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Molecular Cloning and Expression Analysis of a Cys2/His2 Type Zinc Finger Protein Gene in Upland Cotton
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作者 YANG Yu-wen,NI Wan-chao,ZHANG Bao-long,SHEN Xin-lian(Jiangsu Academy of Agriculture Sciences,48 Zhonglinjie Street,Nanjing,Jiangsu 210014,China) 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2008年第S1期73-,共1页
The zinc finger proteins belong to the largest family of transcription factors.But there is little research of Cys2/His2 type zinc finger proteins in cotton,and there is no submission of correlating
关键词 CYS Molecular cloning and expression Analysis of a Cys2/His2 Type Zinc Finger protein gene in Upland Cotton
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梨果实花青苷调控因子PyWRKY26蛋白表达分析
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作者 颜龙飞 张华 +2 位作者 肖钰薇 姚改芳 胡康棣 《合肥工业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第2期227-231,共5页
花青苷是形成红皮梨的主要色素类物质,其合成受一系列转录因子的调控。PyWRKY26是参与红皮梨花青苷合成的主要转录因子,但是其蛋白结构特征并不清楚。文章以‘红茄梨’果皮为实验材料,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR... 花青苷是形成红皮梨的主要色素类物质,其合成受一系列转录因子的调控。PyWRKY26是参与红皮梨花青苷合成的主要转录因子,但是其蛋白结构特征并不清楚。文章以‘红茄梨’果皮为实验材料,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)克隆PyWRKY26基因的编码序列(coding sequence,CDS)全长;采用同源重组克隆技术将PyWRKY26与带His标签的pCOLD原核表达载体进行连接,将重组表达载体转化到大肠杆菌Rosetta(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)法诱导重组蛋白表达,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。结果表明:在‘红茄梨’果皮中能成功扩增出PyWRKY26基因的CDS全长,并构建了PyWRKY26-pCOLD重组表达载体;将重组质粒的大肠杆菌置于22℃条件下,用0.5 mmol/L IPTG诱导16 h,与对照相比,该诱导条件下能成功表达蛋白;通过His镍柱纯化法并结合SDS-PAGE检测技术得到了纯化后含量较高的PyWRKY26-pCOLD融合蛋白,为进一步研究转录因子PyWRKY26的蛋白结构及功能奠定了重要基础。 展开更多
关键词 红茄梨 PyWRKY26基因 基因克隆 原核表达 蛋白纯化
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陆地棉纤维中GhGMPase2基因克隆、序列分析及原核表达
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作者 赛富涛 禄亚洲 +2 位作者 王斐 钱雯婕 李鸿彬 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期49-55,共7页
从陆地棉纤维中克隆GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GhGMPase2)基因,并进行序列分析及原核表达。利用RT-PCR技术进行基因克隆,构建原核表达载体pET28a-GhGMPase2并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。... 从陆地棉纤维中克隆GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GhGMPase2)基因,并进行序列分析及原核表达。利用RT-PCR技术进行基因克隆,构建原核表达载体pET28a-GhGMPase2并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。研究结果表明,从陆地棉花纤维中克隆得到棉GhGMPase2基因,该基因的开放读码框为1 086bp,编码包含362个氨基酸的蛋白质,分子质量约为40ku。序列分析结果表明,GhGMPase2蛋白具有较高的保守性,具有典型的糖酰基转移酶转移酶A家族(GT-A)结构域和左手平行的β-的螺旋(LbetaH或LBH)域,它们分别属于糖酰基转移酶家族2(GT-2)超家族和LBH超家族。进化树分析的结果显示,棉花GhGMPase2与烟草NtGMPase在进化上亲缘关系较近。经过原核表达载体pET28a-GhGMPase2的诱导表达和SDS-PAGE分析显示,获得分子质量约为40ku的重组GhGMPase2蛋白。GMPase2基因的克隆、序列分析及原核表达为进一步研究其参与棉花纤维发育过程中的重要功能奠定基础。 展开更多
关键词 棉花纤维 GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因 克隆 原核表达
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四翅滨藜Osmotin-like Protein基因的克隆、序列分析及其原核表达
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作者 王升阳 张勇 +3 位作者 王健 刘言志 刘金亮 潘洪玉 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期106-110,共5页
在构建四翅滨藜(Atriplex canescens)全长cDNA文库中通过随机克隆测序并进行EST分析基础上,得到四翅滨藜osmotin-like protein的1个cDNA序列,命名为AcOLP。AcOLPcDNA包含一个全长为687 bp完整开放阅读框,编码229个氨基酸,属于GH64-TLP-S... 在构建四翅滨藜(Atriplex canescens)全长cDNA文库中通过随机克隆测序并进行EST分析基础上,得到四翅滨藜osmotin-like protein的1个cDNA序列,命名为AcOLP。AcOLPcDNA包含一个全长为687 bp完整开放阅读框,编码229个氨基酸,属于GH64-TLP-SF超家族,是一种病程相关5(PR-5)蛋白,其核酸序列与大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)的osmotin-likeprotein基因的同源性为94%,对应编码氨基酸序列同源性为87%。将得到的序列提交GenBank,序列号为JN632587.1。与其他植物PR-5蛋白的氨基酸序列比对,AcOLP具有保守的半胱氨酸残基,与二硫键的形成有关。对AcOLP与其他植物的氨基酸序列的进化分析表明,其与大洋洲滨藜的亲缘关系较近。将AcOLP基因与原核表达载体pET-28a连接,进行融合表达,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子质量约29 kD的蛋白。 展开更多
关键词 四翅滨藜 Osmotin-like protein 基因克隆 序列分析 原核表达
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河虾过敏原原肌球蛋白的基因克隆与原核表达
5
作者 骆叶晴 郑双艳 +4 位作者 孙耀斌 陈娇 刘鑫 陈红兵 谢彦海 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第13期89-95,共7页
为了探寻天然原肌球蛋白的可替代物作为诊断和治疗虾类过敏的基础材料,本研究从河虾中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增技术克隆河虾过敏原原肌球蛋白基因的全长序列。以此序列设计表达引物,构建表达载体,最后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖... 为了探寻天然原肌球蛋白的可替代物作为诊断和治疗虾类过敏的基础材料,本研究从河虾中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增技术克隆河虾过敏原原肌球蛋白基因的全长序列。以此序列设计表达引物,构建表达载体,最后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组原肌球蛋白。结果显示,河虾的原肌球蛋白基因cDNA序列全长1658 bp,开放阅读框855 bp,编码284个氨基酸,预测蛋白等电点4.70,预测分子质量32.8 kDa。河虾原肌球蛋白cDNA序列已上传至GenBank数据库,登录号为OP974621。本研究成功构建河虾原肌球蛋白重组表达质粒pET-30a-TM,并用IPTG进行体外诱导表达,最佳诱导条件为IPTG浓度1 mmol/L、37℃诱导4 h。可溶性分析结果表明重组原肌球蛋白主要以可溶性形式存在于细胞破碎液的上清液中,分子质量约38 kDa。 展开更多
关键词 河虾 原肌球蛋白 基因克隆 原核表达 重组蛋白
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烟实夜蛾信息素结合蛋白3 cDNA的克隆、序列分析与原核表达 被引量:16
6
作者 刘晓光 安世恒 +2 位作者 罗梅浩 郭线茹 原国辉 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期733-739,共7页
利用RT-PCR技术从烟实夜蛾Helicoverpa assulta( Hass)雄虫触角中扩增得到了信息素结合蛋白3( HassPBP3)。克隆和测序结果表明,该基因核苷酸序列全长495 bp,编码164个氨基酸残基,预测分子量18.5 kD。并预测N-末端疏水区包含由22个氨基... 利用RT-PCR技术从烟实夜蛾Helicoverpa assulta( Hass)雄虫触角中扩增得到了信息素结合蛋白3( HassPBP3)。克隆和测序结果表明,该基因核苷酸序列全长495 bp,编码164个氨基酸残基,预测分子量18.5 kD。并预测N-末端疏水区包含由22个氨基酸组成的信号肽。因此,成熟蛋白应包括142个氨基酸,预测分子量为16.1 kD,等电点为5.44。经氨基酸序列同源性分析发现,此序列与已知昆虫PBP3有较高的同源性,而且具有气味结合蛋白的典型特征。将该基因重组到表达载体pGEX-4T-2中进行原核表达。经IPTG诱导、SDS-PAGE分析和Western印迹检测,结果表明烟实夜蛾PBP3基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约42 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。 展开更多
关键词 烟实夜蛾 信息素结合蛋白 基因克隆 原核表达
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家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)的基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备 被引量:14
7
作者 查宏贤 刘罡 +6 位作者 张晨 王彦云 卫正国 李兵 陈玉华 许雅香 沈卫德 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期642-647,共6页
丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员。本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyxmoriserpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础。首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技... 丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员。本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyxmoriserpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础。首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技术构建了pET28a-serpin-4原核表达载体,经IPTG诱导,获得原核表达重组融合蛋白,利用镍柱回收纯化技术,获得目的蛋白;经SDS-PAGE和抗His多抗检测,纯化蛋白的分子量大小与预测的一致,即获得了高纯度的目的蛋白,以此蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对昆明小鼠进行抗原免疫,最终获得抗serpin-4的多克隆抗体血清;该血清经ELISA和Westernblot验证,效价达到1:20000,特异性较好。家蚕serpin-4多克隆抗体的成功制备,一方面表明应用于其他生物的多克隆抗体制备所采用的方法对于家蚕serpin基因的研究同样适用;另一方面,也为深入研究家蚕serpin-4的生理功能打下了物质基础。 展开更多
关键词 家蚕 丝氨酸蛋白酶抑制剂 基因克隆 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
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烟实夜蛾触角普通气味结合蛋白ⅡcDNA的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达 被引量:14
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作者 巩中军 原国辉 +1 位作者 郭线茹 安世恒 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期18-23,共6页
利用RT PCR技术扩增了编码烟实夜蛾Helicoverpaassulta雌、雄虫触角普通气味结合蛋白Ⅱ的cDNA片段 ,将其克隆至pGEM TEasy载体 ,获得了普通气味结合蛋白Ⅱ基因成熟蛋白阅读框序列。将该基因重组到表达型质粒pET 30a(+)中 ,并转化入原核... 利用RT PCR技术扩增了编码烟实夜蛾Helicoverpaassulta雌、雄虫触角普通气味结合蛋白Ⅱ的cDNA片段 ,将其克隆至pGEM TEasy载体 ,获得了普通气味结合蛋白Ⅱ基因成熟蛋白阅读框序列。将该基因重组到表达型质粒pET 30a(+)中 ,并转化入原核细胞中表达。序列测定结果表明 ,烟实夜蛾触角普通气味结合蛋白基因的成熟蛋白阅读框全长 4 89bp ,编码 16 2个氨基酸残基 ,预测分子量和等电点分别为 18 2kD和 5 35。推导的氨基酸序列与已报道的 10种昆虫普通气味结合蛋白Ⅱ高度同源 (73%~ 98% ) ,并具有气味结合蛋白的典型特征。SDS PAGE和Western印迹分析表明 ,经IPTG诱导 ,普通气味结合蛋白Ⅱ基因能在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,电泳检测到一条约 2 3kD大小的外源蛋白 ,与预测的融合蛋白分子量大小相应。 展开更多
关键词 烟实夜蛾 普通气味结合蛋白 触角 基因克隆 原核表达
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发菜耐旱相关蛋白NXL-01的基因克隆与表达分析 被引量:9
9
作者 梁文裕 杨佳 +3 位作者 吴诗杰 焦广飞 王淑萍 徐婷婷 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期44-49,共6页
在发菜耐旱差异蛋白质组学研究中,发现假定蛋白(Hypothetical protein NXL-01)在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加。根据已知氨基酸序列设计简并引物克隆NXL-01基因,长度为327bp(GenBank登录号为HM854288)。生物信息学分析表明,该基因具有... 在发菜耐旱差异蛋白质组学研究中,发现假定蛋白(Hypothetical protein NXL-01)在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加。根据已知氨基酸序列设计简并引物克隆NXL-01基因,长度为327bp(GenBank登录号为HM854288)。生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成,是亲水性的膜外蛋白,有5个Ser磷酸化位点,1个Thr磷酸化位点。将NXL-01基因在大肠杆菌中表达,获得预期大小的重组蛋白(12.4kD)。RT-PCR分析表明,NXL-01mRNA在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加,与NXL-01蛋白的表达趋势一致。 展开更多
关键词 发菜 假定蛋白NXL-01 干旱胁迫 基因克隆 原核表达
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干燥和复吸水条件下发菜Mn-CAT差异表达与基因克隆 被引量:7
10
作者 梁文裕 焦广飞 +2 位作者 游向荣 周有文 陈伟 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期248-254,共7页
运用双向凝胶电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,分析发菜锰过氧化氢酶(Mn-CAT)在干燥和复吸水后的差异表达水平,根据Mn-CAT鉴定的已知氨基酸序列设计简并引物克隆该基因,并研究其原核表达.结果表明:干燥发菜复吸水后Mn-... 运用双向凝胶电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,分析发菜锰过氧化氢酶(Mn-CAT)在干燥和复吸水后的差异表达水平,根据Mn-CAT鉴定的已知氨基酸序列设计简并引物克隆该基因,并研究其原核表达.结果表明:干燥发菜复吸水后Mn-CAT表达量明显高于干燥状态下的表达量.使用简并引物克隆获得长度为693 bp的Mn-CAT基因(GenBank登录号为GU549477).将Mn-CAT基因在大肠杆菌中表达,获得1个约26 kD的外源蛋白,经Western blotting验证,该外源蛋白为Mn-CAT.研究结果为进一步研究发菜耐旱的分子机理、探讨发菜对极端干旱环境的适应机制奠定了基础. 展开更多
关键词 发菜 差异蛋白 Mn-CAT基因 克隆 原核表达
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绵羊肺炎支原体膜蛋白p56基因的克隆、表达及反应原性研究 被引量:6
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作者 陈诚 乔军 +5 位作者 孟庆玲 刘田莉 胡政香 马玉 才学鹏 陈创夫 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第2期455-458,共4页
为了分析绵羊肺炎支原体(MO)膜蛋白p56的反应原性,本研究以MO新疆流行株为模板,设计特异性引物对p56抗原集中区段进行PCR扩增,将扩增产物克隆测序,进一步亚克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-p56原核表达载体。将重组载体转化... 为了分析绵羊肺炎支原体(MO)膜蛋白p56的反应原性,本研究以MO新疆流行株为模板,设计特异性引物对p56抗原集中区段进行PCR扩增,将扩增产物克隆测序,进一步亚克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-p56原核表达载体。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG对重组菌进行诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。结果表明,SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为44 kDa;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组p56融合蛋白具有良好的反应原性,为进一步研发MO检测用抗原奠定了前期基础。 展开更多
关键词 MO 膜蛋白 p56基因 克隆 原核表达 反应原性
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松墨天牛OBP基因MaltOBP2和MaltOBP6的克隆、序列分析及组织表达谱和原核表达研究 被引量:15
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作者 钱凯 冯波 +3 位作者 巫诩亮 劳冲 沈幼莲 杜永均 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期496-506,共11页
【目的】本研究旨在探索松墨天牛Monochamus alternatus Hope在嗅觉识别寄主植物过程中扮演重要角色的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)的结构及功能。【方法】利用生物信息学方法对得到的Malt OBP2和Malt OBP6基因序列和... 【目的】本研究旨在探索松墨天牛Monochamus alternatus Hope在嗅觉识别寄主植物过程中扮演重要角色的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)的结构及功能。【方法】利用生物信息学方法对得到的Malt OBP2和Malt OBP6基因序列和蛋白结构进行分析,并通过实时荧光定量PCR分析Malt OBP2和Malt OBP6在松墨天牛雄虫不同组织和时空中的表达差异,利用p ET32a(+)原核表达载体对Malt OBP2和Malt OBP6进行了诱导蛋白表达。【结果】本研究得到两个松墨天牛气味结合蛋白基因——Malt OBP2(Gen Bank登录号:KP120891)和Malt OBP6(Gen Bank登录号:KP120892),ORF长度分别为402 bp和408 bp,翻译的氨基酸序列均含有4个保守的半胱氨酸位点,表明得到的两个OBP基因的编码蛋白均属于Minus-C OBP亚家族;推导的两个OBP蛋白均有6个α螺旋区域,且α螺旋区域在两个蛋白的位置非常相似,但是两个OBP蛋白推测的配体结合位点和位点极性却完全不同。组织表达模式表明,Malt OBP2和Malt OBP6在成虫头部、触角、下颚(唇)须、腹部末端和足中均有表达,表达程度不一,但都在头部显著表达,触角中的表达量相比其他组织中较低或只是持平。发育表达结果表明,Malt OBP2在蛹触角中的表达量最高,而Malt OBP6在幼虫头部的表达量最高。本研究成功构建了原核表达载体p ET32aMalt OBP2和p ET32a-Malt OBP6,并进行了OBP蛋白诱导表达,低温(16℃和20℃)条件利于蛋白表达在上清液中,延长诱导表达时间(12 h)可以增加蛋白的表达量。【结论】本研究从松墨天牛体内得到了Minus-C OBP蛋白亚家族的两个基因Malt OBP2和Malt OBP6,通过配体结合位点推测它们具有不同的生理功能;通过组织表达谱结果推测这两个OBP基因在松墨天牛中的功能不仅仅局限于嗅觉识别,或还有味觉感受、化学感受等其他生理功能。本研究结果为两个OBP蛋白的结构和功能研究奠定了基础,为探索松墨天牛的化学感受机制提供了条件。 展开更多
关键词 松墨天牛 气味结合蛋白 基因克隆 组织表达谱 蛋白结构 原核表达
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小麦品种陕253低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达 被引量:8
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作者 吴丹 高翔 +5 位作者 于旭 董剑 赵万春 陈其皎 庞红喜 李哲清 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期672-678,共7页
利用LMW-GS特异引物,从强筋小麦品种陕253中克隆了1个1498bp的片段(GenBank登录号为FJ172533),该片段包含全长为912bp的低分子量谷蛋白亚基的完整编码序列。经比较推导氨基酸序列的同源性,发现该基因属于Glu-D3位点编码低分子量谷蛋白... 利用LMW-GS特异引物,从强筋小麦品种陕253中克隆了1个1498bp的片段(GenBank登录号为FJ172533),该片段包含全长为912bp的低分子量谷蛋白亚基的完整编码序列。经比较推导氨基酸序列的同源性,发现该基因属于Glu-D3位点编码低分子量谷蛋白亚基的基因,编码产物N-端具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征,系统演化分析也支持这一结果。构建了该基因的表达载体pET32a-GluD3-S253,在宿主菌E.coli Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白。SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,证实融合蛋白表达成功。 展开更多
关键词 小麦 低分子量谷蛋白亚基 基因克隆 融合蛋白 原核表达
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犬冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立 被引量:8
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作者 熊炜 张强 +5 位作者 王艳 陈政晓 蒋静 王巧全 陈沁 李健 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2015年第8期86-88,92,共4页
以犬冠状病毒(CCV)TN449株为对象,对CCV核衣壳蛋白(N蛋白)编码基因进行克隆和原核表达,通过使用纯化的重组N蛋白,建立了CCV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组N蛋白具有良好的CCV抗原反应性;经优化ELISA反应条件,确定重组N蛋白最佳... 以犬冠状病毒(CCV)TN449株为对象,对CCV核衣壳蛋白(N蛋白)编码基因进行克隆和原核表达,通过使用纯化的重组N蛋白,建立了CCV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组N蛋白具有良好的CCV抗原反应性;经优化ELISA反应条件,确定重组N蛋白最佳包被浓度为1.0μg/m L、待检血清的最佳浓度为1∶100、阴阳性判定临界值为0.418;通过对比检测犬瘟热等多种犬病阳性血清,未发生交叉反应,证实该间接ELISA方法特异性好;用建立的间接ELISA方法对本室保存的50份CCV阳性血清和阴性血清进行复检,证实其符合率为100%。 展开更多
关键词 犬冠状病毒 核衣壳蛋白 基因克隆 原核表达 间接ELISA
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中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白基因克隆、组织表达分析及原核表达 被引量:6
15
作者 胡颖颖 徐书法 +3 位作者 李薇 Abebe Jenberie WUBIE 国占宝 周婷 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期9-17,共9页
为明确中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉形成中重要功能因子的信号转导通路,本研究利用RT-PCR方法,克隆了中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因编码区,GenBank登录号为KC012595,命名为AccSNMP1。序列分... 为明确中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉形成中重要功能因子的信号转导通路,本研究利用RT-PCR方法,克隆了中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因编码区,GenBank登录号为KC012595,命名为AccSNMP1。序列分析表明,该编码区开放阅读框长1563bp,编码520个氨基酸,推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为58.02kD和5.83。同源性比较发现,中华蜜蜂AccSNMP1与其他昆虫感觉神经元膜蛋白基因同源性差异很大,在氨基酸水平上与西方蜜蜂Apis mellifera SNMP基因一致性达99.2%,与熊蜂Bombus impatiens SNMP基因一致性达90.9%,而与赤拟谷盗Tribolium castaneum SNMP基因一致性仅为22.7%。系统发育树显示中华蜜蜂与西方蜜蜂遗传距离最近。实时荧光定量PCR结果分析表明,AccSNMP1在触角中表达量最高,在足中表达量较高,与胸、腹、头(去除触角和喙)、喙中表达量相比差异显著(P<0.05)。构建原核表达载体pEASY-E1-AccSNMP1,经IPTG诱导,中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中高效表达。结果为进一步研究AccSNMP1在中华蜜蜂体内的作用机理奠定了基础。 展开更多
关键词 中华蜜蜂 感觉神经元膜蛋白 基因克隆 组织表达模式 原核表达
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棉铃虫感觉神经元膜蛋白基因克隆和表达 被引量:6
16
作者 苏宏华 王桂荣 +3 位作者 张永军 梁革梅 吴孔明 郭予元 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期7-13,共7页
从棉铃虫Helicoverpaarmigera触角中克隆了一条全长1690bp的cDNA序列,该序列阅读框全长1572bp,编码523个氨基酸残基,序列中有2个跨膜区,具有昆虫感觉神经元膜蛋白(sensoryneuronmembraneprotein,SNMP)的典型特征。SNMP与已报道的其他昆... 从棉铃虫Helicoverpaarmigera触角中克隆了一条全长1690bp的cDNA序列,该序列阅读框全长1572bp,编码523个氨基酸残基,序列中有2个跨膜区,具有昆虫感觉神经元膜蛋白(sensoryneuronmembraneprotein,SNMP)的典型特征。SNMP与已报道的其他昆虫的感觉神经元蛋白的氨基酸序列有很高的同源性。半定量RT-PCR研究结果显示,SNMP在棉铃虫中不仅在触角中表达,也在去掉触角的头、足中表达。但是在触角中的表达量最高,在雌雄触角中的表达量差异不显著。在喙、下颚须和下唇须中也有表达。SNMP在卵、蛹和成虫体内也都有表达,但在卵中表达量相对较低。将SNMP编码区克隆到表达载体pET21b中,成功地进行了原核表达,表达出带有6个组氨酸标签的重组蛋白。 展开更多
关键词 棉铃虫 感觉神经元膜蛋白 基因克隆 半定量RT-PCR 原核表达
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家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1)的基因克隆及原核表达 被引量:7
17
作者 吴玉娇 龙梦娴 +5 位作者 陈洁 李治 李致宏 潘国庆 李田 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期258-264,共7页
极管作为微孢子虫高度特异的结构,在微孢子虫侵染宿主细胞的过程中扮演重要角色。利用家蚕微孢子虫和兔脑炎微孢子虫基因组数据,通过共线性分析获得一个编码家蚕微孢子虫假定极管蛋白的基因NBO_7g0016。序列特征分析表明该基因编码富含... 极管作为微孢子虫高度特异的结构,在微孢子虫侵染宿主细胞的过程中扮演重要角色。利用家蚕微孢子虫和兔脑炎微孢子虫基因组数据,通过共线性分析获得一个编码家蚕微孢子虫假定极管蛋白的基因NBO_7g0016。序列特征分析表明该基因编码富含脯氨酸的409个氨基酸,预测蛋白质分子质量39.6 kD,蛋白质序列的N端具有信号肽,有40个潜在的O-糖基化位点和17个磷酸化位点。以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆NBO_7g0016基因,并构建插入该基因的重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)进行原核表达,融合蛋白经亲和层析纯化后免疫昆明小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹实验证明该基因编码的蛋白质在成熟孢子中有表达,间接免疫荧光实验将蛋白质定位于家蚕微孢子虫的极管,确证该蛋白质为家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1,GenBank登录号:EOB15198.1)。初步推测家蚕微孢子虫极管蛋白1具有糖基化修饰特征。 展开更多
关键词 家蚕微孢子虫 极管蛋白1 基因克隆 原核表达 免疫印迹分析 间接免疫荧光分析
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人朊蛋白基因的克隆与原核表达 被引量:7
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作者 姜海霞 刘永生 +4 位作者 杨孝朴 陈豪泰 朱小玲 张杰 谢庆阁 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2006年第3期11-15,共5页
以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E.coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性... 以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E.coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99.6%,推导的氨基酸序列同源性为99.8%,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E.coli BL21(DE3),在37℃下用1.0 mmol/L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20%~25%.用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物.Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别.因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原. 展开更多
关键词 朊蛋白基因 克隆 原核表达
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猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达 被引量:7
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作者 杨克礼 时代 +7 位作者 段正赢 田永祥 周丹娜 郭锐 刘泽文 袁芳艳 刘威 孟丽 《江西农业学报》 CAS 2017年第1期96-101,共6页
利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆... 利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4~0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 Cap基因 克隆 原核表达
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瓜实蝇普通气味结合蛋白基因的克隆及原核表达 被引量:5
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作者 申建梅 胡黎明 +2 位作者 宾淑英 廖泓之 林进添 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期455-460,共6页
利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP。测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨基酸。氨... 利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP。测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨基酸。氨基酸序列比对及三维结构同源建模表明,此序列具有OBPs的典型特征,序列中具有6个保守的半胱氨酸和6个α螺旋区域。构建了重组表达载体pET28a(+)-BcucOBP,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在IPTG进行诱导下目标蛋白以His-标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR分析表明,BcucOBPmRNA在除雌虫腹节外的各个组织中都有表达,但在触角中的表达量最高。另外,BcucOBPmRNA在昆虫前足和生殖节中具有明显的性别差异表达特征,推测其不仅具有普通气味蛋白的功能,还可能参与了信息素的运输过程,在瓜实蝇交配行为中发挥重要作用。 展开更多
关键词 瓜实蝇 气味结合蛋白 基因克隆 组织表达特征 原核表达
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