结核分支杆菌Mtb8.4真核、原核表达质粒的构建与表达 被引量：2

1

作者 杨宏倩 李博 +1 位作者 蔡宏 朱玉贤 《动物医学进展》 CSCD 2006年第1期54-57,共4页

低分子质量蛋白抗原Mtb8.4是一种非常重要的结核分支杆菌抗原,为了研制结核病核酸疫苗和进行结核病的诊断,分别将其构建到原核和真核载体中进行表达。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因Mtb8.4,扩增产物酶切... 低分子质量蛋白抗原Mtb8.4是一种非常重要的结核分支杆菌抗原,为了研制结核病核酸疫苗和进行结核病的诊断,分别将其构建到原核和真核载体中进行表达。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因Mtb8.4,扩增产物酶切后分别克隆到真核表达载体pJW4303和原核表达载体pGEX-4T-1中,构成重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4,用限制性内切酶消化,PCR扩增及DNA序列分析等多种方法鉴定;并将正确构建的原核表达载体转入E.coliBL21(DE3)plysS中,IPTG诱导表达。结果表明,重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4构建成功。构建的真核重组质粒pJW-Mtb8.4即可作为结核病DNA疫苗。原核表达载体pGEX-Mtb8.4在BL21(DE3)plysS中成功表达,将表达蛋白进行纯化,作为保护性结核分支杆菌抗原以便检测DNA疫苗的免疫效果。 展开更多

关键词 结核病 mtb8.4重组原核表达载体 核酸疫苗

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人ureb1在大肠杆菌中高效表达及其抗体的制备 被引量：5

2

作者 明文玉 林学颜 +1 位作者 银巍 顾军 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期228-231,共4页

目的 :构建人的ureb1(hureb1)原核高效表达重组质粒 ,以此表达的外源蛋白为抗原制备抗ureb1的抗体。方法 :用XhoI/NotI从pGU 2质粒酶切得到hureb1的ORF与pGEX 4T 2的XhoI/NotI大片段连接 ,构建表达GST hureb1融合蛋白的重组载体。转化... 目的 :构建人的ureb1(hureb1)原核高效表达重组质粒 ,以此表达的外源蛋白为抗原制备抗ureb1的抗体。方法 :用XhoI/NotI从pGU 2质粒酶切得到hureb1的ORF与pGEX 4T 2的XhoI/NotI大片段连接 ,构建表达GST hureb1融合蛋白的重组载体。转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达。以粗制的GST hureb1融合蛋白分别免疫大白兔和小鼠 ,制备抗hureb1的多克隆抗体和单克隆抗体 ,采用WesternBlot进行特异性鉴定。结果 :构建了高效表达GST hureb1融合蛋白的原核表达载体 ,融合蛋白的表达量占菌体蛋白质总量的 33 45 %。以大肠杆菌表达的GST hureb1融合蛋白免疫动物制备了高滴度、高特异性的抗hureb1的抗体。结论 :利用重组GST hureb1融合蛋白免疫动物可获得高滴度的抗hureb1抗体。重组GST 展开更多

关键词 人ureb1 DNA 重组 原核表达载体 抗体 大肠杆菌 重组融合蛋白 质粒

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猪圆环病毒2型ORF2截短基因的原核表达与纯化 被引量：4

3

作者 林彦星 孙彦伟 +3 位作者 刘镇明 徐铮 鲁俊鹏 龚善中 《动物医学进展》 CSCD 2006年第12期66-70,共5页

对重组原核表达载体pET-ORF2的表达条件进行优化,结果表明,最佳IPTG诱导浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时间为5h。在最佳诱导条件下获得猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的基础上,利用HisBind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,再分别用SDS-PAGE... 对重组原核表达载体pET-ORF2的表达条件进行优化,结果表明,最佳IPTG诱导浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时间为5h。在最佳诱导条件下获得猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的基础上,利用HisBind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,再分别用SDS-PAGE电泳和Westernblotting对纯化产物的纯化效果及特异性进行检测,结果显示表达产物纯化良好,并能被PCV-2阳性血清识别,具有良好的抗原性。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 重组原核表达载体 重组CAP蛋白 表达 纯化

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肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域研究 被引量：3

4

作者 韩旭 于潜 +4 位作者 田野 赵希彤 张磊 周镝 田大力 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期678-681,共4页

目的明确肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域。方法通过转化技术,在E.coli BL21(DE3)中诱导表达前期研究获得的表达载体pGEX-4T-1-ABCE1-55,获得GST-ABCE1-55重组融合蛋白表达,应用GST pull-down的方法验证p G... 目的明确肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域。方法通过转化技术,在E.coli BL21(DE3)中诱导表达前期研究获得的表达载体pGEX-4T-1-ABCE1-55,获得GST-ABCE1-55重组融合蛋白表达,应用GST pull-down的方法验证p GEX-4T-1-ABCE1-55与β-肌动蛋白有无相互作用。结果 GST-ABCE1-55是带有GST标签的含有357个氨基酸的重组蛋白,大小约66×10~3,在GST pull-down实验中,GST-ABCE1-55并不能与β-肌动蛋白特异结合。结论肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域应位于ABCE1蛋白第358位至第600位编码氨基酸中。 展开更多

关键词 ATP结合盒转运子E1 pGEX-4T-1原核表达载体 重组蛋白表达 蛋白质相互作用结构域

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猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因原核表达载体的构建与表达 被引量：2

5

作者 刘成倩 王静 +3 位作者 于宗幸 李红 易建中 陈磊 《上海农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第2期22-25,共4页

根据GenBank上已公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物,用RT-PCR方法扩增出去除部分疏水区的PRRSV-M基因,并将其克隆到原核表达载体PET-30a上,得到重组质粒PET-30a-M。将重组质粒转化大肠杆菌transetta(DE3)感受态细... 根据GenBank上已公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物,用RT-PCR方法扩增出去除部分疏水区的PRRSV-M基因,并将其克隆到原核表达载体PET-30a上,得到重组质粒PET-30a-M。将重组质粒转化大肠杆菌transetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳及Western blot分析,显示重组蛋白分子量约1 5.7 kD,且此蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 M基因 原核表达 表达载体 重组蛋白

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结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达 被引量：2

6

作者 陈全 朱道银 +2 位作者 骆旭东 蒋英 江山 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2003年第3期284-287,333,共5页

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体... 目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 1hp—esat6融合基因 重组CFP10一ESAT6 原核表达

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人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定 被引量：2

7

作者 程岚 束蓉 +3 位作者 薛京伦 陈金中 田聆 方煜翔 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期811-814,共4页

目的构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测... 目的构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm。经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别。结论成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm。大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 重组人釉原蛋白 原核表达载体 融合蛋白

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人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建 被引量：2

8

作者 张巧 赵国强 +4 位作者 刘红梅 宫亚欧 丁兰萍 薛乐勋 杨胜利 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2005年第3期411-413,共3页

中图分类号Q782摘要目的:构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法:用RTPCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEMTEasy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝白筛选、PC... 中图分类号Q782摘要目的:构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法:用RTPCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEMTEasy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega2.0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX4T1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Westernblot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果:PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98.73%,氨基酸序列同源性为99.68%。Westernblot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28.4%。结论:成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。 展开更多

关键词 人端粒酶逆转录酶 原核表达载体 重组质粒

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人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化 被引量：2

9

作者 杨芳 贺智敏 +4 位作者 孙颖 陈主初 严斌 黄宏科 李廷宝 《湖南医科大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第6期583-586,共4页

目的 :体外表达人源性MT 1E融合蛋白并进行纯化。方法 :采用RT PCR方法获得人MT 1E基因的编码区 ,将其克隆入原核表达载体pQE4 0 ,并在大肠杆菌M15中表达 ,对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析 ,用Ni NTagarose亲和层析柱纯化目的蛋白... 目的 :体外表达人源性MT 1E融合蛋白并进行纯化。方法 :采用RT PCR方法获得人MT 1E基因的编码区 ,将其克隆入原核表达载体pQE4 0 ,并在大肠杆菌M15中表达 ,对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析 ,用Ni NTagarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果 :重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在 ,但以不可溶性形式为主 ,表达量随诱导时间延长而增加 ,在诱导 8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的 32 %。经亲和层析获得较高纯度的人MT 1E融合蛋白。结论 :利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT 1E融合蛋白 ,为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。 展开更多

关键词 金属硫蛋白 原核融合表达载体 重组融合蛋白 亲和层析

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重组HMGB1-A盒蛋白对小鼠单核细胞的抗炎作用 被引量：2

10

作者 刘婷 贺永文 陈西柳 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期298-303,共6页

目的:观察高迁移率蛋白B1-A盒蛋白(HMGB1-Abox)对小鼠单核细胞系在脂多糖(LPS)刺激下表达HMGB1的影响和动态变化以及对炎性因子分泌的抑制作用。方法:利用克隆载体构建PET28a-HMGB1-Abox原核质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-... 目的:观察高迁移率蛋白B1-A盒蛋白(HMGB1-Abox)对小鼠单核细胞系在脂多糖(LPS)刺激下表达HMGB1的影响和动态变化以及对炎性因子分泌的抑制作用。方法:利用克隆载体构建PET28a-HMGB1-Abox原核质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)诱导后经Ni2+-NTA树脂亲和纯化得到目的蛋白;以不同浓度的重组HMGB1-Abox蛋白作用于LPS刺激的小鼠单核细胞系RAW264.7,CCK8试剂盒检测其对小鼠单核细胞活力的影响。以PBS和重组HMGB1-Abox蛋白为对照组和实验组,于2、6、12、24、48小时检测其细胞上清中的TNF-α、IL-1β的含量,Western blot、免疫荧光法观察细胞中HMGB1的表达、RT-PCR检测细胞中HMGB1-mRNA变化趋势。结果:成功构建PET28a-HMGB1-Abox原核质粒并纯化出大约为14 kD的目的蛋白。小鼠单核细胞活力与重组HMGB1-Abox蛋白浓度及作用时间呈正相关;实验组细胞上清TNF-α、IL-1β的含量较对照组显著下降;Western blot及免疫荧光检测提示实验组细胞中HMGB1表达不断减少;细胞中HMGB1-mR-NA含量及峰值均较对照组显著减少且延后。结论:重组HMGB1-Abox蛋白可以显著减少小鼠单核细胞在受到LPS刺激时HMGB1的表达和分泌,从而有效的阻断HMGB1对其他早期炎性因子的促进作用,减少炎性因子的分泌,有较强的抗炎作用。 展开更多

关键词 HMGB1-A盒蛋白 原核构建 蛋白纯化 小鼠单核细胞系

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猪和小鼠endoglin原核表达载体的构建及重组蛋白的诱导表达和纯化

11

作者 谭光宏 魏于全 +1 位作者 田聆 黄风迎 《海南医学院学报》 CAS 2006年第1期1-6,共6页

目的:体外扩增猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,构建猪和小鼠endoglin重组原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行分离、纯化和鉴定。方法:设计猪和小鼠endoglin胞外段基因序列的引物,利用RT-PCR技术扩增克隆猪和小鼠endog... 目的:体外扩增猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,构建猪和小鼠endoglin重组原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行分离、纯化和鉴定。方法:设计猪和小鼠endoglin胞外段基因序列的引物,利用RT-PCR技术扩增克隆猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,通过限制性核酸内切酶酶切,然后用T7酶连接,构建猪和小鼠endoglin胞外段的原核表达质粒pQE-pEDG和pQE-mEDG。筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定等证实正确后,再转染感受态大肠杆菌JM109,用IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲合层析进行分离纯化,最后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定。结果:琼脂糖凝胶电泳发现扩增克隆的猪和小鼠endoglin胞外段基因序列分子量大小和预期值相一致,酶切分析显示,pQE-pEDG和pQE-mEDG和预期值相符,DNA序列测定显示,目的基因片段和阅读框架正确无误。重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达,表达的重组蛋白分子量与预期值相一致,纯化的蛋白浓度达90%以上,抗小鼠endoglin抗体可特异性识别pEDG和mEDG。结论:成功构建了猪和小鼠endoglin的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达并纯化,为进一步了解重组endoglin蛋白质作为疫苗是否可以有效诱导产生抗自身endoglin的免疫反应奠定了基础。 展开更多

关键词 ENDOGLIN 重组蛋白质 原核表达栽体

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河南华溪蟹金属硫蛋白原核表达载体的构建 被引量：1

12

作者 张志明 马文丽 +1 位作者 李涌泉 王兰 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第26期16132-16133,共2页

[目的]构建河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)金属硫蛋白(MT)的原核表达载体。[方法]以大肠杆菌DH-5α中的pGEM-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段并连接至pGEM-T载体。然后,亚克隆至pQE31表达载体,转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞。[结果]PC... [目的]构建河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)金属硫蛋白(MT)的原核表达载体。[方法]以大肠杆菌DH-5α中的pGEM-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段并连接至pGEM-T载体。然后,亚克隆至pQE31表达载体,转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞。[结果]PCR扩增目的片段产物大小约为220 bp,与预期大小一致。重组质粒pQE31-MT双酶切鉴定结果也与预期相符。[结论]成功构建了MT原核表达载体,为今后表达并纯化MT提供了材料。 展开更多

关键词 金属硫蛋白 基因重组 表达载体pQE31 原核表达

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MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达 被引量：1

13

作者 余美华 张姝芳 +4 位作者 倪晓敏 袁进强 胡巧玲 万文彬 杨仙玉 《安徽农业科学》 CAS 2013年第18期7742-7744,7977,共4页

[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落... [目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。 展开更多

关键词 MCL-1 原核表达载体 重组蛋白表达

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TIA抗原基因原核表达载体的构建及表达 被引量：1

14

作者 吴世锴 田和 +3 位作者 沈思 卢浩 刘霁月 王昊 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期1-9,共9页

目的:克隆并构建短暂性脑缺血发作重组cDNA表达克隆血清学鉴定技术(SEREX)抗原基因原核表达载体,重组GST融合蛋白.方法:采用SEREX筛选所获的70个重组cDNA克隆pBluescript质粒,用限制性内切酶(EcoRⅠ/XhoⅠ、BamHⅠ/XhoⅠ或SmaⅠ/XhoⅠ)... 目的:克隆并构建短暂性脑缺血发作重组cDNA表达克隆血清学鉴定技术(SEREX)抗原基因原核表达载体,重组GST融合蛋白.方法:采用SEREX筛选所获的70个重组cDNA克隆pBluescript质粒,用限制性内切酶(EcoRⅠ/XhoⅠ、BamHⅠ/XhoⅠ或SmaⅠ/XhoⅠ)双酶切,用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳分离回收目的基因片段.应用Ligation和In-Fusion基因重组技术,将目的基因插入原核表达载体质粒pGEX-4T-1,2,3,转化表达菌株E.coli BL-21感受态细胞,并用IPTG诱导GST标签蛋白表达,通过SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,再经酶切及DNA测序鉴定,成功重组pGEX-4T载体的插入片段可以作为候选靶抗原.结果:成功获得21个重组pGEX-4T载体的靶抗原目的基因,均能够在原核表达系统中成功表达GST融合目的蛋白.结论:应用Ligation和In-Fusion基因重组技术能够有效构建原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组融合目的蛋白. 展开更多

关键词 短暂性脑缺血发作 SEREX 抗原基因 基因重组

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鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达 被引量：1

15

作者 李仙春 芦艳 +4 位作者 毛耀芳 杨海峰 余海山 马永华 万学瑞 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第12期2138-2146,共9页

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp... 试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-Ch Prnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。 展开更多

关键词 鸡 Prnp基因 重组表达载体 原核表达

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马缨杜鹃查尔酮异构酶(RdCHI1)重组蛋白的制备及功能验证 被引量：1

16

作者 王聿晗 孙世宇 +2 位作者 鞠志刚 孙威 徐小蓉 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期574-582,共9页

【目的】制备马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因表达的重组蛋白并验证其活性,为解析查尔酮异构酶功能提供理论依据,为改良植物花色、增加药用成分奠定基础。【方法】根据所获得的马缨杜鹃查尔... 【目的】制备马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因表达的重组蛋白并验证其活性,为解析查尔酮异构酶功能提供理论依据,为改良植物花色、增加药用成分奠定基础。【方法】根据所获得的马缨杜鹃查尔酮异构酶RdCHI1基因的序列信息设计引物,构建其原核表达载体,优化RdCHI1可溶性重组蛋白最佳诱导表达条件,制备可溶性重组蛋白并检测其活性。【结果】成功构建RdCHI1原核表达载体,RdCHI1重组蛋白可在上清中表达,最佳诱导条件为:15℃、36 h,IPTG浓度0.35 mmol·L^(-1)。经镍柱纯化得到质量较好的RdCHI1重组蛋白,通过体外酶活反应确定,与对照组相比,RdCHI1可以更快地催化柚皮素查尔酮(Naringenin chalcone)反应生成柚皮素(Naringenin)。【结论】RdCHI1为I型CHI,可极大提高柚皮素查尔酮生成柚皮素的速率,增加黄酮类物质积累量。 展开更多

关键词 马缨杜鹃 查尔酮异构酶 原核表达载体 可溶性重组蛋白 酶活测定

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促Treg细胞生成及活化重组分子的构建与表达

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作者 张倩 齐共健 +4 位作者 王东洋 张建军 陈翀 曾令宇 徐开林 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2011年第5期1250-1254,共5页

本研究旨在构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并鉴定其表达。应用RT-PCR获得人TGF-β1及HIV被膜蛋白gp120的C2-C4区基因并将其克隆至pCR2.1 T载体,酶切制备人TGF-β1及C2-C4区DNA片段,通过PCR定向连接两目的片段至原... 本研究旨在构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并鉴定其表达。应用RT-PCR获得人TGF-β1及HIV被膜蛋白gp120的C2-C4区基因并将其克隆至pCR2.1 T载体,酶切制备人TGF-β1及C2-C4区DNA片段,通过PCR定向连接两目的片段至原核表达载体pET-28a,生成pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使用0.1 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达,以Western blot方法鉴定表达结果。结果表明,成功扩增人TGF-β1及C2-C4区基因并分别克隆入pCR2.1-T载体,经亚克隆构建了重组蛋白的原核表达质粒pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,并转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞获得工程菌株,通过IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式获得表达。结论:本研究成功构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并获得原核表达。 展开更多

关键词 调节性T细胞 原核表达 重组蛋白

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