表达显著上升(P<0.01),Smad 4基因调控的下游基因Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D 1表达显著升高(P<0.01);干扰NR2F2基因后,Smad 4基因表达显著下降(P<0.01),Smad 4基因调控的下游基因表达显著降低(P<0.01)。挽救试验发现,过表达NR2F2基因后,干扰Smad 4基因的表达,能显著降低Cyclin D1、Cyclin B、CDK 1以及Ki67、PCNA的表达(P<0.01,P<0.05)。本研究结果表明,过表达NR2F2基因后促进了细胞的增殖,抑制凋亡,且NR2F2蛋白能与Smad4蛋白结合并影响Smad 4基因的表达,进而影响下游基因的表达。 展开更多

关键词 NR2F2基因 Smad 4基因 细胞增殖 pk15细胞

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肌抑素对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响 被引量：1

7

作者 朱喆 张剑英 +6 位作者 华再东 任红艳 肖红卫 张立苹 郑新民 毕延震 卢晟盛 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第2期345-351,共7页

本研究旨在揭示肌抑素(MSTN)与基质金属蛋白酶(MMPs)的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系:单等位基因敲除的PK3108细胞系和双... 本研究旨在揭示肌抑素(MSTN)与基质金属蛋白酶(MMPs)的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系:单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调(P<0.01);细胞外基质中纤连蛋白(FN)和层连接蛋白(LN)含量均极显著增加(P<0.01)。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞(P<0.01);Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。 展开更多

关键词 猪 肌抑素(MSTN) 基质金属蛋白酶2/7/9(MMP-2/7/9) pk15细胞

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猪细小病毒在PK15细胞中增殖规律的研究 被引量：15

8

作者 倪娇 赵建增 +2 位作者 刘长辉 邢海云 赵亚荣 《中国兽药杂志》 2009年第1期21-24,共4页

猪细小病毒毒株在不同细胞系上的生长情况不尽相同,如不能掌握其规律,将难以生产出优质的疫苗。对PPV(长春株)在PK15和ST细胞上生长情况进行了研究,在PK15细胞系中重点比较了不同的病毒接种方法、病毒接种量和病毒收获时间等因素对病毒... 猪细小病毒毒株在不同细胞系上的生长情况不尽相同,如不能掌握其规律,将难以生产出优质的疫苗。对PPV(长春株)在PK15和ST细胞上生长情况进行了研究,在PK15细胞系中重点比较了不同的病毒接种方法、病毒接种量和病毒收获时间等因素对病毒产量的影响。研究结果显示:本毒株在PK15和ST两种细胞系上的病变特征不同,但生长规模相似。在PK15细胞上按2%接种量、分步接种、80 h时收获病毒,最终得到的病毒滴度(TCID50)最高。提示这是一种比较好的生产方案。然而,进一步的大规模培养试验是有必要的。 展开更多

关键词 猪细小病毒 pk15细胞 增殖规律

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PK15细胞的无血清全悬浮驯化研究 被引量：10

9

作者 刘天伦 郎洪彬 孔飒 《中国兽药杂志》 2019年第9期12-18,共7页

目前PK15细胞主要用于生产猪圆环病毒2型,传统的培养工艺为滚瓶系统或微载体系统,该两种培养系统都存在各自的劣势。驯化一株全悬浮的PK15细胞可推进工艺的进一步升级,降低成本的同时也简化了培养工艺且更易于产业化。经贴壁降血清培养... 目前PK15细胞主要用于生产猪圆环病毒2型,传统的培养工艺为滚瓶系统或微载体系统,该两种培养系统都存在各自的劣势。驯化一株全悬浮的PK15细胞可推进工艺的进一步升级,降低成本的同时也简化了培养工艺且更易于产业化。经贴壁降血清培养、低血清悬浮优化传代、无血清悬浮传代培养,对一株贴壁的PK15细胞进行了无血清的全悬浮驯化。传代23次后,该株细胞无血清全悬浮培养初始密度为0. 5×106/m L,在72 h密度可增殖到4. 0×106/m L左右,形态良好,倍增时间稳定,且细胞活率达到95%以上,命名为PK15-S,为大规模培养PK15细胞提供了理论依据。 展开更多

关键词 pk15细胞 细胞驯化 无血清 全悬浮

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猪RPL36A基因对PK15细胞增殖过程的影响

10

作者 王首元 贠红梅 +5 位作者 史明月 秦云梦 李熊 陈军舟 周琛帛 曹果清 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3035-3044,共10页

【目的】探究核糖体蛋白L36A(ribosomal protein L36A,RPL36A)基因对PK15细胞增殖过程的影响,为解析马身猪和大白猪生长速度差异的生理机制奠定基础。【方法】采用脂质体法将RPL 36 A基因干扰和过表达载体转染至PK15细胞中,通过实时荧... 【目的】探究核糖体蛋白L36A(ribosomal protein L36A,RPL36A)基因对PK15细胞增殖过程的影响,为解析马身猪和大白猪生长速度差异的生理机制奠定基础。【方法】采用脂质体法将RPL 36 A基因干扰和过表达载体转染至PK15细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测RPL 36 A基因表达效率及细胞增殖标志基因(PCNA、Ki67、Cyclin B、CDK4)的表达变化,并通过划痕试验、CCK-8和EdU法检测细胞增殖情况。【结果】过表达RPL 36 A基因后,PK15细胞中PCNA、Ki 67、CDK 4基因mRNA表达量均极显著升高(P<0.01),Cyclin B基因mRNA表达量显著升高(P<0.05);PCNA蛋白表达量显著升高(P<0.05);PK15细胞在48 h的细胞数量极显著高于空载组(P<0.01),细胞增殖速度升高;阳性细胞数极显著升高(P<0.01)。干扰RPL 36 A基因后,PK15细胞中PCNA、Cyclin B基因mRNA表达量均极显著降低(P<0.01),Ki 67、CDK 4基因mRNA表达量均显著降低(P<0.05);PCNA蛋白表达量显著降低(P<0.05);PK15细胞在48 h的细胞数量显著低于对照组(P<0.05),细胞增殖速度降低;阳性细胞数极显著降低(P<0.01)。【结论】在PK15细胞中过表达和干扰RPL 36 A基因后,细胞增殖关键基因PCNA、Ki 67、Cyclin B、CDK 4的表达量及48 h的细胞数量和阳性细胞数均有显著变化,RPL 36 A基因可影响PK15细胞的增殖过程。 展开更多

关键词 猪 RPL 36 A基因 pk15细胞 过表达 干扰 细胞增殖

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乙型脑炎病毒感染PK15细胞的lncRNA差异表达谱分析 被引量：1

11

作者 朱静静 戴政列 +4 位作者 汪涵 李向臣 赵阿勇 周晓龙 杨松柏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期272-281,共10页

旨在分析乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染猪肾上皮细胞PK15后的lncRNA差异表达谱,探究宿主lncRNA在JEV感染和宿主防御中的潜在功能。本研究中利用JEV感染PK15细胞,感染36 h,收集细胞,同时设立未感染对照组,每组3个... 旨在分析乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染猪肾上皮细胞PK15后的lncRNA差异表达谱,探究宿主lncRNA在JEV感染和宿主防御中的潜在功能。本研究中利用JEV感染PK15细胞,感染36 h,收集细胞,同时设立未感染对照组,每组3个生物学重复。提取细胞总RNA,构建cDNA文库后进行高通量测序,筛选出差异表达lncRNA。通过对差异表达lncRNA与mRNA的位置关系以及序列相似性预测顺式和反式作用的靶基因,将预测的靶基因进行GO和KEGG分析。最后随机选出9个差异表达lncRNAs,利用实时荧光定量PCR(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)技术进行表达验证。结果表明,本研究中共鉴定出856个差异表达lncRNAs,其中452个lncRNAs显著上调表达,404个lncRNAs显著下调表达。GO分析发现,lncRNA的靶基因主要富集于先天性免疫反应;KEGG通路分析发现lncRNA的靶基因显著富集于肿瘤坏死因子、Toll样受体和NF-κB等信号通路。通过qRT-PCR验证发现,定量结果和测序结果基本一致。本研究为进一步探究lncRNA参与宿主免疫反应调控JEV复制奠定了理论基础。 展开更多

关键词 猪 乙型脑炎病毒 先天免疫反应 pk15细胞 高通量测序

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lncRNA在乙脑病毒感染PK15细胞过程中的作用研究 被引量：1

12

作者 杜程涛 汪涵 +3 位作者 杨松柏 李向臣 周晓龙 赵阿勇 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第7期2045-2052,共8页

本研究旨在初步探索乙脑病毒(JEV)感染PK15细胞后的增殖情况,筛选与病毒感染相关的lncRNA,并对其进行亚细胞定位及靶基因预测。通过免疫荧光试验来检测病毒结构蛋白E的表达情况,采用TCID50法检测PK15细胞中病毒的增殖情况,利用实时荧光... 本研究旨在初步探索乙脑病毒(JEV)感染PK15细胞后的增殖情况,筛选与病毒感染相关的lncRNA,并对其进行亚细胞定位及靶基因预测。通过免疫荧光试验来检测病毒结构蛋白E的表达情况,采用TCID50法检测PK15细胞中病毒的增殖情况,利用实时荧光定量PCR检测病毒感染后lncRNA的表达水平,在NONCODE数据库对lncRNA进行亚细胞定位,通过starBase、NONCODE、KEGG等数据库对其进行靶基因预测和信号通路分析。结果显示,JEV感染PK15细胞后,24~36 h为病毒滴度指数增长期,感染后36 h病毒滴度已达10-5.75 TCID50/mL。PK15细胞在感染JEV 12 h后,lncRNA A、B、C表达水平均无显著变化(P>0.05),lncRNA D表达水平极显著下降(P<0.01);感染JEV 24、36和48 h后lncRNA A、B、C表达水平极显著上升(P<0.01),lncRNA D表达水平极显著下降(P<0.01)。lncRNA A主要定位在胞质溶胶,lncRNA B在细胞核和细胞质中均有分布,lncRNA C主要定位在细胞质中,在细胞核中也有可能分布,lncRNA D可能在细胞内呈现广泛性分布。通过靶基因预测和信号通路分析,lncRNA A、B、C的靶基因主要为OAS1、OAS2、OASL、COX1等,lncRNA D的靶基因主要为DST、ND1、ND2、ND4等。信号通路分析发现lncRNA可能通过肿瘤坏死因子(TNF)、NF-κB和Toll样受体(TLR)等信号通路参与病毒感染后的增殖过程。本研究为进一步探索宿主细胞lncRNA对病毒增殖的影响奠定一定的基础。 展开更多

关键词 lncRNA pk15细胞 乙脑病毒(JEV) 增殖

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无血清全悬浮PK15细胞培养猪圆环病毒2型的研究 被引量：1

13

作者 刘天伦 《中国兽药杂志》 2022年第1期1-6,共6页

为改进猪圆环病毒2型的培养工艺,驯化了一株可无血清培养的全悬浮PK15细胞用于培养猪圆环病毒2型,并对病毒的敏感性、接毒时间、接毒量、收获方法进行了试验。结果表明,用该细胞培养猪圆环病毒2型,如果采用批次收获,接毒时细胞密度为0.5... 为改进猪圆环病毒2型的培养工艺,驯化了一株可无血清培养的全悬浮PK15细胞用于培养猪圆环病毒2型,并对病毒的敏感性、接毒时间、接毒量、收获方法进行了试验。结果表明,用该细胞培养猪圆环病毒2型,如果采用批次收获,接毒时细胞密度为0.5×10^(6)/mL,接毒量为0.1 MOI,接毒72 h后收毒,病毒滴度能达到10^(6.4)TCID_(50)/mL;如果采用连续收获,接毒和带毒传代时均使细胞密度为0.5×10^(6)/mL,接毒量为0.04 MOI,收毒时间为接毒后72 h,连续收获三次,病毒滴度分别为10^(6.0)TCID_(50)/mL、10^(6.25)TCID_(50)/mL、10^(6.5)TCID_(50)/mL,病毒滴度和收获液体积较为理想,可为大规模培养猪圆环病毒2型提供参考。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 pk15细胞 全悬浮 无血清 连续收获

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猪miR-22前体上游序列突变的PK15细胞系构建

14

作者 丁兆雪 王佳洁 +5 位作者 沈中浩 周晓龙 杨松柏 金航峰 赵阿勇 汪涵 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2022年第9期1849-1855,共7页

猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgR... 猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2;随后将重组质粒转染猪肾上皮细胞系(PK15),经嘌呤霉素初步筛选后,提取基因组DNA,通过PCR及测序鉴定编辑效果;最后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测编辑前后miR-22相对表达量的变化。结果显示,81个阳性克隆中,共产生6种突变类型,突变率达60.49%;qRT-PCR检测显示,编辑后miR-22的表达量显著下调约50%。本研究成功获得了miR-22前体上游序列突变的猪PK15细胞模型,为今后猪miR-22的功能研究提供了新的可应用研究对象。 展开更多

关键词 猪 微小RNA 突变 CRISPR/Cas9技术 pk15细胞系

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TSG 101基因敲低对猪伪狂犬病病毒体外增殖的影响

15

作者 王梦迪 王昱旻 +9 位作者 张震 鲁秀香 王恒 樊文杰 姚晨 刘鹏翔 马延杰 褚贝贝 王江 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期4110-4120,共11页

本研究旨在使用慢病毒包装敲低技术构建敲低肿瘤易感基因(tumor susceptibility gene 101,TSG 101)的慢病毒质粒及稳转PK15细胞系,并验证该敲低细胞系对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)感染的影响。针对TSG 101基因构建并筛选,成... 本研究旨在使用慢病毒包装敲低技术构建敲低肿瘤易感基因(tumor susceptibility gene 101,TSG 101)的慢病毒质粒及稳转PK15细胞系,并验证该敲低细胞系对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)感染的影响。针对TSG 101基因构建并筛选,成功获得重组慢病毒,用获得的重组慢病毒感染PK15细胞,并使用嘌呤霉素进行筛选,获得稳转敲低TSG 101基因的PK15细胞系。通过Real-time PCR以及Western blot方法对所构建的细胞系进行编辑效率检测;使用CCK-8法对筛选出的细胞系进行细胞活力及生长状况检测;通过流式细胞术、Real-time PCR、Western blot以及子代病毒滴度方法验证该细胞系对PRV复制的影响;最后对PRV的吸附、进入以及复制阶段的试验探究敲低TSG 101基因对于PRV感染有影响的阶段。结果表明,1)本研究所构建的细胞系中TSG101的表达明显降低,并将该细胞系命名为sh-TSG101细胞系;2)细胞活性检测结果显示,敲低TSG 101基因对细胞活性及生长情况无显著影响;3)使用PRV-GFP、PRV-QXX感染sh-TSG101,体外试验证明敲低TSG 101对PRV的增殖有显著的抑制作用。4)病毒的吸附、进入以及复制试验证明,敲低TSG 101在PRV的复制阶段有明显的抑制作用。综上,本研究成功构建TSG 101基因敲低的PK15细胞系,体外敲低TSG101能够显著抑制PRV增殖,为PRV等DNA病毒性疾病的防控提供了新思路,并为进一步探究TSG101调控PRV感染的分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 肿瘤易感基因101 伪狂犬病病毒 pk15细胞

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猪圆环病毒2型基因1群B亚簇的体外培养特征 被引量：1

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作者 罗维 赵墩 +2 位作者 吴海超 蒋大良 余兴龙 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期534-538,共5页

为探寻猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中的复制特征,将PCV2基因1群B亚簇(PCV2–1B)病毒感染PK15均质细胞A10,待感染细胞层长满,对其进行连续传代;对第5、6代细胞进行维持培养,即在细胞长满后隔天更换培养基,以维持细胞良好的生长;用第1... 为探寻猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中的复制特征,将PCV2基因1群B亚簇(PCV2–1B)病毒感染PK15均质细胞A10,待感染细胞层长满,对其进行连续传代;对第5、6代细胞进行维持培养,即在细胞长满后隔天更换培养基,以维持细胞良好的生长;用第10代带毒细胞的培养液接种A10细胞,并进行换液维持培养。PCR与定量PCR检测结果表明,PCV2–1B病毒感染A10细胞后,其病毒基因组的含量在感染细胞长满之前(约96 h)随着细胞的增多而上升,同时也随着传代次数的增多而上升;换液维持培养的细胞,在维持10 d后PCV2–1B病毒基因组的含量能维持在107～108拷贝/mL,而第10代带毒细胞的培养液接毒A10之后,病毒基因组含量随细胞增多而上升,在达到约108拷贝/mL后,病毒基因组含量维持在107～108拷贝/mL。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 复制动态 pk15细胞 毒株

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Ctr1mRNA表达水平与细胞内CuZn-SOD活性的相关性 被引量：2

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作者 付世新 夏成 +2 位作者 李鹏 沈冰蕾 王长远 《黑龙江八一农垦大学学报》 2010年第4期64-67,共4页

采用半定量RT-PCR法检测不同铜水平对猪传代肾细胞（PK15）中特异性铜转运蛋白Ctr1基因mRNA表达水平的影响,以β-actin为内参考,对各试验组cDNA同时进行PCR扩增;采用黄嘌呤氧化酶法对各实验组细胞内CuZn-SOD活性进行检测。猪肾PK15细胞C... 采用半定量RT-PCR法检测不同铜水平对猪传代肾细胞（PK15）中特异性铜转运蛋白Ctr1基因mRNA表达水平的影响,以β-actin为内参考,对各试验组cDNA同时进行PCR扩增;采用黄嘌呤氧化酶法对各实验组细胞内CuZn-SOD活性进行检测。猪肾PK15细胞Ctr1基因mRNA表达量在铜添加量在7.8～62.5μmoL·L-1范围时,其表达量呈双相反应;实验各组细胞内CuZn-SOD活性均高于对照组（P〈0.05）,以Ⅳ组与其它各组差异显著（P〈0.05）。细胞表面Ctr1基因mRNA的表达量与细胞内CuZn-SOD活性呈反向性关系。 展开更多

关键词 铜 pk15细胞 Ctr1mRNA CuZn-SOD活性

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T-2毒素致猪肾细胞损伤及氧化应激相关机理的研究 被引量：1

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作者 熊款款 吴映欣 +1 位作者 易思亮 杨凌宸 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第12期4710-4717,共8页

试验旨在研究T-2毒素对猪肾细胞(PK15)的毒性作用及其氧化应激反应。用不同浓度的T-2毒素处理细胞,通过MTT法检测细胞活性、测定细胞内乳酸脱氢酶(LDH)释放率及苏木素伊红(HE)染色观察细胞形态变化评估T-2毒素对细胞的毒性作用;通过检... 试验旨在研究T-2毒素对猪肾细胞(PK15)的毒性作用及其氧化应激反应。用不同浓度的T-2毒素处理细胞,通过MTT法检测细胞活性、测定细胞内乳酸脱氢酶(LDH)释放率及苏木素伊红(HE)染色观察细胞形态变化评估T-2毒素对细胞的毒性作用;通过检测细胞内的活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽(GSH)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性,评估不同剂量T-2毒素对细胞氧化应激水平的影响;检测Nrf2-ARE信号通路相关基因Nrf2、Keap1、GPx-1、Nqo1及Hmox1 mRNA的表达水平,分析T-2毒素对该信号通路的影响。结果表明,PK15细胞活性呈毒素剂量依赖性下降(P<0.05),LDH释放率呈毒素剂量依赖性上调(P<0.05);随T-2毒素剂量升高,细胞间隙逐渐增加,细胞固缩,细胞数量也随之减少。细胞内ROS阳性细胞率呈剂量依赖性升高,且T-2毒素为100 nmol/L时,ROS阳性细胞率显著高于其他剂量组(P<0.05);细胞内MDA含量与GPx活性呈毒素剂量依赖性升高(P<0.05),而GSH含量呈毒素剂量依赖性下降(P<0.05)。20、50及100 nmol/L的T-2毒素可显著上调Keap1、Gpx-1及Nqo1基因mRNA的相对表达量(P<0.05),且50 nmol/L的相对表达量最高。T-2毒素对K15细胞有毒性作用,可诱导其氧化损伤,且该氧化应激过程受Nrf2-AER信号通路调控。 展开更多

关键词 T-2毒素 pk15细胞 毒性作用 氧化应激 Nrf2-ARE通路

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他莫昔芬对猪伪狂犬病病毒体外增殖的影响

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作者 邢嘉友 樊文杰 +5 位作者 王昱旻 鲁秀香 宋月 褚贝贝 王江 王梦迪 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第11期4503-4512,共10页

【目的】研究他莫昔芬(Tamoxifen)在PK15细胞模型上对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染的抗病毒作用。【方法】以PK15细胞为模型,采用CCK-8细胞计数法检测他莫昔芬对细胞活力的影响;利用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒检测他... 【目的】研究他莫昔芬(Tamoxifen)在PK15细胞模型上对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染的抗病毒作用。【方法】以PK15细胞为模型,采用CCK-8细胞计数法检测他莫昔芬对细胞活力的影响;利用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒检测他莫昔芬对细胞周期和凋亡的影响;利用CytoFLEX流式细胞仪和荧光显微镜检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-GFP后病毒增殖的差异;利用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后PRV gB基因mRNA和蛋白表达水平的变化;利用病毒滴度测定法检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后对病毒的抑制情况。【结果】他莫昔芬用药浓度在6μmol/L时对细胞活力无影响;在6μmol/L以下时,与空白组相比,他莫昔芬处理组对细胞周期与凋亡没有显著影响(P>0.05)。在同一时间点,他莫昔芬处理组PRV-GFP在PK15细胞中的增殖速度极显著低于对照组(P<0.01);实时荧光定量PCR结果表明,他莫昔芬处理后极显著抑制了PRV gB基因mRNA在PK15细胞中的表达(P<0.01);Western blotting结果显示,不同给药浓度同一时间点,他莫昔芬都显著或极显著抑制了PRV gB蛋白的表达(P<0.05;P<0.01);病毒滴度测定结果表明,在PK15细胞中,同一时间点他莫昔芬处理组的PRV-QXX子代病毒的复制速度显著或极显著低于对照组(P<0.05;P<0.01)。【结论】他莫昔芬能显著抑制PRV在PK15细胞中的增殖。 展开更多

关键词 他莫昔芬 伪狂犬病病毒(PRV) 猪肾上皮细胞 抗病毒作用

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Toll样受体7基因敲除对水疱性口炎病毒增殖的影响

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作者 孟洁洁 宋月 +6 位作者 樊文杰 杨乐 邢嘉友 王江 褚贝贝 杨国宇 王梦迪 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2011-2021,共11页

【目的】探究敲除Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)基因对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)复制的影响。【方法】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞(porcine renal epi... 【目的】探究敲除Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)基因对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)复制的影响。【方法】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞(porcine renal epithelial cells,PK15)系。通过构建pTLR7-sgRNA重组质粒并转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到PK15-TLR7^(-/-)多克隆细胞,并在Western blotting鉴定后通过有限稀释法获得PK15-TLR7^(-/-)单克隆稳定细胞系。为验证敲除TLR7基因稳定细胞系是否构建成功,分别利用光学显微镜和细胞毒性检测(cell counting kit 8,CCK-8)观察并检测PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞的形态与活力;利用荧光倒置显微镜和流式细胞术观察VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞后病毒增殖情况;利用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞后GFP蛋白和VSV-N基因mRNA水平的表达情况;利用病毒滴度检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞后子代病毒产生情况。【结果】采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的3种sgRNA均对TLR7进行了有效的编辑,其中sgRNA2的基因编辑效率最高,但敲除TLR7基因并不影响PK15细胞的形态及活力;当感染VSV-GFP后,通过荧光显微镜观察发现,荧光强度随着时间逐次增加,且PK15-TLR7^(-/-)细胞的GFP荧光强度强于PK15细胞。流式细胞术检测结果显示,相同时间点的PK15-TLR7^(-/-)细胞感染VSV-GFP的比例显著或极显著高于PK15细胞(P<0.05;P<0.01);实时荧光定量PCR结果表明,感染4~36 h VSV-N基因mRNA相对表达量随着时间逐渐增加,且PK15细胞中VSV-N基因的mRNA相对表达量显著或极显著低于PK15-TLR7^(-/-)细胞(P<0.05;P<0.01);Western blotting结果表明,PK15与PK15-TLR7^(-/-)细胞中的VSV-GFP GFP蛋白均从6 h开始表达,表达量随时间逐渐增多,且在PK15-TLR7^(-/-)细胞中VSV-GFP GFP蛋白含量比PK15细胞更高;感染VSV-GFP 6 h后子代病毒开始释放,此时PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度低于PK15-TLR7^(-/-)细胞(P>0.05),但PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度随着感染时间的增加显著或极显著低于PK15-TLR7^(-/-)细胞(P<0.05;P<0.01)。【结论】TLR7基因的敲除可以促进VSV在PK15细胞中的复制,初步验证了TLR7在天然免疫中的作用,为VSV等RNA病毒性疾病的防控提供新思路。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 TLR7基因 猪肾上皮细胞(pk15) 水疱性口炎病毒(VSV)

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