期刊导航
期刊开放获取
上海教育软件发展有限公..
期刊文献
+
任意字段
题名或关键词
题名
关键词
文摘
作者
第一作者
机构
刊名
分类号
参考文献
作者简介
基金资助
栏目信息
任意字段
题名或关键词
题名
关键词
文摘
作者
第一作者
机构
刊名
分类号
参考文献
作者简介
基金资助
栏目信息
检索
高级检索
期刊导航
共找到
2
篇文章
<
1
>
每页显示
20
50
100
已选择
0
条
导出题录
引用分析
参考文献
引证文献
统计分析
检索结果
已选文献
显示方式：
文摘
详细
列表
相关度排序
被引量排序
时效性排序
一种能实现蛋白可逆表达的敲入载体构建方法
被引量：
1
1
作者
王金霞
徐影琪
+3 位作者
魏政立
杨葳
张梅英
郑志红
《辽宁农业科学》
2016年第4期27-32,共6页
在细胞或小鼠中使用Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme,即环化重组酶)条件性地删除或修饰基因是不可逆的,基因删除后蛋白不能恢复表达。FK506-雷怕霉素结合蛋白FKBP L106P不稳定结构域(FKBP L106P destabilization domain)DD-...
在细胞或小鼠中使用Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme,即环化重组酶)条件性地删除或修饰基因是不可逆的,基因删除后蛋白不能恢复表达。FK506-雷怕霉素结合蛋白FKBP L106P不稳定结构域(FKBP L106P destabilization domain)DD-C-Shield1系统可以解决这个问题,能人为控制蛋白表达或降解,避免胚胎致死。本实验以小GTP酶腺苷二磷酸核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6,ARF6)为例,借助EL350细菌中Red/ET重组作用,使用DD-C-Shield1系统和重叠延伸PCR方法,发展一种通用的可实现蛋白可逆表达的构建敲入载体的方法。该方法缩短了构建时间,减少了重组的步骤,不需要使用rps L-neo DNA、链霉素和酶切位点。此敲入载体两侧同源臂5 kb左右,可用传统的ES打靶方法构建敲入小鼠,经过简单改造也可使用CRISPR/Cas9方法构建敲入细胞或小鼠模型,从而在细胞和动物模型中进行条件性修饰、快速、可逆地调节特异性蛋白表达,以利于发育学研究,为细胞和活体生物严谨调控蛋白功能提供了一种新的策略。
展开更多
关键词
FKBP(L106P)不稳定结构域(DD-C)
Shield1
敲入载体
重叠延伸PCR
可逆降解
在线阅读
下载PDF
职称材料
基于episomal CRISPR/Cas9载体的基因敲入方法
2
作者
邹征伟
赖兴强
李伟强
《中山大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第5期660-668,共9页
【目的】研究一种在哺乳动物细胞中高效的基因敲入方法,比较带有oriP-EBNA1序列的episomal CRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体的基因敲入效率是否有差别。【方法】首先利用慢病毒载体构建稳定表达红色荧光蛋白DsRedE2的人胚肾细胞系...
【目的】研究一种在哺乳动物细胞中高效的基因敲入方法,比较带有oriP-EBNA1序列的episomal CRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体的基因敲入效率是否有差别。【方法】首先利用慢病毒载体构建稳定表达红色荧光蛋白DsRedE2的人胚肾细胞系(293FT)与人诱导多能干细胞系(hiPS);利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计和合成靶向DsRedE2的向导RNA(sgRNA),分别克隆至带有oriP-EBNA1的episomal CRISPR/Cas9敲除载体与普通CRISPR/Cas9敲除载体中,测序筛选插入正确片段的克隆;然后设计靶向DsRedE2的同源臂,把同源臂连接在绿色荧光蛋白(GFP)的两端,构建GFP敲入片段的载体。把两种敲除载体分别导入到DsRedE2-293FT与DsRedE2-hiPS细胞系中,在不同时间点通过荧光显微镜观察以及流式细胞分析比较细胞的敲除效率,同时利用PCR检测靶基因的敲除情况;在筛选获得有效的sgRNA片段后,把两种敲除载体和同源臂同时导入到DsRedE2-293FT与DsRedE2-hiPS细胞系中,在不同时间通过荧光显微镜观察以及流式细胞分析比较细胞的敲入效率,同时利用PCR检测DsRedE2序列中GFP的敲入情况。【结果】成功构建表达DsRedE2的293FT与hiPS细胞系;获得靶向DsRedE2的episomal CRISPR/Cas9敲除载体、普通CRISPR/Cas9敲除载体及带有GFP的同源臂载体;荧光显微镜观察与流式细胞分析结果显示,转染两种CRISPR/Cas9质粒均可以使DsRedE2阳性细胞明显减少,而且episomal CRISPR/Cas9质粒组的DsRedE2阳性细胞数量显著低于转染普通CRISPR/Cas9质粒组。同时,敲入实验证实episomal CRISPR/Cas9组的GFP阳性细胞数量比普通CRISPR/Cas9组更多;TA克隆测序证实打靶位点有敲除与敲入片段。【结论】episomal CRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体在细胞上都能实现基因的敲除与敲入;带有oriP-EBNA1序列的episomal CRISPR/Cas9载体敲除和敲入的效率均比普通CRISPR/Cas9载体高。以上结果为利用episomal CRISPR/Cas9载体进行人多能干细胞的基因敲入研究和谱系追踪动物模型的建立提供了重要的实验基础。
展开更多
关键词
CRISPR/Cas9
episomal载体
敲除
敲入
在线阅读
下载PDF
职称材料
题名
一种能实现蛋白可逆表达的敲入载体构建方法
被引量：
1
1
作者
王金霞
徐影琪
魏政立
杨葳
张梅英
郑志红
机构
中国医科大学实验动物部/辽宁省转基因动物研究重点实验室
出处
《辽宁农业科学》
2016年第4期27-32,共6页
基金
辽宁省科学技术计划项目(2012408002)
文摘
在细胞或小鼠中使用Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme,即环化重组酶)条件性地删除或修饰基因是不可逆的,基因删除后蛋白不能恢复表达。FK506-雷怕霉素结合蛋白FKBP L106P不稳定结构域(FKBP L106P destabilization domain)DD-C-Shield1系统可以解决这个问题,能人为控制蛋白表达或降解,避免胚胎致死。本实验以小GTP酶腺苷二磷酸核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6,ARF6)为例,借助EL350细菌中Red/ET重组作用,使用DD-C-Shield1系统和重叠延伸PCR方法,发展一种通用的可实现蛋白可逆表达的构建敲入载体的方法。该方法缩短了构建时间,减少了重组的步骤,不需要使用rps L-neo DNA、链霉素和酶切位点。此敲入载体两侧同源臂5 kb左右,可用传统的ES打靶方法构建敲入小鼠,经过简单改造也可使用CRISPR/Cas9方法构建敲入细胞或小鼠模型,从而在细胞和动物模型中进行条件性修饰、快速、可逆地调节特异性蛋白表达,以利于发育学研究,为细胞和活体生物严谨调控蛋白功能提供了一种新的策略。
关键词
FKBP(L106P)不稳定结构域(DD-C)
Shield1
敲入载体
重叠延伸PCR
可逆降解
Keywords
FKBP （L106P ） destabilization domain （DD-C ）
Shieldl
knockin vector
Overlap-extensionPCR
Reversibly degradation
分类号
Q813.6 [生物学—生物工程]
在线阅读
下载PDF
职称材料
题名
基于episomal CRISPR/Cas9载体的基因敲入方法
2
作者
邹征伟
赖兴强
李伟强
机构
中山大学中山医学院干细胞与组织工程研究中心
出处
《中山大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第5期660-668,共9页
基金
国家自然科学基金(81570487)
中山大学青年教师重点培育项目(17ykzd07)
文摘
【目的】研究一种在哺乳动物细胞中高效的基因敲入方法,比较带有oriP-EBNA1序列的episomal CRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体的基因敲入效率是否有差别。【方法】首先利用慢病毒载体构建稳定表达红色荧光蛋白DsRedE2的人胚肾细胞系(293FT)与人诱导多能干细胞系(hiPS);利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计和合成靶向DsRedE2的向导RNA(sgRNA),分别克隆至带有oriP-EBNA1的episomal CRISPR/Cas9敲除载体与普通CRISPR/Cas9敲除载体中,测序筛选插入正确片段的克隆;然后设计靶向DsRedE2的同源臂,把同源臂连接在绿色荧光蛋白(GFP)的两端,构建GFP敲入片段的载体。把两种敲除载体分别导入到DsRedE2-293FT与DsRedE2-hiPS细胞系中,在不同时间点通过荧光显微镜观察以及流式细胞分析比较细胞的敲除效率,同时利用PCR检测靶基因的敲除情况;在筛选获得有效的sgRNA片段后,把两种敲除载体和同源臂同时导入到DsRedE2-293FT与DsRedE2-hiPS细胞系中,在不同时间通过荧光显微镜观察以及流式细胞分析比较细胞的敲入效率,同时利用PCR检测DsRedE2序列中GFP的敲入情况。【结果】成功构建表达DsRedE2的293FT与hiPS细胞系;获得靶向DsRedE2的episomal CRISPR/Cas9敲除载体、普通CRISPR/Cas9敲除载体及带有GFP的同源臂载体;荧光显微镜观察与流式细胞分析结果显示,转染两种CRISPR/Cas9质粒均可以使DsRedE2阳性细胞明显减少,而且episomal CRISPR/Cas9质粒组的DsRedE2阳性细胞数量显著低于转染普通CRISPR/Cas9质粒组。同时,敲入实验证实episomal CRISPR/Cas9组的GFP阳性细胞数量比普通CRISPR/Cas9组更多;TA克隆测序证实打靶位点有敲除与敲入片段。【结论】episomal CRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体在细胞上都能实现基因的敲除与敲入;带有oriP-EBNA1序列的episomal CRISPR/Cas9载体敲除和敲入的效率均比普通CRISPR/Cas9载体高。以上结果为利用episomal CRISPR/Cas9载体进行人多能干细胞的基因敲入研究和谱系追踪动物模型的建立提供了重要的实验基础。
关键词
CRISPR/Cas9
episomal载体
敲除
敲入
Keywords
CRISPR/Cas9
episomal
vector
s
knockout
knockin
分类号
R31 [医药卫生—基础医学]
在线阅读
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
一种能实现蛋白可逆表达的敲入载体构建方法
王金霞
徐影琪
魏政立
杨葳
张梅英
郑志红
《辽宁农业科学》
2016
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
基于episomal CRISPR/Cas9载体的基因敲入方法
邹征伟
赖兴强
李伟强
《中山大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2018
0
在线阅读
下载PDF
职称材料
已选择
0
条
导出题录
引用分析
参考文献
引证文献
统计分析
检索结果
已选文献
上一页
1
下一页
到第
页
确定
用户登录
登录
IP登录
使用帮助
返回顶部
