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Emerging technological developments to address pest resistance in Bt cotton
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作者 NAGARAJ Selvarani RAJASEKARAN Ravikesavan +3 位作者 PALANIAPPAN Jayamani RANGASAMY Selvakumar NARAYANASAMY Chitra NARAYANAN Manikanda Booapathi 《Journal of Cotton Research》 CAS 2024年第3期318-333,共16页
Cotton plays a crucial role in shaping Indian economy and rural livelihoods.The cotton crop is prone to numerous insect pests,necessitating insecticidal application,which increases production costs.The advent of the e... Cotton plays a crucial role in shaping Indian economy and rural livelihoods.The cotton crop is prone to numerous insect pests,necessitating insecticidal application,which increases production costs.The advent of the expression of Bacillus thuringiensis(Bt)insecticidal protein in cotton has significantly reduced the burden of pest without compromising environmental or human health.After the introduction of transgenic cotton,the cultivated area expanded to 22 million hectares,with a 64% increase in adoption by farmers worldwide.Currently,Bt cotton accounts for 93% of the cultivated cotton area in India.However,extensive use of Bt cotton has accelerated resistance development in pests like the pink bollworm.Furthermore,the overreliance on Bt cotton has reduced the use of broad-spectrum pesticides,favouring the emergence of secondary pests with significant challenges.This emphasizes the urgent necessity for developing novel pest management strategies.The high-dose and refuge strategy was initially effective for managing pest resistance in Bt cotton,but its implementation in India faced challenges due to misunderstandings about the use of non-Bt refuge crops.Although gene pyramiding was introduced as a solution,combining mono toxin also led to instances of cross-resistance.Therefore,there is a need for further exploration of biotechnological approaches to manage insect resistance in Bt cotton.Advanced biotechnological strategies,such as sterile insect release,RNA interference(RNAi)-mediated gene silencing,stacking Bt with RNAi,and genome editing using clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein(CRISPR-Cas),offer promising tools for identifying and managing resistance genes in insects.Additionally,CRISPR-mediated gene drives and the development of novel biopesticides present potential avenues for effective pest management in cotton cultivation.These innovative approaches could significantly enhance the sustainability and efficacy of pest resistance management in Bt cotton. 展开更多
关键词 bt Cotton gene pyramiding RNAI Modified toxin Genome editing Plant derived insecticidal protein gene drive
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Bt毒素诱导下小菜蛾实时定量PCR内参基因的筛选 被引量:22
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作者 符伟 谢文 +3 位作者 张卓 吴青君 王少丽 张友军 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1406-1412,共7页
【目的】筛选出Bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella(L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA(18S rRNA)、肌动蛋白(ACTB)、延伸因子(EF1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白L32(RPL32)、核糖体蛋白S13(R... 【目的】筛选出Bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella(L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA(18S rRNA)、肌动蛋白(ACTB)、延伸因子(EF1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白L32(RPL32)、核糖体蛋白S13(RPS13)、核糖体蛋白S20(RPS20)和β-微管蛋白(TUB)基因作为候选内参基因,以geNorm、Normfinder和BestKeeper软件分析这8个基因在Bt毒素诱导后的小菜蛾不同品系中肠组织中的表达稳定性。并应用筛选出来的内参基因分析小菜蛾氨肽酶2(aminopeptidase N2,APN2)基因的表达水平。【结果】geNorm软件以RPS13和EF1为最稳定内参基因,NormFinder和BestKeeper软件均以RPS13和RPL32为最稳定基因。使用3种不同内参基因分析Bt毒素诱导后的小菜蛾Bt抗性和敏感品系中ANP2表达水平时,新的内参基因EF1和传统内参基因RPL32表现了良好的稳定性,二者作为标准化因子,ANP2表达量结果基本一致,而使用18S rRNA作为内参基因,却导致部分表达量分析结果有所误差。【结论】筛选出PRS13,RPL32和EF1可以作为小菜蛾某些试验条件下的内参基因,对小菜蛾基因表达研究奠定了一定基础,也对其他昆虫内参基因的筛选具有参考价值。 展开更多
关键词 小菜蛾 实时定量PCR 内参基因 抗药性 bt毒素
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欧洲黑杨转Bt毒蛋白基因植株大田抗虫性测定 被引量:25
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作者 胡建军 刘庆一 +3 位作者 王克胜 张宝恩 田颖川 韩一凡 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 1999年第2期202-205,共4页
近几年,基因工程发展很快,通过基因工程已获得了各种各样的转基因植物,如抗虫转基因农作物的棉花(GosypiumhirsutumL.)、水稻(OryzasativaL.)、马铃薯(SolanumtuberosumL.)... 近几年,基因工程发展很快,通过基因工程已获得了各种各样的转基因植物,如抗虫转基因农作物的棉花(GosypiumhirsutumL.)、水稻(OryzasativaL.)、马铃薯(SolanumtuberosumL.)、玉米(ZeamaysL.)、小麦... 展开更多
关键词 欧洲黑杨 bt 蛋白基因 抗虫 育种
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转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空动态 被引量:29
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作者 李汝忠 沈法富 +3 位作者 王宗文 王景会 刘承运 申贵芳 《山东农业科学》 2002年第2期7-9,共3页
以转Bt基因抗虫棉 33B为材料 ,利用ELISA检测方法 ,通过对棉株不同发育时期和同一时期的不同组织或器官Bt晶体蛋白含量的测定 ,研究了转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空变化。结果表明 ,随着棉株生育进程的推进和株体的老化 ,Bt晶体蛋白... 以转Bt基因抗虫棉 33B为材料 ,利用ELISA检测方法 ,通过对棉株不同发育时期和同一时期的不同组织或器官Bt晶体蛋白含量的测定 ,研究了转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空变化。结果表明 ,随着棉株生育进程的推进和株体的老化 ,Bt晶体蛋白含量随着植株体内可溶性总蛋白含量的逐渐降低而降低 ,而Bt基因的表达强度从苗期到蕾期随着棉株营养生长的加快而呈上升趋势 ,至蕾期达到高峰 ,以后逐渐减弱。不同组织或器官Bt晶体蛋白的含量也有较大差异 ,表现在幼嫩组织或器官的含量较高 ,成熟组织或器官次之 ,衰老组织最低。 展开更多
关键词 抗虫棉 bt基因 晶体蛋白 时空动态 ELISA 棉株 表达强度 抗虫性
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欧美杨108号转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白嵌合基因的研究 被引量:4
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作者 遇文婧 邹传山 +1 位作者 王志英 张国财 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期603-606,共4页
以欧美杨108号为外植体材料,利用农杆菌介导法成功地将抗虫基因(蜘蛛杀虫肽+B t毒蛋白的嵌合基因)导入受体中。通过PCR检测,凝胶电泳结果显示8个卡那霉素抗性芽中,6个存在目的基因;经PCR-Southern印迹杂交检测,阳性率为50%,进一步表明... 以欧美杨108号为外植体材料,利用农杆菌介导法成功地将抗虫基因(蜘蛛杀虫肽+B t毒蛋白的嵌合基因)导入受体中。通过PCR检测,凝胶电泳结果显示8个卡那霉素抗性芽中,6个存在目的基因;经PCR-Southern印迹杂交检测,阳性率为50%,进一步表明目的基因成功整合到欧美杨108号基因组内。 展开更多
关键词 欧美杨108号 蜘蛛杀虫肽+bt毒蛋白基因 PCR-Southern印迹杂交
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8年生嫁接转基因杨树Bt毒蛋白的表达与运输 被引量:6
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作者 陈盼飞 任亚超 +2 位作者 张军 王进茂 杨敏生 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第7期46-52,共7页
【目的】研究经历多年生长和对复杂自然环境适应后,嫁接的8年生转基因741杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索成年树木Bt毒蛋白的运输部位、运输量、运输的方向性和积累等规律。【方法】利用转Bt Cry1Ac基因741杨与未转基因741杨互... 【目的】研究经历多年生长和对复杂自然环境适应后,嫁接的8年生转基因741杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索成年树木Bt毒蛋白的运输部位、运输量、运输的方向性和积累等规律。【方法】利用转Bt Cry1Ac基因741杨与未转基因741杨互为砧木和接穗进行嫁接,在自然条件下生长8年后,对2种不同嫁接方式杨树砧木和接穗的Bt Cry1Ac基因进行PCR检测和验证,利用ELISA技术对成年嫁接杨树的不同部位、不同组织进行毒蛋白含量检测。【结果】Bt Cry1Ac基因的PCR检测结果表明,Pb29/741嫁接杨中接穗部分和741/Pb29嫁接杨中砧木部分均扩增出与阳性对照大小一致的特异性条带,其余非转基因部分和阴性对照未扩增出特异性条带,证明Bt基因在嫁接杨树的转基因部分稳定存在,未发现外源基因丢失现象。ELISA检测表明,2种不同嫁接方式处理的741杨砧木和接穗的叶片、韧皮部、木质部和髓中均检测到Bt毒蛋白存在,证明Bt基因在8年生转基因嫁接741杨中稳定表达,且Bt毒蛋白可以在成年嫁接741杨的砧木和接穗间运输。Pb29/741成年株中,根部为非转基因部分,地上枝干部分为转基因组织,地上转基因组织能够表达Bt毒蛋白,其含量呈现出树冠外侧向内侧逐渐升高,树干部分向下又逐渐降低的趋势,且可以向根和树干基部非转基因组织运输和积累,以韧皮部运输为主。741/Pb29成年株中,根部为转基因部分,地上枝干为非转基因组织,根和树干基部组织也可以表达Bt毒蛋白,且可以由根部和干基部由枝干向树冠外侧运输并积累,以韧皮部运输为主;非转基因枝干部分呈现出树干向上逐渐降低,树冠内侧向外侧逐渐升高的趋势。【结论】尽管嫁接方式不同,嫁接的转基因杨树经历8年生长和复杂自然环境的影响和适应后,Bt毒蛋白的运输都呈现出由转基因组织向非转基因组织运输现象,毒蛋白含量呈现出类似由源向库运输和积累的趋势。转基因杨树可以通过传统嫁接方式在生产上应用,以提高转基因林木的生态安全性。 展开更多
关键词 转基因杨树 嫁接 bt毒蛋白 基因表达 蛋白运输
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山新杨转Bt+蜘蛛杀虫肽基因的分析 被引量:4
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作者 左丽丽 王志英 +1 位作者 梁臣 谢淑萍 《东北林业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期112-114,共3页
以山新杨(Populus davidiana Dode×P.bollena Lauche)为受体材料,在筛选遗传转化条件的基础上,利用农杆菌介导叶盘转化法进行了Bt+蜘蛛杀虫肽基因转化研究。结果表明:在叶片转化时,卡那霉素的临界质量浓度为10mg/L;生根筛选培养时... 以山新杨(Populus davidiana Dode×P.bollena Lauche)为受体材料,在筛选遗传转化条件的基础上,利用农杆菌介导叶盘转化法进行了Bt+蜘蛛杀虫肽基因转化研究。结果表明:在叶片转化时,卡那霉素的临界质量浓度为10mg/L;生根筛选培养时卡那霉素的临界质量浓度为15mg/L;利用质量浓度为600mg/L的头孢噻肟钠脱菌,对叶片生长和不定芽形成影响不大。山新杨遗传转化的工程菌菌液浓度以0.1~0.2(OD600)为最佳,其叶片分化率为73%~77%、抗性芽率为20%~23%;浸染时间以2~5min为宜,其叶片分化率和抗性芽率最高。在共培养基中加入200μmol/L的乙酰丁香酮,其叶片分化率和抗性芽率分别比对照提高1.43倍和2.61倍。对转化植株的PCR检测结果呈阳性,初步证明外源基因Bt+蜘蛛杀虫肽导入并整合进了山新杨基因组。 展开更多
关键词 山新杨 bt+蜘蛛杀虫肽基因 遗传转化
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RNAi介导的棉铃虫氨肽酶N基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR沉默对Cry1Ac毒力的影响 被引量:6
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作者 周慧丹 杨亦桦 吴益东 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期1097-1103,共7页
氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)和钙粘蛋白(cadherin)是存在于鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊(brush bordermembrane vesicles,BBMV)上Bt毒素Cry1A的受体。本实验将棉铃虫Helicoverpa armigera氨肽酶N1基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR双链RNA... 氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)和钙粘蛋白(cadherin)是存在于鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊(brush bordermembrane vesicles,BBMV)上Bt毒素Cry1A的受体。本实验将棉铃虫Helicoverpa armigera氨肽酶N1基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR双链RNA(dsRNA)注入棉铃虫4龄幼虫体内,以研究这两种受体基因沉默后对Cry1Ac毒力的影响。结果表明:注射dsRNA(1μg/头)进行基因沉默后,Haapn1mRNA表达量比注射缓冲液(elution solution,ES)的对照下降了30%~49%,Ha_BtRmRNA表达量下降了30%~37%。注射Haapn1dsRNA的幼虫在40和70μg/cm2Cry1Ac活化毒素下的死亡率显著低于注射ES的幼虫,而在100和170μg/cm2Cry1Ac原毒素处理下两者死亡率无显著差异;Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtRdsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异。当同时注射Haapn1及Ha_BtRdsRNA后,干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降。本研究进一步证明了棉铃虫Haapn1和Ha_BtR均是Bt毒素Cry1Ac的功能受体,这两种受体蛋白共同参与Cry1Ac的毒杀作用过程。该结果也提示,Haapn1或Ha_BtR基因产生突变都可能导致棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。 展开更多
关键词 棉铃虫 bt毒素受体 原毒素 RNA干扰 基因沉默 氨肽酶N 钙粘蛋白
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转多基因欧美杨Bt基因表达特征 被引量:4
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作者 张超 王进茂 +3 位作者 赵洁 庞丁玮 张德健 杨敏生 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第9期61-70,共10页
【目的】探究转多基因欧美杨107杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索转基因107杨不同时间、不同部位Bt毒蛋白表达规律,研究多基因转化的载体结构及基因互作对外源基因表达稳定性和高效性的影响。【方法】选取1年生转Cry1Ac-Cry3A-NT... 【目的】探究转多基因欧美杨107杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索转基因107杨不同时间、不同部位Bt毒蛋白表达规律,研究多基因转化的载体结构及基因互作对外源基因表达稳定性和高效性的影响。【方法】选取1年生转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨3个株系(A1、A2、A3)和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨3个株系(B1、B2、B3),通过PCR技术对转基因107杨中外源基因进行检测和验证,通过实时荧光定量PCR对Bt基因的转录丰度进行检测,利用ELISA技术对转基因107杨不同时间、不同部位毒蛋白含量进行检测。【结果】PCR检测结果显示,转基因107杨均能扩增出与阳性对照大小一致的特异性条带,阴性对照未扩增出特异性条带,证明外源基因在转基因107杨中稳定存在;实时荧光定量PCR检测结果表明,2种Bt基因在转基因107杨中均能稳定表达,Cry1Ac基因的转录丰度在2.1×10^4~5.1×10^4之间,Cry3A基因的转录丰度在2.8×10^6~5.6×10^7之间,Cry1Ac基因和Cry3A基因转录丰度无相关性;ELISA技术检测结果显示,转基因107杨中均检测到Cry1Ac和Cry3A毒蛋白存在。2种Bt基因转录丰度和毒蛋白含量无相关性,但2种Bt毒蛋白含量之间呈现出正相关关系。转2种不同载体的107杨6、7月份2种Bt毒蛋白的含量较低,8月份急剧上升,Cry1Ac毒蛋白的含量均在9月份达到峰值,Cry3A毒蛋白含量均在8月份达到峰值,10月急剧下降。8月份不同部位(上、中、下)的叶片Bt毒蛋白含量未表现出一致性规律,不同部位(上、中、下)木质部的Bt毒蛋白含量也未呈现出一致性规律。【结论】转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨不同株系间2种Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因;2种Bt毒蛋白在各株系间存在显著差异,Cry1Ac毒蛋白含量极低,Cry3A毒蛋白含量极显著高于Cry1Ac,与转录水平检测结果一致。2种不同载体之间Cry1Ac基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量无明显差异,Cry3A基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量也无明显差异。在转基因107杨整个生长季中,Cry1Ac和Cry3A平均毒蛋白含量变化趋势基本一致,呈单峰模式。 展开更多
关键词 转基因杨树 多基因载体 基因互作 外源基因表达 bt毒蛋白
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南疆三地棉铃虫田间种群对Bt棉的抗性频率监测
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作者 宁忠雄 李维政 +5 位作者 梁赫 秦子昕 王冬梅 李海强 刘冰 路伟 《环境昆虫学报》 CSCD 北大核心 2021年第2期479-484,共6页
为了监测南疆主要Bt棉区棉铃虫田间种群对Bt棉的抗性频率,分别采集库尔勒、阿克苏、泽普三地的棉铃虫单雌系,以Bt毒蛋白作为人工饲料,采用单雌系F 1代法进行棉铃虫田间种群抗性个体检测。本文从库尔勒、阿克苏、泽普三地分别筛选了57个... 为了监测南疆主要Bt棉区棉铃虫田间种群对Bt棉的抗性频率,分别采集库尔勒、阿克苏、泽普三地的棉铃虫单雌系,以Bt毒蛋白作为人工饲料,采用单雌系F 1代法进行棉铃虫田间种群抗性个体检测。本文从库尔勒、阿克苏、泽普三地分别筛选了57个、106个、92个棉铃虫单雌系。三地棉铃虫单雌系幼虫在正常饲料和Cry1Ac饲料上的平均发育级别呈线性相关,相对平均发育级别平均值分别为0.5210、0.4935、0.4623,无≥0.8的个体,估测南疆三地棉铃虫种群的Bt抗性基因频率均小于0.001。泽普玉米种植比例较高,可有效稀释棉铃虫种群的Bt抗性基因,因此泽普的棉铃虫种群敏感度最高。本研究可为新疆Bt棉区棉铃虫的抗性治理提供科学依据。 展开更多
关键词 bt 棉铃虫 Cry1Ac蛋白 抗性基因频率 南疆
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抗虫转基因欧洲黑杨的Western印迹法分析 被引量:21
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作者 陈颖 李强 +2 位作者 李玲 韩一凡 田颖川 《林业科学》 CAS CSCD 北大核心 1996年第3期274-276,共3页
抗虫转基因欧洲黑杨的Western印迹法分析陈颖,李强,李玲,韩一凡,田颖川(中国林业科学研究院林业研究所北京100091)(中国科学院微生物研究所北京100080)关键词Bt.基因,转基因欧洲黑杨,Western印... 抗虫转基因欧洲黑杨的Western印迹法分析陈颖,李强,李玲,韩一凡,田颖川(中国林业科学研究院林业研究所北京100091)(中国科学院微生物研究所北京100080)关键词Bt.基因,转基因欧洲黑杨,Western印迹法WESTERNBLOTANAL... 展开更多
关键词 转基因 黑杨 Western 印迹法 抗虫性
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外源抗虫基因对棉花杂种优势的影响 被引量:3
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作者 张永山 吕友军 郭红祥 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期215-220,共6页
利用 3种不同外源抗虫基因棉及其受体和同一常规棉杂交 ,研究外源抗虫基因对棉花杂交F1的抗虫性和主要农艺性状的影响。结果表明 ,3种外源基因对杂交F1的优势影响较一致。杂交F1的抗虫性没有杂种优势 ,不同发育阶段叶片的抗虫性均不高... 利用 3种不同外源抗虫基因棉及其受体和同一常规棉杂交 ,研究外源抗虫基因对棉花杂交F1的抗虫性和主要农艺性状的影响。结果表明 ,3种外源基因对杂交F1的优势影响较一致。杂交F1的抗虫性没有杂种优势 ,不同发育阶段叶片的抗虫性均不高于其抗虫亲本 ,但和其抗虫亲本有相似的时间变化规律。在花铃期杂交F1的不同器官的抗虫性差异较大 ,杂交F1叶片的抗虫性低于抗虫亲本 ,花蕊、幼蕾、幼铃等生殖器官的抗虫性好于其抗虫亲本。Bt毒蛋白含量测定结果和室内抗虫性鉴定表现基本一致。外源抗虫基因对杂交F1的产量性状和纤维品质性状总体上无影响。外源抗虫基因可提高早熟性 ,第一果枝节位的中亲优势和竞争优势有显著差异。 展开更多
关键词 棉花 杂种优势 外源抗虫基因 抗虫性 农艺性状 棉铃虫
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植物外源抗虫基因及其应用 被引量:5
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作者 程茂高 乔卿梅 原国辉 《生物技术通报》 CAS CSCD 2004年第5期18-20,共3页
目前植物外源抗虫基因在植物基因工程中得到了广泛的应用。本文概述了植物外源抗虫基因的种类、作用机理及其应用概况 ,并对今后外源抗虫基因的主要研究方向作了探讨。
关键词 外源 抗虫基因 植物基因工程 作用机理 种类 应用概况 研究方向
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鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用 被引量:5
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作者 徐重新 张霄 +6 位作者 张存政 刘媛 仲建锋 董飒 胡晓丹 林曼曼 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第1期210-217,共8页
构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸... 构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。 展开更多
关键词 噬菌体展示库 单链抗体 重叠延伸PCR 噬菌粒载体 bt毒素
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蜘蛛毒素基因(ω-ACTX-Hv2a)的人工合成及定点突变
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作者 易小平 邓柳红 张春发 《热带作物学报》 CSCD 2008年第1期53-57,共5页
蜘蛛毒素(ω-ACTX-Hv2a)是最理想研制成为无公害杀虫剂的昆虫毒素肽之一,但由于其cDNA至今还未被克隆出来;为了进行后续研究工作,笔者选用人工合成的办法进行基因克隆等工作。化学合成4对(A1-、A1+,A2-、A2+,H3-、H3+和H4-、H4+)单链寡... 蜘蛛毒素(ω-ACTX-Hv2a)是最理想研制成为无公害杀虫剂的昆虫毒素肽之一,但由于其cDNA至今还未被克隆出来;为了进行后续研究工作,笔者选用人工合成的办法进行基因克隆等工作。化学合成4对(A1-、A1+,A2-、A2+,H3-、H3+和H4-、H4+)单链寡核苷酸片段,然后,将片段A1-、A1+、A2-、A2+和片段H3-、H3+、H4-、H4+分别混合后退火连接,形成A和H片段,再将A和H片段在连接酶的作用下,合成全基因Hv2a。经测序可知,合成的Hv2a有5个碱基缺失;利用"循环延伸"的方法,经2次定点突变后,通过克隆测序证明Hv2a全基因序列完全正确,说明这种定点突变的方法是可行的。 展开更多
关键词 蜘蛛毒素基因(ω-ACTX-Hv2a) 基因合成基因突变
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小菜蛾中肠Polycalin蛋白的基因克隆、表达及与Cry1Ac毒素的结合特性分析 被引量:2
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作者 展恩玲 杜潇 +3 位作者 赵爱平 孙聪 刘同先 李怡萍 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期1155-1167,共13页
【目的】Polycalin蛋白是一种新发现的Bt毒素受体,可能与昆虫对Bt的抗性有关。本研究旨在明确小菜蛾Plutella xylostella Polycalin蛋白与Bt Cry1Ac毒素的关系。【方法】本研究通过PCR结合RACE技术从小菜蛾3龄幼虫中肠克隆获得Polycali... 【目的】Polycalin蛋白是一种新发现的Bt毒素受体,可能与昆虫对Bt的抗性有关。本研究旨在明确小菜蛾Plutella xylostella Polycalin蛋白与Bt Cry1Ac毒素的关系。【方法】本研究通过PCR结合RACE技术从小菜蛾3龄幼虫中肠克隆获得Polycalin蛋白基因的全长cDNA序列,采用实时定量PCR技术研究Polycalin蛋白在小菜蛾不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及用不同浓度Cry1Ac毒素饲喂3龄幼虫后的表达量。提取小菜蛾幼虫中肠的刷状缘膜囊泡(BBMV),运用合成多肽的方法制备Polycalin蛋白抗体,利用Western blot和Ligand blot技术对小菜蛾Polycalin蛋白进行鉴定,分析其与Cry1Ac毒素的结合特性。【结果】克隆得到的小菜蛾Polycalin蛋白基因的cDNA序列全长为9 102 bp(GenBank登录号:MF138149),其中,开放阅读框为8 778 bp,编码2 925个氨基酸;预测蛋白质分子量为326.38 kD,等电点为4.39;在推导的氨基酸序列中,前20个氨基酸为N-末端信号肽序列,含有14个N-糖基化位点,67个O-糖基化位点,6个脂质运载蛋白特征序列,6个脂质运载蛋白位点和13个类脂质运载蛋白结构域,并且在第20和21位(TSG-QVV)氨基酸之间存在一个裂解位点,在C-末端存在2个GPI结合位点,具有Bt毒素受体的特征。该蛋白在幼虫期的表达量较高,尤其在3龄幼虫体内表达量最高,在蛹和成虫中的表达量最低;在4龄幼虫的头、胸、腹中均有表达,在幼虫腹部中的表达量最高;3龄幼虫取食不同浓度的Cry1Ac毒素后,Polycalin蛋白的表达量下降,且Cry1Ac毒素浓度越高,下降越明显。通过Western blot检测到小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上存在大约300 kD的Polycalin蛋白条带;Ligand blot实验证明了小菜蛾Polycalin蛋白能与Cry1Ac毒素结合。【结论】本研究首次初步明确了小菜蛾Polycalin蛋白具有与Bt毒素结合的特性,为研究Bt对昆虫的作用机理和利用Bt防治害虫提供一定的理论基础和参考价值。 展开更多
关键词 小菜蛾 bt毒素 Polycalin 基因克隆 基因表达 Cry1Ac毒素
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昆虫氨肽酶N的研究进展 被引量:1
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作者 常晓丽 吴青君 +2 位作者 王少丽 徐宝云 张友军 《农药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期213-220,共8页
氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一种偏好水解蛋白或寡肽N端中性氨基酸的酶,广泛分布于动植物中。在昆虫中,APN主要分布于中肠刷状缘膜上,涉及食物蛋白的消化以及Bt毒素对靶标害虫的作用。从APN的结构特征和分类地位、APN的分离纯化及... 氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一种偏好水解蛋白或寡肽N端中性氨基酸的酶,广泛分布于动植物中。在昆虫中,APN主要分布于中肠刷状缘膜上,涉及食物蛋白的消化以及Bt毒素对靶标害虫的作用。从APN的结构特征和分类地位、APN的分离纯化及其酶活性位点与结合位点的相关性、APN同工酶的区分特征及系统发育关系、APN同工酶的基因功能、不同APN同工酶在昆虫体内的分布及表达量、APN基因功能最新研究方法和结果以及APN与昆虫抗药性的关系等方面概述了昆虫APN的最新研究进展。鉴于昆虫体内受体的多样性、复杂性及当前研究手段的局限性,对APN功能的全面了解还有赖于研究方法的改进和提高而逐步深入。 展开更多
关键词 氨肽酶N同工酶 bt毒素 系统进化 基因功能 昆虫
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