目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-...目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-Ti me PCR方法有很好的特异性与敏感性,所检测沙门菌结果均为阳性,而非沙门菌均为阴性;标准曲线相关系数为R2=0.993,其敏感性为5CFU。运用该方法对108份鸡粪便、50份鸡肉以及58份水样进行检测,阳性率分别为3.7%(6/108)、4%(2/50)和3.4%(2/58),与传统细菌分离检测结果相符。结论结果表明该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点,此研究为环境及疾病诊断中沙门菌快速检测提供了新方法。展开更多
仙人掌X病毒(cactuSviruSX,CVX)严重威胁世界火龙果产业的发展。为实现对该病毒的定量检测,本研究根据CVX外壳蛋白(CP)的保守序列设计特异性引物CVX-F/-R,建立了引物浓度150 nmol/L,退火温度62℃的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法...仙人掌X病毒(cactuSviruSX,CVX)严重威胁世界火龙果产业的发展。为实现对该病毒的定量检测,本研究根据CVX外壳蛋白(CP)的保守序列设计特异性引物CVX-F/-R,建立了引物浓度150 nmol/L,退火温度62℃的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该引物扩增效率为97.38%,R^(2)为0.9965,对标准品的检测极限浓度为8×10^(2)拷贝/μL,其灵敏度是普通PCR的100倍。对火龙果不同组织中CVX的相对表达量进行检测发现,病毒在花丝中的含量最高,之后依次为花萼、花瓣、嫩枝、老枝和根。对采自贵州黔南州的40份火龙果样品进行检测,共检测出32份阳性样品。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR特异性强、灵敏度高,为今后CVX的检测提供了重要的技术补充。展开更多
为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和p...为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和pMD19-T-gE为模板,采用方阵法优化各反应条件,初步建立了检测IBRV的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法,并建立荧光定量PCR标准曲线。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛肠道病毒(BEV)和牛流行热病毒(BEFV)等RNA反转录所得cDNA及IBRV基因组DNA为模板,采用本研究建立的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法检测,评估所建方法的特异性;分别以10倍倍比稀释(108~101)的pMD19-T-gB和pMD19-T-gE质粒标准品作为模板,利用本研究建立的两种方法与普通PCR方法检测,比较所建方法的敏感性;以3个不同浓度的重组质粒标准品pMD19-T-gB作为模板,利用TB Green I qPCR方法分别于同一时间和不同时间进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。标准曲线结果显示,质粒标准品pMD19-T-gB在5.54×10^(8)拷贝/μL~5.54×10^(1)拷贝/μL范围内与其Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2=0.999,溶解曲线为单一峰。特异性试验结果显示,所建立的两种方法仅能检出IBRV,其他病毒均为阴性结果,特异性强。敏感性试验结果显示,所建立的TB Green I qPCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gB的检测限为55.4拷贝/μL;Nano PCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gE的检测限为4.28×10^(3)拷贝/μL,所建立两种方法的敏感性均较高。重复性试验结果显示,该qPCR方法批内、批间重复性试验的变异系数在0.16%~0.67%,重复性较好。采用本实验建立的两种方法和普通PCR方法对延边地区采集的50份疑似IBRV感染的样品进行检测,结果显示,普通PCR对样品的阳性检测率为84%(42/50),Nano PCR对样品的阳性检测率为90%(45/50),qPCR对样品的阳性检测率为92%(46/50),3种检测方法的总符合率均高于85%。本研究建立的qPCR方法对样品的阳性检出率最高、特异性更强,为临床样品的快速检测及相应疾病早期诊断的首选;Nano PCR次之。本实验首次同时建立并比较了用于IBRV检测的TB Green I qPCR方法与Nano PCR方法,且首次对延边地区的IBRV流行病学作了初步调查,为牛养殖业和疫病防控工作提供技术支撑和参考依据。展开更多
为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombina...为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。展开更多
文摘目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-Ti me PCR方法有很好的特异性与敏感性,所检测沙门菌结果均为阳性,而非沙门菌均为阴性;标准曲线相关系数为R2=0.993,其敏感性为5CFU。运用该方法对108份鸡粪便、50份鸡肉以及58份水样进行检测,阳性率分别为3.7%(6/108)、4%(2/50)和3.4%(2/58),与传统细菌分离检测结果相符。结论结果表明该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点,此研究为环境及疾病诊断中沙门菌快速检测提供了新方法。
文摘仙人掌X病毒(cactuSviruSX,CVX)严重威胁世界火龙果产业的发展。为实现对该病毒的定量检测,本研究根据CVX外壳蛋白(CP)的保守序列设计特异性引物CVX-F/-R,建立了引物浓度150 nmol/L,退火温度62℃的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该引物扩增效率为97.38%,R^(2)为0.9965,对标准品的检测极限浓度为8×10^(2)拷贝/μL,其灵敏度是普通PCR的100倍。对火龙果不同组织中CVX的相对表达量进行检测发现,病毒在花丝中的含量最高,之后依次为花萼、花瓣、嫩枝、老枝和根。对采自贵州黔南州的40份火龙果样品进行检测,共检测出32份阳性样品。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR特异性强、灵敏度高,为今后CVX的检测提供了重要的技术补充。
文摘为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和pMD19-T-gE为模板,采用方阵法优化各反应条件,初步建立了检测IBRV的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法,并建立荧光定量PCR标准曲线。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛肠道病毒(BEV)和牛流行热病毒(BEFV)等RNA反转录所得cDNA及IBRV基因组DNA为模板,采用本研究建立的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法检测,评估所建方法的特异性;分别以10倍倍比稀释(108~101)的pMD19-T-gB和pMD19-T-gE质粒标准品作为模板,利用本研究建立的两种方法与普通PCR方法检测,比较所建方法的敏感性;以3个不同浓度的重组质粒标准品pMD19-T-gB作为模板,利用TB Green I qPCR方法分别于同一时间和不同时间进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。标准曲线结果显示,质粒标准品pMD19-T-gB在5.54×10^(8)拷贝/μL~5.54×10^(1)拷贝/μL范围内与其Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2=0.999,溶解曲线为单一峰。特异性试验结果显示,所建立的两种方法仅能检出IBRV,其他病毒均为阴性结果,特异性强。敏感性试验结果显示,所建立的TB Green I qPCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gB的检测限为55.4拷贝/μL;Nano PCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gE的检测限为4.28×10^(3)拷贝/μL,所建立两种方法的敏感性均较高。重复性试验结果显示,该qPCR方法批内、批间重复性试验的变异系数在0.16%~0.67%,重复性较好。采用本实验建立的两种方法和普通PCR方法对延边地区采集的50份疑似IBRV感染的样品进行检测,结果显示,普通PCR对样品的阳性检测率为84%(42/50),Nano PCR对样品的阳性检测率为90%(45/50),qPCR对样品的阳性检测率为92%(46/50),3种检测方法的总符合率均高于85%。本研究建立的qPCR方法对样品的阳性检出率最高、特异性更强,为临床样品的快速检测及相应疾病早期诊断的首选;Nano PCR次之。本实验首次同时建立并比较了用于IBRV检测的TB Green I qPCR方法与Nano PCR方法,且首次对延边地区的IBRV流行病学作了初步调查,为牛养殖业和疫病防控工作提供技术支撑和参考依据。
文摘为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。
