HSV1-tk基因的部分DNA序列分析 被引量：2

1

作者 刘彦文 钟女奇 +2 位作者 都同功 黄冰 陈系古 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2000年第3期87-90,共4页

采用PCR技术从商品质粒pHSV10 6扩增出HSV1 tk基因 (112 8bp) ,PCR产物用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3,然后以重组质粒pcTK为模板 ,tk基因的 5′端引物为DNA测序引物进行部分DNA序列分析 .部分DNA序列分析证明PC... 采用PCR技术从商品质粒pHSV10 6扩增出HSV1 tk基因 (112 8bp) ,PCR产物用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3,然后以重组质粒pcTK为模板 ,tk基因的 5′端引物为DNA测序引物进行部分DNA序列分析 .部分DNA序列分析证明PCR产物为HSV1 tk基因正确无误 ,成功筛选到HSV1 tk基因的真核表达载体pcTK 。 展开更多

关键词 hsv1-tk 基因治疗 转基因动物 克隆 DNA序列分析

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HSV_1-TK基因转导人肺腺癌细胞A549体内外表达的研究 被引量：3

2

作者 何祥梁 郭先健 黄桂君 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第5期375-377,共3页

目的：观察ＴＫ基因转导Ａ５４９细胞后在体外和体内的表达。方法：将已构建的逆转录病毒表达载体ＰＬＸＳＮ－ＴＫ用电穿孔法转化Ａ５４９细胞，原位杂交检测ＴＫｍＲＮＡ在Ａ５４９－ＴＫ细胞和由它接种裸鼠形成肿瘤组织中的表达。斑... 目的：观察ＴＫ基因转导Ａ５４９细胞后在体外和体内的表达。方法：将已构建的逆转录病毒表达载体ＰＬＸＳＮ－ＴＫ用电穿孔法转化Ａ５４９细胞，原位杂交检测ＴＫｍＲＮＡ在Ａ５４９－ＴＫ细胞和由它接种裸鼠形成肿瘤组织中的表达。斑点杂交检测外源基因在细胞中整合。并体外观察Ａ５４９－ＴＫ细胞对ＧＣＶ的敏感性。结果：原位杂交表明Ａ５４９－ＴＫ细胞及由其所形成的肿瘤组织中ＴＫｍＲＮＡ表达阳性，对照细胞无表达，斑点杂交证明Ａ５４９－ＴＫ细胞中有ＴＫ基因整合。Ａ５４９－ＴＫ细胞对ＧＣＶ的敏感性是亲代细胞的４６倍。结论：ＴＫ基因在Ａ５４９－ＴＫ细胞中表达阳性，转基因细胞对ＧＣＶ敏感。 展开更多

关键词 肺肿瘤 丙氧鸟苷 腺癌 hsv1-tk 基因转导

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HSV1-TK逆转录病毒载体构建及表达 被引量：3

3

作者 何祥梁 蒋小忠 +2 位作者 何雪花 郭先健 黄桂君 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2001年第6期455-456,F004,共3页

目的　构建含ＴＫ基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达，为肺癌基因治疗积累实验资料。方法从 ＰＨＳＶ１０６质粒中切下约２．４ｋｂ ＴＫ基因片段，插入逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ多克隆位点，酶切筛选正、反向连接质粒。正... 目的　构建含ＴＫ基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达，为肺癌基因治疗积累实验资料。方法从 ＰＨＳＶ１０６质粒中切下约２．４ｋｂ ＴＫ基因片段，插入逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ多克隆位点，酶切筛选正、反向连接质粒。正 向连接子电穿孔法转化肺癌细胞Ａ５４９，用ＰＣＲ、细胞原位杂交法分别检测ＴＫ基因整合和表达。结果　经酶切鉴定得到 正向连接子，电穿孔法转导Ａ５４９细胞，经Ｇ４１８筛选出了转基因细胞，ＴＫ基因已整合在转染细胞中并阳性表达。结论 成功构建了含ＴＫ基因逆转录病毒载体，转导该载体的肺癌细胞可表达ＴＫ基因。 展开更多

关键词 逆转录病毒科 胸苷激酶 疱疹病毒1型 基因转染 hsv1-tk 肺癌

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HSV_1-TK/GCV系统对人肺腺癌细胞A549生物学特性的影响 被引量：2

4

作者 何祥梁 郭先健 黄桂君 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第9期872-874,共3页

目的　观察转TK基因肺癌细胞对丙氧鸟苷 (GCV)的敏感性及TK GCV系统杀灭肿瘤细胞机制。方法　观察转TK基因、转空载体A5 49细胞 (下分别简称A5 49 TK、A5 49 pLXSN)和A5 49细胞形态学改变、生长增殖特性。GCV对 3种细胞生长抑制 (MTT法 ... 目的　观察转TK基因肺癌细胞对丙氧鸟苷 (GCV)的敏感性及TK GCV系统杀灭肿瘤细胞机制。方法　观察转TK基因、转空载体A5 49细胞 (下分别简称A5 49 TK、A5 49 pLXSN)和A5 49细胞形态学改变、生长增殖特性。GCV对 3种细胞生长抑制 (MTT法 )。电镜、流式细胞仪观察A5 49 TK、A5 49细胞经 5 0μmol LGCV作用 3d后细胞凋亡。 结果　转基因细胞变为不规则 ,呈多角型 ,透亮度下降 ,体外增殖能力下降 ,A5 49 TK ,A5 49 pLXSN ,A5 493种细胞倍增时间分别为 42 .3 5、41.75、3 6.18h。依据IC5 0 ,A5 49 TK细胞对GCV敏感性比A5 49细胞提高 46倍 ,电镜发现A5 49 TK细胞有凋亡小体 ,核呈半月征等 ,流式细胞仪发现A5 49 TK、A5 49细胞亚G0 G1 期分别为 ( 12 .2 1± 1.76) %、( 1.3 2± 0 .47) % ,两者比较P <0 .0 1。结论　A5 49 TK细胞获得了对GCV敏感性 ,TK GCV杀灭肿瘤细胞与诱导凋亡有关。 展开更多

关键词 基因治疗 丙氧鸟苷 肺腺癌 hsv1-tk/GCV

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HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达 被引量：1

5

作者 李爱华 刘天承 田竟生 《首都医科大学学报》 CAS 1999年第2期83-85,共3页

通过ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ１ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ，以磷酸钙法转染ψ２，ＰＡ３１７包装细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞上清能... 通过ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ１ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ，以磷酸钙法转染ψ２，ＰＡ３１７包装细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３，细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ，最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。 展开更多

关键词 hsv1-tk基因 逆转录病毒载体 基因转移 基因重组

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Tat蛋白转导结构域介导HSV1-TK导入肝癌细胞及其效应

6

作者 曹利民 王炜煜 +7 位作者 赵晓蓉 叶庆 雷萍 刘静 代维 朱荫昌 司进 沈关心 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2006年第3期162-166,共5页

目的：探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果。方法：合成编码HIV-Tat47-57（Tat 11）的2条寡核苷酸单链，两端分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝... 目的：探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果。方法：合成编码HIV-Tat47-57（Tat 11）的2条寡核苷酸单链，两端分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果；以r-pAs16Dr为模板，通过PCR扩增HSV1-TK基因，定向克隆至原核表达载体pET-32中。将含pET-32c-Tat 11-TK的BL21菌通过IPTG诱导表达，表达产物用Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化，免疫组化分析重组蛋白Tat 11-TK的膜结合特性，蛋白印迹技术分析该融合蛋白的穿膜能力，检测和分析TK／GCV、Tat 11-TK／GCV对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果：表达产物SDS-PAGE在相对分子质量60700左右显示条带，符合Tat 11-TK与表达标签融合蛋白的理论值，并证明以包涵体的形式表达；通过Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化获得的Tat 11-TK重组融合蛋白，经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面，蛋白印迹结果说明Tat 11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内，同时应用低浓度前药更昔洛韦（GCV，150 μmol／L）能有效抑制HepG2细胞生长。结论：Tat 11-TK在原核系统获得高效表达，具有较强的穿膜能力和前药酶活性。 展开更多

关键词 HIV-1 TAT hsv1-tk 蛋白转导 肝癌 基因治疗

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HSV_1-TK转染人肺腺癌细胞A549的实验研究

7

作者 何祥梁 郭先健 +4 位作者 钱桂生 何雪花 黄桂君 陈维中 李淑萍 《中国肺癌杂志》 CAS 2001年第1期25-28,共4页

目的　体内外观察HSV1 TK/GCV对人肺腺癌细胞A5 49的杀伤效应。方法　构建含TK基因的逆转录病毒表达载体 ,电穿孔法转化肺癌细胞A5 49。MTT法检测转染细胞对GCV的药物敏感性 ,并观察旁观者效应 ;电镜、FCM、TUNEL法检测GCV诱导转染细... 目的　体内外观察HSV1 TK/GCV对人肺腺癌细胞A5 49的杀伤效应。方法　构建含TK基因的逆转录病毒表达载体 ,电穿孔法转化肺癌细胞A5 49。MTT法检测转染细胞对GCV的药物敏感性 ,并观察旁观者效应 ;电镜、FCM、TUNEL法检测GCV诱导转染细胞凋亡变化 ;PCR和细胞原位杂交分别检测转染细胞TK基因整合和表达 ;活体内观察GCV对转染细胞、亲代细胞接种裸鼠皮下肿瘤治疗效果。结果　转基因细胞变得较不规则 ,多角型 ,易形成空泡。A5 49、A5 49 PLXSN、A5 49 TK三种细胞体外倍增时间分别为 ( 3 6.15± 3 .2 7)、( 4 0 .82± 3 .75 )和 ( 4 2 .0 6± 4.12 )小时 (P >0 .0 5 )。转染细胞对GCV的敏感性比亲代细胞提高 46倍 (P<0 .0 0 1)。旁观者效应在高细胞密度接种 ( 1× 10 4细胞 /孔 )较低细胞密度接种 ( 1× 10 3细胞 /孔 )明显。电镜发现转染细胞有凋亡小体、核呈半月征。FCM、TUNEL均能检测到转染细胞凋亡发生率明显高于对照细胞 (P<0 .0 0 1)。PCR及原位杂交表明转染细胞有TK基因整合和表达。体内实验表明GCV能明显抑制转染细胞接种的肿瘤 ,而亲代细胞接种的肿瘤未受抑制。结论　转TK基因细胞在体内外都获得了对GCV的敏感性。TK/GCV系统杀灭肿瘤可能与诱导细胞凋亡有关。GCV能在活体内抑制转TK基因细胞裸鼠移? 展开更多

关键词 hsv1-tk基因 基因转移 基因治疗 细胞凋亡 肺腺癌

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HSV1-TK基因原核表达载体的构建及表达检测

8

作者 王丽群 孟祥晨 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期92-97,共6页

探讨自杀基因HSV1-TK原核表达情况,为进一步将细菌载体应用于肿瘤基因治疗奠定基础。首先以质粒pHSV-106为模板,通过PCR获得HSV1-TK基因克隆并将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接,重组质粒经鉴定后将其转化到E.coli BL21,观察其蛋白表达... 探讨自杀基因HSV1-TK原核表达情况,为进一步将细菌载体应用于肿瘤基因治疗奠定基础。首先以质粒pHSV-106为模板,通过PCR获得HSV1-TK基因克隆并将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接,重组质粒经鉴定后将其转化到E.coli BL21,观察其蛋白表达情况。结果表明,TK基因全长1 128 bp,与理论值相符。经测序发现插入到载体pGEX-6P-1上的DNA片段与TK基因的同源性为100%;SDS-PAGE可明显看出大小为41 ku的TK酶表达,并随时间的延长表达量不断增加。试验证明来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶能够实现原核表达,这一结果是应用细菌载体携带自杀基因TK治疗肿瘤的前提。 展开更多

关键词 hsv1-tk基因 原核表达 基因治疗 肿瘤

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HSV1-TK报告基因显像

9

作者 王辉 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第12期1292-1295,共4页

基因治疗中转泵的治疗基因在体内的定位、分布、持续时间和体内的表达缺乏有效的检测手段,是困扰基因治疗的一个难题。近年来,HSV1-TK报告基因显像已进行了广泛而又深入的研究,结果显示它可解决目前存在的这些问题。当前,报告基因显像... 基因治疗中转泵的治疗基因在体内的定位、分布、持续时间和体内的表达缺乏有效的检测手段,是困扰基因治疗的一个难题。近年来,HSV1-TK报告基因显像已进行了广泛而又深入的研究,结果显示它可解决目前存在的这些问题。当前,报告基因显像的焦点是选择何种报告基因探针进行基因显像。 展开更多

关键词 hsv1-tk 报告基因显像 肿瘤 基因探针

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不同浓度载HSV1-TK基因的超声靶向微泡造影剂对HIFU治疗后裸鼠肝癌的影响 被引量：7

10

作者 李红阳 周世骥 +5 位作者 刘长安 李生伟 龚建平 丁雄 谭晶 刘作金 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期31-34,37,共5页

目的研究高强度聚焦超声(HIFU)治疗裸鼠肝癌后,观察不同浓度载HSV1-TK基因超声靶向微泡造影剂对裸鼠残留肝癌组织中TK基因表达的影响。方法建立裸鼠肝癌模型40只,随即分成4组,每组10只,使用JC200型HIFU治疗仪对裸鼠消融80%后,经裸鼠尾... 目的研究高强度聚焦超声(HIFU)治疗裸鼠肝癌后,观察不同浓度载HSV1-TK基因超声靶向微泡造影剂对裸鼠残留肝癌组织中TK基因表达的影响。方法建立裸鼠肝癌模型40只,随即分成4组,每组10只,使用JC200型HIFU治疗仪对裸鼠消融80%后,经裸鼠尾静脉注入不同浓度载基因微泡,然后用超声辐照,Real time PCR检测TK mRNA表达情况,免疫组化及Western blot检测TK蛋白的表达情况,绘制抑瘤曲线。结果免疫组化及Real time PCR及Western blot及抑瘤率均显示与A组相比,B、C、D组有统计学意义(P<0.05),而C、D组比较无统计学意义(P>0.05)。结论当携基因微泡浓度≤0.6μg/μL时,TK mRNA和蛋白的表达、抑瘤率与微泡呈浓度依赖,而当携基因微泡浓度>0.6μg/μL时,基因的表达及抑瘤率与微泡浓度无相关性,故携基因的微泡浓度为0.6μg/μL时TK基因表达最强。 展开更多

关键词 超声微泡 浓度 hsv1-tk 肝癌

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脂质体/DNA复合物介导HSV—TK基因在膀胱癌细胞的表达和生物活性 被引量：3

11

作者 叶钢 金锡御 +6 位作者 饶亚兰 杨唐俊 汪泽厚 何斌 王祥卫 刘素英 曾毅 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期179-182,共4页

目的：探讨脂质体／ＨＳＶ—ＴＫ重组 ＤＮＡ对膀胱癌细胞的转导和在细胞内的活性表达。方法：用脂质体／ＤＮＡ复合物将 ＨＳＶ－ＴＫ基因逆转录病毒重组子（ｐＬＸＳＮ－ＴＫ）导入膀胱癌细胞株 ＢＩＵ８７。携带 ＨＳＶ一ＴＫ基因的... 目的：探讨脂质体／ＨＳＶ—ＴＫ重组 ＤＮＡ对膀胱癌细胞的转导和在细胞内的活性表达。方法：用脂质体／ＤＮＡ复合物将 ＨＳＶ－ＴＫ基因逆转录病毒重组子（ｐＬＸＳＮ－ＴＫ）导入膀胱癌细胞株 ＢＩＵ８７。携带 ＨＳＶ一ＴＫ基因的 ＢＩＵ８７细胞（ＢＩＵ８７—ＴＫ）由 Ｇ４１８筛选获得。经过 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和细胞原位杂交检测后，观测 ＡＣＶ对 ＢＩＵ８７－ＴＫ细胞存活的影响。结果： Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实 ＨＳＶ—ＴＫ基因存在于 ＢＩＵ８７－ＴＫ细胞染色体中。细胞原位杂交检测 ＨＳＶ－ＴＫｍＲＮＡ的表达。外源ＤＮＡ的导入以及ＨＳＶ－ＴＫ和Ｎｅｏ基因表达不会改变细胞生长特性。然而，在ＡＣＶ作用下，转导ＨＳＶ－ＴＫ基因的膀胱癌细胞的存活率受到影响，ＡＣＶ可显著抑制癌细胞生长。结论：脂质体／ＴＫ重组 ＤＮＡ复合物可用于膀胱癌细胞的转基因治疗。 展开更多

关键词 ISV1-tk脂质体 BIU87细胞株 无环鸟苷 ACV 膀胱癌 DNA复合物

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ACV治疗转TK基因人肺腺癌细胞A549裸鼠皮下成瘤的实验研究 被引量：2

12

作者 何祥梁 郭先健 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第8期766-768,共3页

目的　观察活体内转TK基因肺腺癌细胞对ACV(无环鸟苷 )的敏感性。方法　转TK基因肺腺癌细胞A549 TK、亲代细胞A549分别接种于裸鼠腹部皮下左右侧成瘤后 ,给予腹腔注射ACV治疗 2周 ,测量治疗前后肿瘤大小 ,并做病理观察。结果　A549 TK... 目的　观察活体内转TK基因肺腺癌细胞对ACV(无环鸟苷 )的敏感性。方法　转TK基因肺腺癌细胞A549 TK、亲代细胞A549分别接种于裸鼠腹部皮下左右侧成瘤后 ,给予腹腔注射ACV治疗 2周 ,测量治疗前后肿瘤大小 ,并做病理观察。结果　A549 TK细胞接种的肿瘤治疗前后体积增大不明显 (P >0 .0 5) ;A549细胞接种的肿瘤治疗后体积明显大于治疗前 ,光镜发现A549 TK细胞接种的肿瘤有局部坏死 ,胞核裂解、消失。结论　转TK基因肺腺癌细胞接种裸鼠所形成的肿瘤能被ACV治疗抑制生长。 展开更多

关键词 肺癌 hsv1-tk基因 基因治疗 无环鸟苷 肺腺癌

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单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应研究

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作者 郭中敏 林以理 +1 位作者 陈建波 陈系古 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2003年第2期65-68,F003,共5页

目的　研究单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 TK)基因转染并联合抗病毒药更昔洛韦 (Ganciclovir ,GCV)对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应。方法　采用基因工程技术构建带HSV1-TK基因的逆转录病毒重组体pLX SN TK ,采用脂质体介导入PA317包装细... 目的　研究单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 TK)基因转染并联合抗病毒药更昔洛韦 (Ganciclovir ,GCV)对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应。方法　采用基因工程技术构建带HSV1-TK基因的逆转录病毒重组体pLX SN TK ,采用脂质体介导入PA317包装细胞 ,建立重组逆转录病毒载体分泌细胞株PA317 TK ;用该细胞上清液转导人胶质母细胞瘤细胞 ,用不同浓度GCV作用人胶质母细胞瘤细胞SW0 38 C2 TK和野生型SW0 38 C2 ,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测 72h后细胞存活率 ,并求出半杀伤浓度。结果　重组逆转录病毒载体pLXSN TK能有效地将TK基因导入SW0 38-C2细胞内 ,并使其获得对GCV的敏感性 ;体外细胞毒实验 :在 2 0 μmol LGCV存在的情况下 ,野生型细胞无明显改变 ,而实验组细胞明显死亡 ,半杀伤浓度IC50 为 0 8μmol L ,与SW0 38 C2相比 ,对GCV的敏感性提高了 6 0 0倍 ,旁杀效果也较明显。结论　SW0 38 C2转染TK基因后 ,能有效地被GCV杀灭。 展开更多

关键词 胶质母细胞瘤 单纯疱疹病毒 基因 细胞 转染 基因治疗 肿瘤

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