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EFFECTS OF HBV preS AS A HUMORAL ENHANCER ON THE ABILITIES OF HCV E2 PROTEIN TO INDUCE IMMUNE RESPONSESIN THE DNA-IMMUNIZED MICE
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作者 谢尧 陶其敏 高建恩 《Chinese Medical Sciences Journal》 CAS CSCD 2003年第1期14-19,共6页
Objective.To study whether the abilities of hepatitis C virus(HCV)E2 gene immunization to induce humoral and cellular immune responses to E2 protein were affected by hepatitis B virus(HBV)preS gene when they were fuse... Objective.To study whether the abilities of hepatitis C virus(HCV)E2 gene immunization to induce humoral and cellular immune responses to E2 protein were affected by hepatitis B virus(HBV)preS gene when they were fused in DNA-immunized mice.Methods.Mice were immunized with E2,preS-E2(preS gene was upstream of E2 gene),and E2-preS(preS gene was downstream of E2 gene)gene by their eukaryotic expression vectors,respectively.The anti-E2 or anti-preS antibodies were detected using the E2 and preS antigens.The cellular immune response to E2 pro-tein in immunized mice was presented by its survival time after injecting SP2/O myeloma cells expressing HCV E2 protein into the abdominal cavity.Results. Chimeric E2 and preS gene immunization can induce mice to develop anti-preS and anti-E2 antibodies.The number of the mice developing anti-E2 antibody and the antibody titers in preS-E2 gene-injected group were higher than those in E2-preS gene-immunized group.However,the mice injected with E2 gene did not develop the detectable anti-E2 antibodies until 12 weeks after DNA immunization.After the mice was injected with target cells,the average survival time of the mice in the group immunized with E2 gene alone was longer than that of the group injected with E2 gene fused with HBV preS and was significantly longer than that of the control(P< 0.05).Conclusion.HBV preS might be a humoral enhancer that can affect the abilities of HCV E2 protein to in-duce immune responses in DNA-immunized mice. 展开更多
关键词 hepatitis C virus e2 protein hepatitis B virus preS protein
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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量:2
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作者 刘丹 黄小洁 +5 位作者 吴华伟 孙淼 陈延飞 秦义娴 侯力丹 薛麒 《动物医学进展》 北大核心 2024年第4期51-56,共6页
为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重... 为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 e2蛋白 间接ELISA 抗体检测
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基于重组E2蛋白的牛病毒性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与评价
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作者 张宜宸 孙明军 +7 位作者 邓昌顺 丁家波 徐宝梁 陈磊 全春兰 赵康 范学政 秦彤 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5459-5469,共11页
【目的】通过真核系统表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2蛋白,以此为包被蛋白建立一种BVDV间接ELISA抗体检测方法,以解决中国BVDV抗体检测技术不足的问题。【方法】将BVDV E 2基因克隆至真核表达载体pTT5,转染2... 【目的】通过真核系统表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2蛋白,以此为包被蛋白建立一种BVDV间接ELISA抗体检测方法,以解决中国BVDV抗体检测技术不足的问题。【方法】将BVDV E 2基因克隆至真核表达载体pTT5,转染293F细胞,待50%细胞死亡后进行超声破碎,并使用Ni离子亲和层析的方法纯化重组E2(rE2)蛋白;以rE2蛋白作为包被抗原,通过对各反应条件进行优化后建立检测BVDV抗体的间接ELISA方法,进行敏感性、特异性、重复性评价,并与中和试验进行比对。用所建方法对不同省份的牛血清样本进行检测。【结果】采用293F细胞表达了rE2蛋白,经亲和层析方法纯化,rE2蛋白的纯度为99%,浓度为1.74 mg/mL;通过对各个反应条件优化,成功建立了BVDV间接ELISA抗体检测方法。该方法与商品化试剂盒的灵敏度一致,均可检出抗体效价临界血清(VN=1);具有良好的特异性,与传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒-3(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)和牛疱疹病毒-1(BHV-1)抗体阳性血清均无交叉反应;板内和板间重复性试验的变异系数均在5%以内,证明该方法重复性较好;与血清中和试验的符合率为97.5%。临床样本检测结果显示,共检测出364份阳性血清和64份阴性血清。【结论】基于真核表达的rE2蛋白所建立的BVDV间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性和敏感性,可用于BVDV抗体检测,本研究结果为中国牛病毒性腹泻防控工作提供一种有效的技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) e2蛋白 间接ELISA
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3种佐剂对猪瘟病毒E2蛋白免疫效果的影响
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作者 陈玉梅 刘运超 +3 位作者 祁艳华 梁超 周景明 王爱萍 《动物医学进展》 北大核心 2024年第3期22-27,共6页
为筛选猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)亚单位疫苗高效佐剂,将杆状病毒表达系统制备的重组CSFV E2蛋白分别与铝佐剂(胶状)、50V佐剂(W/O)和201佐剂(W/O/W)3种不同佐剂配伍后免疫Balb/c小鼠,经间接ELISA和阻断ELISA测定抗体... 为筛选猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)亚单位疫苗高效佐剂,将杆状病毒表达系统制备的重组CSFV E2蛋白分别与铝佐剂(胶状)、50V佐剂(W/O)和201佐剂(W/O/W)3种不同佐剂配伍后免疫Balb/c小鼠,经间接ELISA和阻断ELISA测定抗体效价及血清IL2、IL4、IL10和IFN-γ细胞因子水平。结果显示,经Ni-NAT亲和层析纯化获得的重组E2蛋白纯度约95%;免疫后28 d,无佐剂的E2蛋白免疫Balb/c小鼠后抗体效价达到1∶3200,但血清抗体阻断率小于30%;加入佐剂后,抗体效价明显提升,血清抗体阻断率也随之升高,3种不同的佐剂免疫血清抗体阻断率大于40%。其中50V佐剂组抗体效价最高可达1∶204800,其抗体阻断率大于80%,且50V佐剂组免疫血清中IL-4表达量最高为892.23 pg/mL,说明50V佐剂可以有效激发以Th2型免疫应答为主的细胞免疫反应。综合B细胞和T细胞免疫应答结果,50V佐剂对E2蛋白的免疫效果提升明显优于其他佐剂,试验结果为进一步研究高效猪用CSFV亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2蛋白 佐剂 免疫效果
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PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的免疫原性分析 被引量:6
5
作者 许信刚 王志昇 +2 位作者 李兆才 张琪 童德文 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期892-898,共7页
本试验旨在构建以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟双价基因工程亚单位疫苗候选株。利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF5... 本试验旨在构建以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟双价基因工程亚单位疫苗候选株。利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF5-E2。该重组病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM。对重组病毒进行Western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验以及淋巴细胞增殖试验。Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组GP5和E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP5和E2蛋白;免疫金电子显微镜观察表明,重组GP5和E2蛋白展示在杆状病毒囊膜上;动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSV和抗CSFV的特异性抗体;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答。本试验成功构建表面展示PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和CSFV的混合感染奠定基础。 展开更多
关键词 杆状病毒表面展示系统 PRRSV CSFV GP5蛋白 e2蛋白
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猪瘟病毒E2蛋白抗原单表位基因的融合表达及其免疫活性的研究 被引量:5
6
作者 刘思国 涂长春 +3 位作者 余兴龙 张茂林 刘伯华 吴健敏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期530-535,共6页
利用基因搭桥技术,在KlenowDNA聚合酶作用下,分别合成猪瘟病毒E2蛋白的3个抗原表位基因,并与原核表达载体pGEX-3X进行连接、转化和筛选鉴定,构建了3个重组质粒pGEX-C、pGEX-D和pGEX-E。在IPTG的诱导下,实现了可溶性蛋白的融合表达(GST-C... 利用基因搭桥技术,在KlenowDNA聚合酶作用下,分别合成猪瘟病毒E2蛋白的3个抗原表位基因,并与原核表达载体pGEX-3X进行连接、转化和筛选鉴定,构建了3个重组质粒pGEX-C、pGEX-D和pGEX-E。在IPTG的诱导下,实现了可溶性蛋白的融合表达(GST-C、GST-D、GST-E),以GST亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。应用ELISA和Western-blot检测证实:E抗原表位基因表达的融合蛋白GST-E具有免疫学活性,而C和D的抗原表位基因虽然都表达了融合蛋白GST-C和GST-D,但未检测到免疫学活性。免疫攻毒保护试验表明:融合蛋白GST-E具有一定的免疫保护功能,为多表位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2蛋白 抗原表位 基因表达 融合表达 免疫学活性
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猪瘟病毒E2蛋白A/D区单抗的制备及其抗原表位的初步研究 被引量:11
7
作者 张春玲 宗先伟 +4 位作者 杨文超 张敬梅 彭明义 程宝艳 余为一 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第9期50-54,共5页
应用分子克隆技术将猪瘟病毒E2蛋白部分基因插入到载体pGEX-4T-1中构建重组质粒pGEX-4T-E(A),在大肠杆菌Rosetta中表达融合蛋白GST-E(A),以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆化和间接ELISA筛选... 应用分子克隆技术将猪瘟病毒E2蛋白部分基因插入到载体pGEX-4T-1中构建重组质粒pGEX-4T-E(A),在大肠杆菌Rosetta中表达融合蛋白GST-E(A),以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆化和间接ELISA筛选,获得了C3、A1两株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA结果显示,其腹水效价为1∶128000和1∶256000。Western blotting结果证实,单克隆抗体C3和A1能与猪瘟病毒(classical swinefever virus,CSFV)发生特异性的反应,表明该单抗是针对猪瘟病毒E2蛋白的保守线性表位。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2蛋白 单克隆抗体 鉴定
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猪瘟病毒E2基因噬菌体展示多肽库的构建及表位鉴定 被引量:12
8
作者 徐和敏 王琴 +1 位作者 徐璐 范学政 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期71-76,共6页
本研究通过建立CSFV噬菌体展示多肽库,并对其进行生物淘选,以期获得E2蛋白上新的抗原表位。选择CSFV石门株(SM)和疫苗株(HCLV)为代表株,采用噬菌体展示技术,以T7select415-1b为载体,分别构建了CSFV SM株和HCLV株E2基因噬菌体展示多肽库(... 本研究通过建立CSFV噬菌体展示多肽库,并对其进行生物淘选,以期获得E2蛋白上新的抗原表位。选择CSFV石门株(SM)和疫苗株(HCLV)为代表株,采用噬菌体展示技术,以T7select415-1b为载体,分别构建了CSFV SM株和HCLV株E2基因噬菌体展示多肽库(SM-E2库和HCLV-E2库)。通过生物淘选和噬菌体原位杂交技术,采用7株猪瘟单克隆抗体和1株猪瘟高免血清分别对构建的SM-E2库和HCLV-E2库进行抗原表位筛选。结果共筛选到了5条与E2蛋白高度同源的序列,在E2蛋白上的同源区域分别为TAVSPTTLR、YYEP、TTWKEYSH、GGQ(V)VK和PDGLPHY。结果表明,TAVSPTTLR、YYEP和TTWKEYSH序列与目前已知E2蛋白表位一致,说明它们是E2蛋白上的优势表位;GGQ(V)VK和PDGLPHY序列与预测表位一致,推测是E2蛋白上潜在的抗原表位。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2蛋白 抗原表位 噬菌体展示多肽库
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猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及抗E2蛋白单克隆抗体的制备 被引量:7
9
作者 许信刚 胡建和 +2 位作者 张彦明 张海棠 陈永耀 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期1318-1322,共5页
利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感... 利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆和筛选获得了4株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗可与CSFV产生特异性反应并具有中和活性。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2囊膜蛋白 逆转录病毒载体 假病毒 FACS 单克隆抗体
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牛病毒性腹泻病毒E2基因在昆虫细胞中的表达 被引量:4
10
作者 范晴 谢芝勋 +5 位作者 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 谢丽基 罗思思 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第4期9-12,共4页
为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒。将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2。转... 为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒。将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2。转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对重组的表达蛋白进行分析。结果表明,重组E2蛋白大小为43.6ku,与预期值相符,该蛋白能与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应,为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒奠定基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 e2蛋白 杆状病毒表达体系 昆虫细胞
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牛病毒腹泻病毒(BVDV)E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立 被引量:4
11
作者 钟发刚 黄新 +1 位作者 王新华 李娜 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期761-764,共4页
【目的】为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测提供敏感、特异检测方法。【方法】重组质粒pET-(1-345)转化宿主菌BL21(DE),以IPTG进行诱导表达,使外源基因获得了较高水平的表达;Westem一blot检测表达产物反应原性,同时进行特异性检测;将收集... 【目的】为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测提供敏感、特异检测方法。【方法】重组质粒pET-(1-345)转化宿主菌BL21(DE),以IPTG进行诱导表达,使外源基因获得了较高水平的表达;Westem一blot检测表达产物反应原性,同时进行特异性检测;将收集的纯培养物进行超声波裂解后以His bind kit蛋白质纯化试剂盒纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度。【结果】重组蛋白表达可达菌体蛋白总量的19.7%,且具有较好的反应原性和特异性,以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约43头份血清样品进行检测,检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到93.55%。【结论】以BVDV E2重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA检测方法是可行的,为其进一步的标准化莫定基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 e2重组蛋白 ELISA
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家兔与BALB/c小鼠对猪瘟病毒E2蛋白靶向化树突状细胞疫苗敏感性的比较 被引量:1
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作者 王金良 董炳梅 +5 位作者 魏凤 孙全文 王爱华 唐娜 张春玲 沈志强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第1期80-83,共4页
为比较家兔与BALB/c小鼠对猪瘟病毒E2蛋白靶向化树突状细胞疫苗的敏感性,本研究首先根据小鼠与家兔体重比,分别免疫糖基化E2蛋白与E2蛋白(家兔2mg/只,小鼠20μg/只),在不同时间采血制备血清,通过ELISA方法测定血清中IgG水平。结果显示,... 为比较家兔与BALB/c小鼠对猪瘟病毒E2蛋白靶向化树突状细胞疫苗的敏感性,本研究首先根据小鼠与家兔体重比,分别免疫糖基化E2蛋白与E2蛋白(家兔2mg/只,小鼠20μg/只),在不同时间采血制备血清,通过ELISA方法测定血清中IgG水平。结果显示,接种后BALB/c小鼠出现了轻度的免疫应答,而家兔产生了强而持久的免疫保护。本研究对BALB/c小鼠的接种量进行了进一步摸索,结果表明,50与100μg/只免疫效果明显优于20μg/只;其中50μg/只E2蛋白与糖基化E2蛋白免疫后,血清IgG水平较高且稳定;而100μg/只糖基化E2蛋白免疫后,免疫初期,糖基化E2蛋白组产生了免疫抑制,至21d抗体水平逐渐升高且达极高水平;但100μg/只E2蛋白免疫后,整个免疫期内抗体水平均较低,只有轻微波动。以上结果表明,家兔对糖基化E2蛋白与E2蛋白的敏感性均显著高于BALB/c小鼠,且糖基化E2蛋白免疫效果明显好于E2蛋白,BALB/c小鼠的糖基化E2蛋白最佳免疫剂量为50μg/只。 展开更多
关键词 家兔 BALB C小鼠 猪瘟病毒 e2蛋白 树突状细胞疫苗 敏感性
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大肠埃希菌外膜囊泡递呈猪瘟病毒E2蛋白的表达及其免疫效果评价 被引量:1
13
作者 黄杰 龚永平 +3 位作者 文继峰 杨锐 任露 颜其贵 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第9期1460-1466,共7页
为探讨大肠埃希菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)作为猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白的递呈载体所产生的免疫效应,将切除跨膜区后的CSFV E2基因连接到p BAD18-Cm-Cly A的C-端,转化E.coli DH5α,用0.2%阿拉... 为探讨大肠埃希菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)作为猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白的递呈载体所产生的免疫效应,将切除跨膜区后的CSFV E2基因连接到p BAD18-Cm-Cly A的C-端,转化E.coli DH5α,用0.2%阿拉伯糖诱导表达后,收集含E2蛋白的OMVs免疫家兔。免疫印迹表明,该OMVs可特异性地与组氨酸标签单抗结合。间接ELISA结果表明,重组OMVs可诱导兔体产生高水平的Ig G抗体。免疫后的家兔能很好地防御高剂量CSFV活疫苗攻击。说明大肠埃希菌OMVs递呈CSFV E2蛋白具有较好的免疫原性,为研究OMVs递呈CSFV E2蛋白疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 OMVs 猪瘟病毒e2蛋白 免疫原性
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猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备 被引量:1
14
作者 邓宇 蔺涛 +9 位作者 孙春清 张宏彪 张荣 龙进学 黄律 文心田 曹三杰 童光志 袁世山 郑浩 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第4期31-35,共5页
表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采... 表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 e2蛋白 抗体制备
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抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定 被引量:1
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作者 聂福平 杨俊 +5 位作者 李作生 王昱 向海洋 王国民 肖进文 李应国 《安徽农业科学》 CAS 2013年第28期11393-11394,11473,共3页
[目的]制备抗猪瘟病毒(CSFV)的单克隆抗体(MAb)。[方法]以纯化的猪瘟病毒免疫4~6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞进行融合,筛选出抗CSFV单克隆抗体杂交瘤细胞株。[结果]经间接ELISA获得3株能稳定分泌抗CSFVE2蛋白... [目的]制备抗猪瘟病毒(CSFV)的单克隆抗体(MAb)。[方法]以纯化的猪瘟病毒免疫4~6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞进行融合,筛选出抗CSFV单克隆抗体杂交瘤细胞株。[结果]经间接ELISA获得3株能稳定分泌抗CSFVE2蛋白的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1AS、5F3和4D2。Mab亚型鉴定表明3株MAb均为IgG2b,轻链均为K链。Westernblot结果表明3株Mab均能识别重组E2蛋白。间接免疫荧光试验表明3株Mab均与CSFV呈阳性反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)呈阴性反应。[结论]该研究为建立CSFV特异性检测方法奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2蛋白 单克隆抗体
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人乳头瘤病毒18型E2基因的原核表达载体构建与表达 被引量:1
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作者 黄发军 杨国成 柳长柏 《湖北民族学院学报(医学版)》 2008年第2期10-13,共4页
目的将人乳头瘤病毒18型(Human papillomavirus 18,HPV18)E2基因插入到原核表达载体pET28a(+)T7启动子下游,构建原核表达载体pET28a(+)-HPV18E2,原核表达并纯化HPV18E2蛋白,为研究HPV18 E2蛋白相关疫苗奠定实验基础。方法1)以HPV18型基... 目的将人乳头瘤病毒18型(Human papillomavirus 18,HPV18)E2基因插入到原核表达载体pET28a(+)T7启动子下游,构建原核表达载体pET28a(+)-HPV18E2,原核表达并纯化HPV18E2蛋白,为研究HPV18 E2蛋白相关疫苗奠定实验基础。方法1)以HPV18型基因组DNA为模板,运用聚合酶链反应扩增E2基因,将其插入到原核表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-HPV18E2;2)PCR、限制性内切酶酶切分析以及核酸序列测定重组质粒pET28a(+)-HPV18E2的正确性;3)将重组表达质粒pET28a(+)-HPV18E2转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经镍螯合亲和层析胶体纯化HPV18E2蛋白;4)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定HPV18E2蛋白的正确表达。结果1)PCR、限制性内切酶酶切分析和核酸序列分析鉴定证实了重组表达质粒pET28a(+)-HPV18E2的成功构建;2)SDS-PAGE电泳分析,HPV18E2蛋白在大肠杆菌BL21中表达量占菌体总蛋白的21%,纯化后的蛋白纯度大于90%;经Western blot鉴定,显示HPV18E2蛋白与标签蛋白(6xHis)形成相对分子质量约42KD的蛋白,与理论预计值相符。结论1)成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HPV18E2;2)原核表达获得了HPV18E2蛋白。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒 e2蛋白 宫颈癌
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急性重症胰腺炎大鼠P38丝裂原活化蛋白激酶通路对海马神经元环氧化酶-2和前列腺素E2表达的调控 被引量:1
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作者 蒙国光 郑国利 +1 位作者 朱世纯 张宇新 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期559-559,共4页
目的:研究在急性重症胰腺炎(SAP)大鼠模型中,P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)通路对于海马CA1区神经元环氧化酶-2(COX-2)和前列腺素E2(PGE2)表达的影响.方法:随机将SD大鼠分为SAP模型组、SB203580抑制剂组和对照组.采用Nissl染色、免疫... 目的:研究在急性重症胰腺炎(SAP)大鼠模型中,P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)通路对于海马CA1区神经元环氧化酶-2(COX-2)和前列腺素E2(PGE2)表达的影响.方法:随机将SD大鼠分为SAP模型组、SB203580抑制剂组和对照组.采用Nissl染色、免疫组织化学显色、免疫印迹,观察每组大鼠海马CA1区p-P38、COX-2以及PGE2的表达变化和SB203580对上述指标变化的影响.结果:SAP模型组海马CA1区p-P38、COX-2、PGE2阳性神经元的数量较对照组显著增加;SB203580抑制剂组与SAP模型组比较,海马CA1区p-P38、COX-2、PGE2阳性神经元的数量明显减少.结论:P38MAPK通路对SAP大鼠模型海马COX-2和PGE2表达可能有重要调控作用,SB203580对SAP大鼠海马神经元具有保护作用. 展开更多
关键词 急性重症胰腺炎 海马 P38丝裂原活化蛋白激酶 环氧化酶-2 前列腺素e2
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P38丝裂原活化蛋白激酶对帕金森病模型小鼠黑质诱导型一氧化氮合酶和前列腺素E2表达的影响 被引量:2
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作者 魏子峰 张作凤 +2 位作者 王永生 王茜 张宇新 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期77-81,共5页
目的:研究P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)模型小鼠中对黑质诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和前列腺素E2(PGE2)的调控作用。方法:将小鼠随机分为MPTP模型组,腹腔注射M... 目的:研究P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)模型小鼠中对黑质诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和前列腺素E2(PGE2)的调控作用。方法:将小鼠随机分为MPTP模型组,腹腔注射MPTP;抑制剂组,每次注射MPTP前1h腹腔注射P38MAPK特异性抑制剂SB203580;对照组,注射与模型组和抑制剂组等量生理盐水和DMSO。行为学观察,采用免疫组织化学和免疫蛋白印迹法观察黑质酪氨酸羟化酶(TH)、iNOS、PGE2和磷酸化P38MAPK(p—P38MAPK)的表达。结果:模型组小鼠出现PD典型的行为学症状,TH阳性细胞和蛋白水平下降61%~65%,p-P38MAPK、iNOS和PGE2阳性细胞及蛋白水平显著增加;经SB203580处理后,上述变化均明显减轻。结论:P38MAPK对PD模型小鼠黑质iNOS和PGE2表达可能有重要调控作用,SB203580对PD小鼠具有一定神经保护作用。 展开更多
关键词 帕金森病 诱导型一氧化氮合酶 P38丝裂原活化蛋白激酶 酪氨酸羟化酶 前列腺素e2
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CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及免疫原性分析 被引量:2
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作者 李亚军 茹毅 +13 位作者 郝荣增 蒋成辉 王伟 张越 张贵才 刘华南 卢炳州 杨洋 陶世宇 杨锐 宋向东 陈娇 余四九 郑海学 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4315-4324,共10页
旨在利用悬浮培养CHO细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2蛋白,并鉴定纯化E2蛋白的免疫原性。本研究以BVDV-1 NADL株基因序列为基础,构建BVDV E2蛋白的重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2,转染经悬浮... 旨在利用悬浮培养CHO细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2蛋白,并鉴定纯化E2蛋白的免疫原性。本研究以BVDV-1 NADL株基因序列为基础,构建BVDV E2蛋白的重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2,转染经悬浮培养的CHO细胞进行分泌表达,收集细胞培养上清,进行亲和层析法纯化,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达和纯化,Western blot鉴定与His抗体和BVDV阳性血清反应性,利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔,用细胞间接免疫荧光(IFA)和ELISA鉴定E2蛋白的反应活性。纯化E2蛋白经BCA蛋白定量试剂盒检测后表达量高达1.228 mg·mL^(-1);Western blot结果显示,利用His抗体和BVDV阳性血清均可检测到目的蛋白的特异性条带;新西兰大白兔一免后第7天利用间接ELISA可检测到血清抗体阳性,并持续至免疫后第28天,血清抗体效价水平达到1∶1024000;IFA试验结果显示,该血清抗体可检测到BVDV感染MDBK细胞中E2蛋白的表达,进一步证实纯化的E2蛋白具有良好的免疫原性和特异性。本研究成功利用CHO悬浮培养真核表达系统制备了纯化的BVDV E2蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为BVDV的诊断方法及其新型亚单位疫苗研制奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 e2蛋白 真核表达 CHO悬浮培养 免疫原性
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信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响 被引量:5
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作者 魏蔷 刘运超 +3 位作者 白怡霖 冯华 宋亚鹏 张改平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期120-127,共8页
旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽(简称endo)、蜂素信号肽(简称mel)及gp67信号肽(简称gp67)分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10... 旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽(简称endo)、蜂素信号肽(简称mel)及gp67信号肽(简称gp67)分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组黏粒,将重组黏粒转染sf21细胞以得到杆状病毒。经扩增后大量感染细胞,检测E2蛋白表达情况,利用镍填料纯化得到E2蛋白,并进行蛋白糖基化水平鉴定及蛋白免疫原性分析。PCR鉴定结果显示成功构建了重组质粒。挑选白斑进行PCR鉴定,证实得到重组黏粒。Western blot检测结果表明,E2蛋白实现了分泌表达,进一步比较细胞培养上清中E2蛋白的表达水平,确定gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高。经镍填料纯化得到E2蛋白,SDS-PAGE结果显示其纯度较高,产率为25 mg·L^-1。通过ELISA分析其抗原性,结果表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体,其抗原性良好。将纯化后的E2蛋白添加ISA201佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,阻断ELISA结果显示,免疫后14 d即产生较高水平的猪瘟特异性抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。本研究为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 信号肽 e2蛋白 猪瘟病毒(CSFV) 分泌表达
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