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肝脏特异性表达载体的构建及Western blotting检测 被引量：1
1
作者 张利涛 刘慧琳 曹以诚 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第1期100-104,共5页
研究靶向于肝细胞的组织特异性siRNA,实现siRNA基因治疗的组织特异性,可用于特异性治疗乙肝,突破RNA干扰技术在临床应用的一大障碍。用靶向于EGFP的siRNA(以下简称siEGFP)替代靶向于乙肝病毒保守区的siRNA,构建可以在肝细胞中特异性表... 研究靶向于肝细胞的组织特异性siRNA,实现siRNA基因治疗的组织特异性,可用于特异性治疗乙肝,突破RNA干扰技术在临床应用的一大障碍。用靶向于EGFP的siRNA(以下简称siEGFP)替代靶向于乙肝病毒保守区的siRNA,构建可以在肝细胞中特异性表达的载体,用来表达siRNA。将目标载体分别转染肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MDB-MB-231、人胚肾细胞293,在蛋白质水平上检验siRNA抑制的组织特异性。Western blotting结果证实,siEGFP在肝组织来源的细胞系HepG2中抑制效率明显高于其他两组细胞。构建的载体可以在肝癌细胞系中特异性的表达siRNA,而在其他组织细胞中不表达,实现了组织特异性。进一步将siEGFP替换为抑制HBV表达的siRNA,同样可以实现肝脏特异性的表达。 展开更多
关键词 RNAI 组织特异性siRNA 肝脏特异性 EGFP WESTERN blotting
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日粮纳米锌水平对公羊睾丸和附睾Cu-ZnSOD表达的影响 被引量：7
2
作者 任有蛇 秦小伟 +4 位作者 郭丽娜 赵辉 刘文忠 张建新 张春香 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1622-1630,共9页
旨在研究日粮纳米锌对公羊睾丸和附睾铜锌超氧化物歧化酶基因(Cu-ZnSOD)mRNA和蛋白表达的影响。将16只9月龄体重相近、健康状况良好的晋中绵羊公羊随机分成4组,分别喂给基础日粮(对照组),基础日粮+纳米锌(50、100和150mg·kg-1 DM)... 旨在研究日粮纳米锌对公羊睾丸和附睾铜锌超氧化物歧化酶基因(Cu-ZnSOD)mRNA和蛋白表达的影响。将16只9月龄体重相近、健康状况良好的晋中绵羊公羊随机分成4组,分别喂给基础日粮(对照组),基础日粮+纳米锌(50、100和150mg·kg-1 DM)。预饲期10d,正试期80d。试验结束时采集绵羊睾丸和附睾组织。采用RT-PCR、Western blotting和免疫组化技术检测其Cu-ZnSOD mRNA、Cu-ZnSOD蛋白表达及在睾丸中定位情况。结果显示:绵羊睾丸和附睾组织Cu-ZnSOD mRNA表达量顺序是附睾头≥睾丸>附睾体>附睾尾。日粮添加50~100mg·kg-1纳米锌可增加其睾丸和附睾组织Cu-ZnSOD mRNA和蛋白表达量。免疫组化结果显示CuZnSOD在睾丸的生精细胞中有强阳性信号,间质细胞有弱阳性信号。综上表明,绵羊睾丸和附睾不同区段CuZnSOD mRNA和蛋白表达有差异。日粮添加适量锌可提高睾丸和附睾中Cu-ZnSOD mRNA和蛋白表达量,其作用机制仍需进一步研究。 展开更多
关键词 Cu-ZnSOD RT-PCR WESTERN blotting 睾丸 附睾 公羊
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从毕赤酵母中提取外源重组蛋白的超声破碎条件及优化 被引量：11
3
作者 戴佳锟 李燕 +5 位作者 马齐 关正君 张超 张艳婷 赵荣荣 尉亚辉 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第10期57-60,共4页
建立适用于从毕赤酵母菌中提取外源重组蛋白的超声破碎方法。采用Western Blotting免疫印记技术检测从毕赤酵母菌中提取的外源人脂联素蛋白活性,并以外源人脂联素蛋白活性作为考察指标,采用单因素和L9(33)正交试验设计,对超声破碎条件... 建立适用于从毕赤酵母菌中提取外源重组蛋白的超声破碎方法。采用Western Blotting免疫印记技术检测从毕赤酵母菌中提取的外源人脂联素蛋白活性,并以外源人脂联素蛋白活性作为考察指标,采用单因素和L9(33)正交试验设计,对超声破碎条件进行优化。结果表明:在外源人脂联素蛋白活性最高的情况下,超声破碎条件为超声破碎功率450W、时间25min、时间间隔(工作时间:间歇时间)10:10(s/s),此时细胞破碎率为(67.8±2.1)%。若在超声破碎时添加1mmol/L PMSF,虽对细胞破碎率并无显著影响,但外源人脂联素蛋白活性将会明显增高。 展开更多
关键词 毕赤酵母 超声破碎法 人脂联素蛋白 WESTERN blotting免疫印记技术
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甘草总黄酮对高脂条件下罗非鱼肝损伤的保护作用 被引量：5
4
作者 杜金梁 曹丽萍 +6 位作者 贾睿 顾郑琰 何勤 徐跑 JENEY Galina 马玉忠 殷国俊 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2021年第10期1826-1835,共10页
为了研究甘草总黄酮对高脂饲料造成的罗非鱼(Oreochromis niloticus)脂肪肝损伤是否具有保护作用,随机将180尾健康无伤罗非鱼分成6组,即对照组、高脂饲料模型组和4个不同浓度甘草总黄酮组(0.05、0.10、0.50、1.00 g·kg^(-1)甘草总... 为了研究甘草总黄酮对高脂饲料造成的罗非鱼(Oreochromis niloticus)脂肪肝损伤是否具有保护作用,随机将180尾健康无伤罗非鱼分成6组,即对照组、高脂饲料模型组和4个不同浓度甘草总黄酮组(0.05、0.10、0.50、1.00 g·kg^(-1)甘草总黄酮),每组30尾。饲喂90 d后,采集罗非鱼各实验组肝,测定肝匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)活性、丙二醛(MDA)含量、甘油三酯(TG)含量、总胆固醇(TC)含量、总抗氧化能力(T-AOC)水平,Western blotting法检测肝中核转录因子-κB P65(NF-κB P65)和核转录因子-κB C-Rel(NF-κB C-Rel)蛋白表达水平,RT-PCR法测定肝中微粒体甘油三酸酯转移蛋白(MTTP)和载脂蛋白B100(ApoB100)基因表达情况。结果表明:与对照组相比,高脂饲料模型组罗非鱼肝匀浆中TG、TC、MDA含量极显著(P<0.01)升高,GSH活性、SOD活性、T-AOC水平均极显著(P<0.01)降低;MTTP和ApoB100 mRNA表达水平降低(P<0.01或P<0.05);Western blotting结果显示,NF-κB P 65和C-Rel蛋白表达水平升高。饲料中加入甘草总黄酮后,与高脂饲料模型组相比,罗非鱼肝中GSH活性、SOD活性、T-AOC水平不同程度提高,TC、TG、MDA含量和NF-κB P65、C-Rel蛋白表达水平不同程度降低,MTTP和ApoB100的mRNA表达水平升高,以0.50 g·kg^(-1)甘草总黄酮组效果较好。说明甘草总黄酮对于罗非鱼脂肪肝损伤具有一定的保护作用,可以缓解高脂饲料造成的脂肪肝损伤。 展开更多
关键词 甘草 总黄酮 罗非鱼 脂肪肝 基因表达 Western blotting
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雄激素受体基因在绵羊公羔不同组织中的表达特性及性腺中的定位 被引量：4
5
作者 李振 任有蛇 +3 位作者 焦光月 白元生 秦小伟 张春香 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1251-1257,共7页
旨在研究雄激素受体(Androgen receptors,ARs)基因在绵羊公羔不同组织中的表达特性及在性腺中的定位。本研究以QRT-PCR法检测各组织ARmRNA表达规律,免疫组化技术对睾丸和附睾中AR进行定位分析,蛋白质印迹技术对AR蛋白表达量进行定性研... 旨在研究雄激素受体(Androgen receptors,ARs)基因在绵羊公羔不同组织中的表达特性及在性腺中的定位。本研究以QRT-PCR法检测各组织ARmRNA表达规律,免疫组化技术对睾丸和附睾中AR进行定位分析,蛋白质印迹技术对AR蛋白表达量进行定性研究。结果显示:(1)AR在不同组织中均有不同程度的表达,其中在睾丸和心脏中大量表达;(2)在附睾头、体、尾部单层柱状上皮细胞和间质细胞中检测到较弱的阳性信号;睾丸组织间质细胞、精原细胞、管周肌样细胞检测到强阳性信号。综上表明:AR在绵羊不同组织中广泛表达,AR在性腺的发育和精子的成熟过程以及对心脏的保护方面发挥重要作用,其作用机制需进一步研究。 展开更多
关键词 雄激素受体基因(AR) 绵羊 QRT-PCR WESTERN blotting 睾丸 附睾
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小鼠出生后背部毛囊发育与Lef-1表达的研究 被引量：4
6
作者 王海东 杨磊 +5 位作者 王祎 于秀菊 董彦君 赫晓燕 马淑慧 董常生 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期382-387,共6页
旨在研究Lef-1在小鼠背部毛囊生长周期中的表达规律及其与毛囊生长更替的关系。本试验采用石蜡切片HE染色、Western blotting以及免疫组织化学方法,研究小鼠毛囊的周期性变化,检测Lef-1在小鼠毛囊生长的不同时期皮肤组织中的蛋白表达水... 旨在研究Lef-1在小鼠背部毛囊生长周期中的表达规律及其与毛囊生长更替的关系。本试验采用石蜡切片HE染色、Western blotting以及免疫组织化学方法,研究小鼠毛囊的周期性变化,检测Lef-1在小鼠毛囊生长的不同时期皮肤组织中的蛋白表达水平,并对其进行组织定位。结果,昆明系小鼠毛囊生长呈周期性变化,处于不同生长时期的毛囊具有各期的特殊结构;Western blotting结果显示,在各阶段皮肤组织中存在Lef-1蛋白的表达,其在毛囊生长初期的表达量显著高于中期和末期;免疫组织化学结果显示,Lef-1在不同毛囊生长时期的皮脂腺、根鞘和真皮乳头均有不同程度的表达。Lef-1的表达与毛囊的周期性变化存在相关性。 展开更多
关键词 毛囊生长周期 Lef-1 WESTERN blotting 免疫组织化学 小鼠
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小鼠骨桥蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定 被引量：5
7
作者 刘祥 陈春琳 +3 位作者 王杨科 俱雄 吴三桥 张涛 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第5期1069-1075,共7页
为探索骨桥蛋白(OPN)调控骨代谢及与肿瘤的关系,本试验利用DNAMAN与Mega 5.02软件分析OPN蛋白系统进化关系;采用RT-PCR与分子克隆方法制备OPN蛋白表达载体;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素浓度梯度复性获得OPN蛋白,免疫小鼠制备OPN蛋白... 为探索骨桥蛋白(OPN)调控骨代谢及与肿瘤的关系,本试验利用DNAMAN与Mega 5.02软件分析OPN蛋白系统进化关系;采用RT-PCR与分子克隆方法制备OPN蛋白表达载体;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素浓度梯度复性获得OPN蛋白,免疫小鼠制备OPN蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度,Western blotting检测抗血清特异性。OPN序列的同源性比对分析发现,在不同进化层次动物中均存在Arg-Gly-Asp(RGD)短肽重复序列;OPN序列系统进化分析显示,OPN在动物间具有明显的进化趋势;提取小鼠肝脏RNA,OPN重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果及蛋白表达、纯化条带大小均与预测一致;ELISA法确认OPN抗血清滴度达1∶1 600;Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。结果表明本试验对OPN序列进行了遗传进化分析,成功克隆、表达、纯化及复性OPN蛋白,并制备、鉴定了小鼠多克隆抗体。 展开更多
关键词 OPN蛋白 RT—PCR 多克隆抗体 ELISA WESTERN blotting
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鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株VP1基因克隆、原核表达及抗原性分析 被引量：5
8
作者 向毅勇 罗薇 +3 位作者 靳艳玲 刘内生 刘群 龙虎 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第12期68-73,共6页
应用巢氏PCR(nested-PCR)扩增出1型鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株结构蛋白VP1基因片段,将VP1克隆到pMD18-T载体上,测序结果为714 bp,GenBank登录号:GU363950。对MY株VP1基因编码蛋白的主要抗原位点进行预测,aa208-aa222氨基酸区段表现很高... 应用巢氏PCR(nested-PCR)扩增出1型鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株结构蛋白VP1基因片段,将VP1克隆到pMD18-T载体上,测序结果为714 bp,GenBank登录号:GU363950。对MY株VP1基因编码蛋白的主要抗原位点进行预测,aa208-aa222氨基酸区段表现很高的亲水性、抗原指数和表面可及性。VP1经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得重组质粒pET-VP1,转入BL21 PLyss(DE3)细胞中,IPTG诱导后SDS-PAGE检测结果表明,在大肠杆菌中表达了1个相对分子质量为47 ku的融合蛋白。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白可与鸭肝炎标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 鸭肝炎 原核表达 SDS-PAGE Western blotting
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蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及免疫原性鉴定 被引量：5
9
作者 贾赟 王贞钧 +5 位作者 孙铭英 张雪 张永宁 栾慎顺 王全凯 孙颖杰 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第8期2000-2005,共6页
为获得蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)25型的VP7原核表达蛋白,本试验以蓝舌病病毒重组质粒为模板,PCR扩增VP7基因,将其克隆于pET-24b(+)表达载体中,获得pET-24b-BTV-VP7重组质粒。经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,I... 为获得蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)25型的VP7原核表达蛋白,本试验以蓝舌病病毒重组质粒为模板,PCR扩增VP7基因,将其克隆于pET-24b(+)表达载体中,获得pET-24b-BTV-VP7重组质粒。经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达His-BTV-VP7蛋白。在变性条件下用镍亲和层析柱纯化His-BTV-VP7蛋白,经Western blotting及ELISA鉴定其免疫原性。结果显示,His-BTV-VP7蛋白以包涵体形式表达,大小约为40ku;Western blotting和ELISA检测此原核表达蛋白能与山羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性。本研究为后续建立蛋白芯片检测方法奠定了基础。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 原核表达 WESTERN blotting ELISA
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藏猪促红细胞生成素的表达与低氧适应分析 被引量：3
10
作者 吴洪 德吉巴卓 +3 位作者 张健 王亚非 张浩 强巴央宗 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第4期156-160,共5页
为了解藏猪肾脏中促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的表达与其低氧适应之间的关系,采用Western blotting技术检测西藏林芝地区(海拔约3000m)的高海拔藏猪(ZZ)和高海拔大约克夏猪(YZ)、北京中顺景盛养殖场(海拔约100m)的低海拔藏猪(ZB... 为了解藏猪肾脏中促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的表达与其低氧适应之间的关系,采用Western blotting技术检测西藏林芝地区(海拔约3000m)的高海拔藏猪(ZZ)和高海拔大约克夏猪(YZ)、北京中顺景盛养殖场(海拔约100m)的低海拔藏猪(ZB)和安徽合肥市(海拔约为36m)的低海拔大约克夏猪(YH)肾脏组织EPO蛋白的表达量。结果发现,ZZ、ZB、YZ、YH的EPO表达量,在A组试验中,高海拔藏猪与高海拔大约克夏猪差异显著(P<0.05),高海拔大约克夏猪与低海拔藏猪、低海拔大约克夏猪差异极显著(P<0.01);B组试验中,高海拔藏猪与低海拔藏猪差异不显著(P>0.05),高海拔藏猪与高、低海拔大约克夏猪差异显著(P<0.05);C组试验中,高、低海拔藏猪间差异显著(P<0.05),低海拔藏猪与高、低海拔大约克夏猪差异极显著(P<0.01)。当大约克夏猪处在高海拔应急状态下时,EPO的表达量高于藏猪。而长期生活在高原的大约克夏猪EPO的表达量较藏猪低,但高于低海拔大约克夏猪。EPO的稳定表达是藏猪适应高原低氧环境的一个重要因素,而高原大约克夏猪肾脏组织内EPO的高表达,则是大约克夏猪适应高原低氧环境的生理调节过程。 展开更多
关键词 藏猪 大约克夏猪 Western blotting 肾脏组织 EPO蛋白 差异性 低氧适应
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免疫组化和蛋白质印迹中抗原-抗体反应方法的改进 被引量：3
11
作者 王乔 程蓓 +1 位作者 潘伯群 宋健 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期112-113,共2页
关键词 抗原-抗体反应 蛋白质印迹 免疫组化 blotting 特异性免疫反应 蛋白表达 医学科研
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犬瘟热病毒H蛋白的原核表达及免疫原性的初步鉴定 被引量：3
12
作者 袁颖烁 宋菲菲 +1 位作者 张乐萃 扈荣良 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第4期40-45,共6页
本研究旨在对犬瘟热病毒(CDV)疫苗株H基因进行克隆及原核表达,并对产物的免疫原性做初步鉴定。根据犬瘟热病毒参考株Ondetstepoort的H基因序列,去除信号肽序列并选取其主要抗原表位设计引物,用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的片... 本研究旨在对犬瘟热病毒(CDV)疫苗株H基因进行克隆及原核表达,并对产物的免疫原性做初步鉴定。根据犬瘟热病毒参考株Ondetstepoort的H基因序列,去除信号肽序列并选取其主要抗原表位设计引物,用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的片段;产物克隆至表达载体pET28b并转化宿主菌RosettaTM,优化诱导表达条件,纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定、Western blotting分析及间接酶联免疫吸附试验(ELISA);并将纯化的H蛋白免疫小鼠,进行中和试验检测抗体效价。结果显示,PCR扩增得到1113bp DNA片段;在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导条件下可获得较高水平的表达;经SDS-PAGE鉴定,表达的H蛋白分子质量为42.38ku,与预期值相符;Western blotting显示,在42.38ku出现特异性目的条带;ELISA结果显示,表达的H蛋白能被抗CDV抗体识别,但与正常血清未发生非特异性反应;中和试验结果表明,血清中和抗体效价约为2-3.3。结果提示,H蛋白获得了正确表达,对CDV抗血清具有特异反应性,可作为实时检测动物机体免疫状况检测的候选抗原,为进一步研制犬瘟热抗体检测ELISA试剂盒和新型疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 H基因 原核表达 WESTERN blotting 活性
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绵羊卵母细胞超低温冷冻对四跨膜蛋白CD9表达的影响 被引量：3
13
作者 乌丽雅苏 乌亚罕 +5 位作者 史振丹 爱伦高娃 扎木嘎 乌云斯钦 恩和玛日特 娜仁花 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第8期2104-2111,共8页
试验旨在探讨不同发育时期卵泡上四跨膜蛋白CD9的表达,以及体外成熟和超低温冷冻对绵羊卵母细胞CD9的影响。采用免疫组织化学技术检测CD9蛋白在卵泡上的表达部位,实时荧光定量PCR技术检测CD9mRNA的表达量,Western blotting技术检测CD9... 试验旨在探讨不同发育时期卵泡上四跨膜蛋白CD9的表达,以及体外成熟和超低温冷冻对绵羊卵母细胞CD9的影响。采用免疫组织化学技术检测CD9蛋白在卵泡上的表达部位,实时荧光定量PCR技术检测CD9mRNA的表达量,Western blotting技术检测CD9蛋白的含量。免疫组织化学结果发现,在绵羊原始卵泡上就开始检测到CD9荧光信号,且随着卵泡的成熟荧光信号逐渐增强,成熟卵泡时荧光信号达到最强;实时荧光定量PCR检测新鲜MⅡ期卵母细胞中CD9mRNA的表达量显著增高(P<0.05),冷冻GV期卵母细胞CD9mRNA的表达量最少;Western blotting检测得出新鲜MⅡ期卵母细胞中CD9蛋白表达最多,冷冻GV期卵母细胞上表达最少,与实时荧光定量PCR结果一致。卵母细胞的冷冻保存要比胚胎保存应用前景广泛,而四跨膜蛋白CD9在精卵融合中更有着重要的作用,以上结果均显示,冷冻保存降低卵母细胞四跨膜蛋白CD9含量,而CD9的损伤是受精率下降的重要原因之一。 展开更多
关键词 CD9 卵巢 卵母细胞 体外成熟 免疫组化 Western blotting 实时荧光定量PCR
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胎衣不下奶牛母体胎盘α-烯醇化酶异常表达分析及验证 被引量：2
14
作者 邹晓 刘瑶 +6 位作者 郑程远 张璐莹 许启有 李诗莹 罗春海 刘健莹 付世新 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第10期2714-2719,共6页
试验通过对胎衣不下奶牛母体胎盘组织中差异α-烯醇化酶(enolase,ENO1)的分析验证,探讨ENO1在胎衣不下中的作用。本研究选取了年龄、胎次、体重和泌乳量均相近的产后胎衣不下和产后胎衣正常排出奶牛各3头,分为两组,提取了胎衣不下组与... 试验通过对胎衣不下奶牛母体胎盘组织中差异α-烯醇化酶(enolase,ENO1)的分析验证,探讨ENO1在胎衣不下中的作用。本研究选取了年龄、胎次、体重和泌乳量均相近的产后胎衣不下和产后胎衣正常排出奶牛各3头,分为两组,提取了胎衣不下组与胎衣正常排出组母体胎盘组织中的总蛋白,采用双向凝胶电泳的方法筛选出差异蛋白,并利用Western blotting及实时荧光定量PCR的方法对其中差异表达量大的ENO1进行验证。结果发现,胎衣不下组和胎衣正常组母体胎盘组织中ENO1差异表达量大且倍数较大,Western blotting及实时荧光定量PCR验证发现ENO1在胎衣不下奶牛母体胎盘中的表达量升高,t检验结果分别为P=0.015<0.05,差异显著;P=0.001<0.01,差异极显著。该基因参与机体的能量调节、免疫和纤溶等过程,而这些过程与奶牛胎衣不下密切相关,提示ENO1可能参与该病的发生发展。 展开更多
关键词 胎衣不下 ENO1 WESTERN blotting 实时荧光定量PCR
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绵羊透明质酸酶-2的真核表达及鉴定 被引量：2
15
作者 张月梅 么宏强 +1 位作者 斯日古楞 马学恩 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第11期35-39,共5页
为了构建绵羊透明质酸酶-2(hyaluronidase 2,Hyal-2)的真核表达载体并实现其在牛乳腺上皮细胞内瞬时表达,根据GenBank中绵羊Hyal-2基因序列(登录号:NM_001009754)设计2对引物,并分别在前段上游和后段下游引物5′端引入HindⅢ酶切位点和B... 为了构建绵羊透明质酸酶-2(hyaluronidase 2,Hyal-2)的真核表达载体并实现其在牛乳腺上皮细胞内瞬时表达,根据GenBank中绵羊Hyal-2基因序列(登录号:NM_001009754)设计2对引物,并分别在前段上游和后段下游引物5′端引入HindⅢ酶切位点和BamHⅠ酶切位点,同时在上游引物酶切位点后加入KOZAK序列,进行分段PCR扩增。以扩增的两段产物为共同模板运用重叠(overlapping)PCR技术扩增Hyal-2基因全长。通过连接反应将双酶切并纯化后的目的片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1上,并通过脂质体转染法将构建好的真核表达载体转染牛乳腺上皮细胞,运用RT-PCR及West-ern blotting方法分别从核酸及蛋白质水平验证其表达。经测序分析,目的片段与模板核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为99%,且片段插入方向正确。RT-PCR及Western blotting方法检测均出现目的条带,证明成功构建了绵羊透明质酸酶-2的真核表达载体,并在牛乳腺上皮细胞中获得表达。 展开更多
关键词 透明质酸酶-2 真核表达 RT-PCR WESTERN blotting
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EgM123免疫犬血清抗体监测 被引量：4
16
作者 赵莉 张壮志 +7 位作者 石保新 古努尔.吐尔逊 米晓云 吐尔洪.依米提 王进成 马正海 张文宝 李国庆 《草食家畜》 2011年第4期72-75,共4页
【目的】探索EgM家族重组蛋白(EgM 123)与弗氏佐剂结合免疫犬后血清抗体变化规律。【方法】利用间接ELISA法检测免疫组与对照组血清特异性抗体(IgG)的变化规律,并以Western-blotting方法进行验证。【结果】ELISA实验结果经统计学方法分... 【目的】探索EgM家族重组蛋白(EgM 123)与弗氏佐剂结合免疫犬后血清抗体变化规律。【方法】利用间接ELISA法检测免疫组与对照组血清特异性抗体(IgG)的变化规律,并以Western-blotting方法进行验证。【结果】ELISA实验结果经统计学方法分析显示,不中和免疫组与对照组血清抗体时,特异性抗体IgG差异不显著(P>0.05),但中和血清抗体时,差异显著(P<0.05)。【结论】中和血清抗体,能够更明显的看到EgM家族重组蛋白(EgM 123)引起的犬特异性免疫应答。 展开更多
关键词 重组蛋白EgM 123 特异性抗体 犬 ELISA Western—blotting
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膜孕激素受体(mPRα)在半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)卵母细胞成熟过程中的表达特征 被引量：1
17
作者 李晓妮 柳学周 +2 位作者 史宝 徐永江 张金勇 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2017年第1期25-33,共9页
通过实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,通过qRT-PCR和Western blotting方法检测促性腺激素(HCG)对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表... 通过实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,通过qRT-PCR和Western blotting方法检测促性腺激素(HCG)对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响,同时,采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究雌性性成熟半滑舌鳎mPRα mRNA和蛋白在各组织中的表达。对半滑舌鳎性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中mPRα mRNA的定量研究结果显示,在成熟时期半滑舌鳎Ⅴ时相卵母细胞的mPRα mRNA表达量最高。HCG对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响研究结果显示,20 IU/ml HCG比10 IU/ml HCG对成熟时期半滑舌鳎卵母细胞mPRα mRNA和蛋白表达的促进作用更明显,进一步证明mPRα介导孕激素参与了卵母细胞成熟的调控。对mPRα组织表达的定量和定位研究中,Western blotting结果显示,在半滑舌鳎的卵巢、垂体、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα蛋白表达,且在脑、垂体和卵巢中表达量较高,表明mPRα在不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑、垂体和卵巢中的作用更明显。原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在卵母细胞膜上,且在其他组织的外周和管腔结构表达。本研究为进一步研究mPRα在膜上的信号转导机制提供了理论基础和形态学依据。 展开更多
关键词 膜孕激素受体 半滑舌鳎 原位杂交 免疫组化 WESTERN blotting 实时荧光定量PCR
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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)核衣壳蛋白的克隆、表达与免疫印迹 被引量：1
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作者 徐丽华 王一成 +4 位作者 逄春泰 周永学 袁秀芳 张存 叶伟成 《浙江农业学报》 CSCD 2005年第3期123-126,共4页
将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N蛋白)基因克隆到原核表达载体pET 28α(+)中,得到重组质粒pET PRRSV/N,并转化入受体菌BL21中。转化子经IPTG诱导表达4h后,表达蛋白量达到高峰。经15%SDS PAGE电泳检测和经Westernblottin... 将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N蛋白)基因克隆到原核表达载体pET 28α(+)中,得到重组质粒pET PRRSV/N,并转化入受体菌BL21中。转化子经IPTG诱导表达4h后,表达蛋白量达到高峰。经15%SDS PAGE电泳检测和经Westernblotting分析,表达蛋白大小约为17kD,符合预期结果,并能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,而不与阴性血清反应。这说明表达蛋白具有高度免疫反应特异性。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV) 核衣壳蛋白 原核表 Western blotting
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猪繁殖与呼吸综合征病毒糖基化囊膜蛋白5原核表达载体的构建及免疫原性分析 被引量：1
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作者 李欣贤 张晓丹 +3 位作者 刘晶晶 苗增民 张涛涛 柴同杰 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第4期89-94,共6页
为分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)糖基化囊膜蛋白5(GP5)的免疫原性,本研究通过提取PRRSV分离株(GenBank登录号:HQ701732.1)RNA和RT-PCR扩增得到开放阅读框5(ORF5)基因。根据ORF5的基因序列,设计2对引物,经PCR扩增分别获得不含信号... 为分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)糖基化囊膜蛋白5(GP5)的免疫原性,本研究通过提取PRRSV分离株(GenBank登录号:HQ701732.1)RNA和RT-PCR扩增得到开放阅读框5(ORF5)基因。根据ORF5的基因序列,设计2对引物,经PCR扩增分别获得不含信号肽和跨膜功能区的2段基因片段。利用酶切位点,将2段基因连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组表达质粒pET28a-GP5。将重组质粒导入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导获得表达。经Western blotting鉴定,重组蛋白可被PRRSV阳性血清识别。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法检测,小鼠能产生针对蛋白的血清抗体。因此,该重组PRRSV GP5蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究GP5蛋白的结构和功能奠定基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 糖基化囊膜蛋白5 重组蛋白 ELISA WESTERN blotting
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糖尿病大鼠视网膜组织突触核蛋白家族的表达 被引量：1
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作者 袁爱花 梅妍 +1 位作者 周鸿鹰 羊惠君 《眼科新进展》 CAS 北大核心 2012年第3期215-218,共4页
目的观察突触核蛋白(synuclein)家族三种同源蛋白基因α-synuclein、β-synucle-in和γ-synuclein在8周糖尿病大鼠视网膜组织中的表达情况,初步探讨其在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)中的作用。方法采用限制性片段差异显... 目的观察突触核蛋白(synuclein)家族三种同源蛋白基因α-synuclein、β-synucle-in和γ-synuclein在8周糖尿病大鼠视网膜组织中的表达情况,初步探讨其在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)中的作用。方法采用限制性片段差异显示聚合酶链反应技术,建立正常和8周糖尿病大鼠视网膜基因表达谱,经生物信息学分析两者差异,初步确定α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein为DR相关基因,并以实时定量PCR和Western blot-ting方法分别从mRNA和蛋白水平上对三个基因的表达进行验证。结果限制性片段差异显示聚合酶链反应结果显示,糖尿病大鼠α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein表达明显强于正常大鼠;实时定量PCR结果显示,α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein在糖尿病大鼠(1.41±0.14、1.30±0.18、1.47±0.15)的表达(相对Ct比值)高于正常大鼠(1.67±0.12、1.62±0.20、1.86±0.26),差异均有显著统计学意义(均为P<0.01);Western blotting显示,糖尿病大鼠三种蛋白的表达(相对A值比值)分别为0.31±0.06、0.60±0.11、0.39±0.09,显著高于正常大鼠(0.19±0.07、0.44±0.09、0.29±0.08),差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。结论α-synuclein、β-synuclein和γ-sy-nuclein在糖尿病大鼠视网膜组织中表达显著升高,α-synuclein的表达升高可能在DR中起到神经毒性作用,而β-synuclein和γ-synuclein的高表达则可能对神经细胞起到保护作用。 展开更多
关键词 糖尿病视网膜病变 突触核蛋白 基因表达谱 定时定量PCR WESTERN blotting
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