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含分子内佐剂的ASFV重组蛋白制备和免疫效果评价
1
作者 李玉林 周方方 +4 位作者 闫生辉 于巧玲 王继创 石盼盼 王云龙 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第3期22-28,共7页
为了探究两种分子内佐剂促吞噬肽Tuftsin和破伤风毒素肽TT联合作用对非洲猪瘟病毒(ASFV)重组蛋白P753体液和细胞免疫的影响,本试验采用生物信息学软件确定了ASFV结构蛋白P72、P54和P30的优势表位并构建重组载体pET-28a(+)-p753和pET-28a... 为了探究两种分子内佐剂促吞噬肽Tuftsin和破伤风毒素肽TT联合作用对非洲猪瘟病毒(ASFV)重组蛋白P753体液和细胞免疫的影响,本试验采用生物信息学软件确定了ASFV结构蛋白P72、P54和P30的优势表位并构建重组载体pET-28a(+)-p753和pET-28a(+)-p753-Tuftsin-TT,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,经纯化和透析复性后采用蛋白质印迹法(Western blot)和斑点酶联免疫吸附测定(Dot-ELISA)鉴定重组蛋白的免疫原性和免疫反应性。将2种重组蛋白与兽用商品化疫苗佐剂ISA 61 VG混匀后免疫小鼠,通过检测小鼠血清抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖情况和细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)分泌水平来评价2种重组蛋白诱导的体液和细胞免疫效果。结果显示,2种重组蛋白在37℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导表达4 h时以包涵体形式表达且表达量最高,经纯化复性后均具有免疫原性和免疫反应性。免疫小鼠后,P753组和P753-Tuftsin-TT组抗体水平均在首免42 d进入平台期,抗体水平均高于PBS组,其中,P753-Tuftsin-TT组抗体水平最高,抗原刺激指数和细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)含量极显著高于P753组(P <0.000 1)。结果表明,分子内佐剂Tuftsin和TT联合使用可显著提升P753重组抗原引起的体液和细胞免疫应答能力,为ASFV亚单位疫苗佐剂的研发提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(asfv) 分子内佐剂 亚单位疫苗 体液免疫 细胞免疫
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稳定表达猪BRD4-BD1/2蛋白的猪肺泡巨噬细胞传代细胞系的构建及其用于ASFV增殖的效果观察
2
作者 吴梦丽 孙华林 +4 位作者 杨吉飞 赵亚茹 关贵全 殷宏 牛庆丽 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4646-4659,共14页
前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)有助于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的复制,为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响,通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD... 前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)有助于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的复制,为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响,通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD1/2结构域,利用慢病毒表达系统成功构建稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系,分析ASFV在3D4/21-BRD4-BD1/2细胞系与WT细胞系之间的复制差异。首先,以家猪基因BRD4-BD1/2为靶标,构建了含有3x Flag标签的重组质粒pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2,并将其与质粒pMD2.G和pSPAX2共同转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装,获得具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染3D4/21细胞后通过嘌呤霉素药物筛选,成功获得了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染3D4/21-BRD4-BD1/2细胞后CP204L和B602L基因的转录水平以及相应蛋白表达水平,并通过HAD50测定评价ASFV的复制能力。研究结果表明:成功构建了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。与3D4/21-WT细胞系相比,BRD4-BD1/2稳定表达细胞系能够显著促进ASFV复制。本研究提供了深入研究BRD4蛋白在ASFV复制中功能的生物材料,并为ASFV疫苗候选株的开发提供了理论基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 BRD4 BD1/2 3D4/21细胞 稳定表达细胞系
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基于非洲猪瘟病毒B646 L和I177L基因双重实时荧光定量PCR鉴别ASFV-G-ΔI177 L疫苗株的检测方法
3
作者 郭瑞 韩小改 +2 位作者 娄亚坤 杨楠 任宝红 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第12期52-57,共6页
为建立一种可鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株与ASFV-G-ΔI177L(I177L基因缺失株)疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法,本试验针对非洲猪瘟病毒B646L与I177L两种基因保守性高的区域,分别设计了引物和探针,通过引物、探针最佳工作浓度筛选和... 为建立一种可鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株与ASFV-G-ΔI177L(I177L基因缺失株)疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法,本试验针对非洲猪瘟病毒B646L与I177L两种基因保守性高的区域,分别设计了引物和探针,通过引物、探针最佳工作浓度筛选和退火温度优化,建立了一种双重实时荧光定量PCR核酸检测方法,并验证该方法的敏感性、特异性、重复性。结果显示,该检测方法建立的标准曲线线性关系良好,R2均>0.99;对pUC57-B646L和pUC57-I177L质粒标准品最低检出限均为10 copies/μL;与其他常见猪病病原无交叉反应,特异性强;批内变异系数为0.11%~1.39%,批间变异系数为0.21%~0.96%,均小于1.4%,重复性和稳定性良好。结果表明,本试验成功建立了一种性能良好的非洲猪瘟病毒B646L与I177L基因双重实时荧光定量PCR核酸检测方法,可为临床上非洲猪瘟病毒野毒株和ASFV-G-ΔI177L疫苗株的检测和鉴别提供技术支撑。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(asfv) B646L基因 I177L基因 双重实时荧光定量PCR
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非洲猪瘟病毒人工感染猪主要脏器的病理学观察
4
作者 常玲玲 张永强 +6 位作者 王雅诗 张冯禧 张歆悦 赵晓民 戈胜强 李金明 王志亮 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第5期2383-2392,共10页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种急性、烈性和高度接触性传染病,2018年8月ASFV首次传入我国,给养猪业带来灾难性打击。为明确我国分离获得的ASFV CN2018株的病理损... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种急性、烈性和高度接触性传染病,2018年8月ASFV首次传入我国,给养猪业带来灾难性打击。为明确我国分离获得的ASFV CN2018株的病理损伤特征,本文对一例人工感染猪主要脏器进行病理学观察。试验猪在人工感染ASFV CN2018株后第11天死亡,对尸体进行系统剖检和组织病理学检查。大体剖检可见皮肤、全身淋巴结、肾脏、膀胱、盲肠、胆囊、心脏、大脑等脏器表面或浆膜面分布出血斑点,胸腔和腹腔积血,肺脏淤血、水肿,呈全身出血性败血症病变。镜检病变以弥漫性出血和淤血为主,伴微血栓形成,淋巴结和脾脏中淋巴细胞严重缺失。免疫组化染色结果显示,巨噬细胞、肾小管上皮细胞及肝细胞胞质中呈ASFV抗原阳性。综上,ASFV CN2018株人工感染猪表现广泛性出血性病变,损伤的主要靶器官及抗原分布与之前报道类似。推测ASFV感染引起的广泛性出血主要与单核巨噬细胞系统激活损伤导致的炎症因子风暴及血管内皮细胞损伤有关,为深入研究我国ASFV流行毒株的致病机制提供了理论数据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 人工感染 猪 病理学观察
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表达非洲猪瘟pp62与Hsp70蛋白重组腺病毒对小鼠的免疫原性分析
5
作者 陈长春 吴植 +7 位作者 任冠宇 陈文玉 曹世诺 朱睿 张力 成玉婷 朱善元 卢会鹏 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期3027-3031,共5页
本研究旨在开发一种针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的重组腺病毒疫苗,为ASFV疫苗的临床应用和研发提供科学依据。利用pAdEasy-1系统构建融合表达ASFV CP530R基因和分支结核杆菌热休克蛋白70(Hsp70)的重组腺病毒(rAd-... 本研究旨在开发一种针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的重组腺病毒疫苗,为ASFV疫苗的临床应用和研发提供科学依据。利用pAdEasy-1系统构建融合表达ASFV CP530R基因和分支结核杆菌热休克蛋白70(Hsp70)的重组腺病毒(rAd-CP530R-Hsp70)。通过间接免疫荧光和Western blot验证目的蛋白的表达。将rAd-CP530R-Hsp70重组腺病毒免疫小鼠,检测小鼠体内产生的抗体和细胞因子水平。结果显示:重组腺病毒成功诱导小鼠产生针对pp62的特异性抗体,免疫后35 d抗体滴度达到1.33。免疫后小鼠脾细胞培养上清中IL-2、IL-4和IFN-γ水平显著升高,显示该疫苗能够有效激活体液和细胞免疫应答。构建的重组腺病毒疫苗可有效诱导小鼠产生免疫应答,为非洲猪瘟疫苗的研发提供数据支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 CP530R 重组腺病毒 HSP70
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用于非洲猪瘟病毒多靶标核酸检测的DNA假病毒制备及定量
6
作者 邓俊花 李昊轩 +6 位作者 陈冬杰 吕继洲 王晶晶 张舟 袁向芬 魏方 吴绍强 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3555-3560,共6页
本研究旨在研制一种全程质控非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸检测、避免质粒交叉污染的DNA假病毒。将ASFV B646L/CD2v/MGF505-1R/MGF360-12L 4种检测关键基因及EGFP基因共构建于杆状病毒的转移载体pFastBac^(TM)Dual中,转化形成重组Bacmid pFast... 本研究旨在研制一种全程质控非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸检测、避免质粒交叉污染的DNA假病毒。将ASFV B646L/CD2v/MGF505-1R/MGF360-12L 4种检测关键基因及EGFP基因共构建于杆状病毒的转移载体pFastBac^(TM)Dual中,转化形成重组Bacmid pFastBac-EGFP-ASFV,转染至sf21细胞,包装产生ASFV重组杆状病毒。结果显示:通过荧光倒置显微镜观察,表达的EGFP蛋白绿色荧光信号指示成功获取AcMNPV-EGFP-ASFV病毒;重组杆状病毒基因组溯源分析,ASFV B646L/CD2v/MGF505-1R/MGF360-12L基因序列满足现行检测方法质控需求;ASFV质控品均匀、稳定,-20℃保存至少可稳定24个月。采用ddPCR定量为4.09×10^(3) copies·μL^(-1)。本研究非洲猪瘟病毒DNA假病毒的制备,为非洲猪瘟疫情监测提供了新的技术支撑。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 DNA假病毒 定量
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非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量：2
7
作者 王小格 司煊瑛 +8 位作者 闫志伟 王飞 尤龙琪 刘梗 蔡茂 梁珺珹 梁玉秀 杜永坤 张改平 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第2期781-791,共11页
[目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重... [目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重组蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合制备单克隆抗体。通过Western blotting鉴定单克隆抗体特异性,通过ELISA方法测定腹水效价;利用在线软件预测p22蛋白抗原表位分布情况并合成重叠多肽,通过Dot blotting鉴定抗体识别的抗原表位。[结果]本研究成功构建了p22重组蛋白的原核表达质粒,获得原核系统表达的p22重组蛋白,分子质量约为22 ku。用纯化后p22蛋白作为免疫原免疫小鼠,成功筛选到4株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别为1G3D7G11、2G5H6H8、6D10G7D6和8F6F8B9,其腹水效价均达到1∶500 000。Western blotting结果显示,4株单克隆抗体均能与p22蛋白发生特异性反应。单克隆亚型鉴定结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8和6D10G7D6株单克隆抗体的重链均为IgG1类,8F6F8B9株单克隆抗体的重链为IgG2a类,4株单克隆抗体轻链均为Kappa型。Dot blotting检测结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8株单克隆抗体识别抗原表位位于第58—89位氨基酸处;8F6F8B9株单克隆抗体识别抗原表位位于第126—150位氨基酸处。[结论]本研究成功制备了4株ASFV p22蛋白的单克隆抗体,并初步鉴定了单克隆抗体所识别的B细胞表位区间。研究结果为p22蛋白的生物学功能研究和ASFV血清学检测提供了参考依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p22蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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非洲猪瘟病毒感染过程中巨噬细胞极化表型变化的研究 被引量：1
8
作者 崔宏全 姜成刚 +6 位作者 文莉莉 范宇琴 刘英豪 都兰 王靖飞 赵东明 何希君 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第1期54-62,共9页
为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)对巨噬细胞极化表型的影响,本研究将100ng/mL脂多糖(LPS)+50ng/mL IFN-γ诱导猪肺泡巨噬细胞(PAM)成为M1型巨噬细胞(M1组),用50 ng/mL IL-4诱导PAM成为M2型巨噬细胞(M2组),以不做任何处理的PAM作为对照组。24 ... 为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)对巨噬细胞极化表型的影响,本研究将100ng/mL脂多糖(LPS)+50ng/mL IFN-γ诱导猪肺泡巨噬细胞(PAM)成为M1型巨噬细胞(M1组),用50 ng/mL IL-4诱导PAM成为M2型巨噬细胞(M2组),以不做任何处理的PAM作为对照组。24 h后采用荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞中M1型细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α及M2型细胞因子IL-10及其标志物精氨酸酶-1(Arg-1)、几丁质酶-1(Ym-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)mRNA的转录水平;采用Luminex细胞多因子试剂盒检测各组细胞上清中M1型细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18和M2型细胞因子IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)、IL-10的表达水平;采用NO试剂盒及流式细胞术分别检测各组细胞上清中M1型巨噬细胞代谢物NO的含量及其细胞表面标志物CD80+细胞的占比;采用western blot检测各组细胞中M2型巨噬细胞标志物Arg-1蛋白的表达。结果显示,M1组中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-αmRNA的转录和蛋白分泌水平、IL-1α的分泌水平、NO的含量及CD80+细胞的占比均显著和极显著高于其余两组。M2组中抑炎细胞因子IL-10和Arg-1 mRNA的转录和蛋白的分泌水平均极显著高于其余两组。未检测到IL-18和IL-1RA的表达。在此基础上将ASFV Pig/HLJ/2018株以MOI 1感染PAM,不同时间后(0、12 h、24 h、36 h及48 h)分别按照上述各方法检测PAM中各细胞因子及极化标志物的转录水平及蛋白的分泌水平,分析ASFV感染后巨噬细胞表型的极化方向。结果显示,与对照组相比,ASFV感染后PAM中M1型细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的转录水平均极显著升高,IL-6的转录水平一直维持在较高水平,PAM中M2型细胞因子IL-10及Arg-1的转录水平先升后降,并分别于感染后48h与12 h达到峰值,后者随后下降;Ym-1与PPAR的转录水平均在感染后24 h达到峰值,随后下降;ASFV感染后PAM中部分细胞因子蛋白的分泌水平与其转录水平的变化趋势类似;NO含量显著和极显著升高,CD80+细胞占比显著升高直至达到峰值;Arg-1的表达量均极显著升高(除了感染后48 h),在感染后36 h达到峰值后下降。上述结果表明,ASFV感染后PAM同时向M1型及M2型极化,M1型极化随着感染时间的延长持续存在,而M2型极化则呈先上升后下降的趋势。本研究为进一步探究ASFV感染对宿主免疫状态的影响及宿主如何响应ASFV感染的机制奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 肺泡巨噬细胞 极化
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非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型PCR-RFLP鉴别方法的建立
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作者 孙仁杰 徐慧玲 +6 位作者 孙思琪 柴娟 虞一聪 谢荣辉 李肖梁 赵灵燕 张传亮 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第5期1017-1028,共12页
本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)基因Ⅰ型和Ⅱ型的PCR-RFLP鉴别方法。通过对ASFV基因Ⅰ型与基因Ⅱ型基因组序列的比对分析,针对B385R基因和B125R基因保守区设计1对特异性PCR-RFLP引物,与其他临床上常... 本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)基因Ⅰ型和Ⅱ型的PCR-RFLP鉴别方法。通过对ASFV基因Ⅰ型与基因Ⅱ型基因组序列的比对分析,针对B385R基因和B125R基因保守区设计1对特异性PCR-RFLP引物,与其他临床上常见的9种猪病病毒均无交叉反应。通过该引物扩增获得覆盖B646L基因全长的DNA片段作为检测靶标,结合BmgBⅠ酶切进行RFLP图谱分析,即可实现对B646L基因全序列的快速检测,有效区分ASFV基因Ⅰ型和Ⅱ型,最低检测DNA质量浓度可达到5 pg·mL^(-1)。模拟临床样本的研究结果表明,本方法还能够有效应对实际检测中基因Ⅰ型和Ⅱ型的混合感染。综上,本方法操作简便、准确性高、特异性强、灵敏度高、成本较低,具有良好的应用前景,为基层兽医技术人员开展非洲猪瘟疫情的监测和流行病学研究提供了一种新方法。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性 基因Ⅰ型 基因Ⅱ型
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表达非洲猪瘟病毒基因B602L-B646L的重组病毒免疫原性的初步分析
10
作者 卢会鹏 曹世诺 +6 位作者 吴植 陈长春 陈文玉 成玉婷 周晓慧 孙怀昌 朱善元 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2816-2825,共10页
本研究旨在分析表达非洲猪瘟病毒基因B602L-B646L的重组腺病毒和杆状病毒的免疫原性。联合CpG佐剂注射3 d后或单独免疫rAd-F-Hsp7021 d后用rBac-F加强免疫,或以rBac-F为初免21 d后用rAd-F-Hsp70进行加强免疫,免疫剂量1×10^(8)·... 本研究旨在分析表达非洲猪瘟病毒基因B602L-B646L的重组腺病毒和杆状病毒的免疫原性。联合CpG佐剂注射3 d后或单独免疫rAd-F-Hsp7021 d后用rBac-F加强免疫,或以rBac-F为初免21 d后用rAd-F-Hsp70进行加强免疫,免疫剂量1×10^(8)·只^(-1)。在初免21和42 d后采集血清检测针对ASFV pB602L和p72蛋白的抗体水平。检测初免42 d后的由抗原刺激后外周血单核细胞(PBMCs)上清中干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的含量。结果显示:自免疫后第21天起,所有免疫猪的血清中均能检测到特异性IgG抗体,且在加强免疫后,抗体水平显著上升。CpG联合rAd-F-Hsp70/rBac-F免疫组血清中,pB602L和p72抗体水平均显著高于rAd-F-Hsp70/rBac-F(P<0.01)和rBac-F/rAd-F-Hsp70(P<0.01),其中rAd-F-Hsp70/rBac-F免疫组特异性抗体水平也显著高于rBac-F/rAd-F-Hsp70(P<0.01)。用ASFV pB602L和p72重组抗原刺激PBMCs后,CpG佐剂联合rAd-F-Hsp70/rBac-F免疫组细胞上清中IFN-γ和IL-4含量显著高于其他免疫组(P<0.01),表明以rAd-F-Hsp70作为首免载体优于rBac-F以及CpG佐剂显著提高体液免疫和细胞免疫效果。综上,以rAd-F-Hsp70作为初免疫苗和以rBac-F作为加强疫苗,同时联合使用CpG佐剂显著增强了针对pB602L和p72特异性抗体和细胞因子水平,为进一步优化非洲猪瘟病毒相关疫苗策略提供了数据支持和参考依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 重组腺病毒 重组杆状病毒 CpG分子
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非洲猪瘟病毒D205R蛋白单克隆抗体的制备和抗原表位鉴定
11
作者 林志钊 赵燕燕 +6 位作者 任豪杰 史赛燕 韩世充 何文瑞 万博 张雨杭 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2025年第2期124-130,共7页
非洲猪瘟(ASF)是一种致命的传染病,迄今为止,还没有开发出有效的疫苗或药物用于预防或控制ASF。为提供诊断非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要材料,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组D205R蛋白,制备D205R蛋白的单克隆抗体(mAb),鉴定mAb识别的抗原表... 非洲猪瘟(ASF)是一种致命的传染病,迄今为止,还没有开发出有效的疫苗或药物用于预防或控制ASF。为提供诊断非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要材料,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组D205R蛋白,制备D205R蛋白的单克隆抗体(mAb),鉴定mAb识别的抗原表位。结果显示,成功构建pET32a-D205R表达质粒,并纯化大小约为44 ku的重组D205R蛋白。蛋白质免疫印迹(Western blot)检测结果表明,重组D205R蛋白与ASFV阳性血清发生特异性反应,有良好的免疫原性。利用杂交瘤细胞融合、筛选的方法,得到mAb 19A5。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测结果表明,mAb 19A5能特异性识别真核表达的重组D205R蛋白,并能检测到野生型D205R蛋白。用丙氨酸扫描法鉴定出167-SDPPVVWLGGRPGD-180是mAb 19A5的抗原表位,S167、W173、L174、G175、P178和D180是与mAb19A5结合的关键氨基酸。保守性和结构分析表明,抗原表位高度保守,且位于蛋白质表面,是线性表位。综上,成功制备mAb 19A5,并鉴定了mAb 19A5识别的抗原表位。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D205R蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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非洲猪瘟病毒H108R蛋白的制备及其免疫原性评价
12
作者 张越 茹毅 +7 位作者 郝荣增 杨锐 赵陇和 李亚军 杨洋 张荣 蒋成辉 郑海学 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第3期1344-1354,共11页
本研究旨在制备ASFV H108R蛋白,通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性,为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质,选择编码蛋白33~108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体,转化... 本研究旨在制备ASFV H108R蛋白,通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性,为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质,选择编码蛋白33~108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体,转化后经IPTG诱导表达,用镍亲和层析纯化目标蛋白质。免疫小鼠利用流式细胞术检测脾脏活化的CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞,分离小鼠血清测定特异性抗体滴度,利用Western blot和IFA鉴定多克隆抗体的特异性。并用试剂盒检测血清中细胞因子含量,将血清与ASFV-GFP病毒孵育评估抗体是否能抑制病毒的复制。生物信息学分析表明H108R蛋白为亲水性蛋白质,有跨膜区,无信号肽,蛋白二三级结构中存在较多α-螺旋。SDS-PAGE、Western blot显示IPTG诱导后,成功表达纯化H108R蛋白。蛋白免疫小鼠后能够诱导小鼠脾脏T细胞的活化,刺激机体产生更高水平的细胞因子。免疫制备的多克隆抗体效价为1∶128000,能与ASFV-GFP病毒特异性结合,与病毒孵育后能明显抑制病毒的复制。本研究成功表达制备了ASFV H108R蛋白,免疫能够诱导脾脏T淋巴细胞活化,引起细胞因子水平升高,制备的多克隆抗体能够明显抑制病毒的复制,具有较好的免疫原性,为深入研究H108R蛋白的生物学功能及疫苗研究奠定基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(asfv) H108R蛋白 多克隆抗体 免疫原性
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猪I类白细胞抗原单克隆抗体的制备及其在非洲猪瘟病毒感染机制研究中的初步应用
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作者 王可欣 Weldu Tesfagaber +7 位作者 王婉 尹丽 孔惠 张振江 李芳 高彩霞 步志高 赵东明 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第1期90-95,共6页
猪I类白细胞抗原(SLA I)是机体内至关重要的免疫相关蛋白,是启动特异性细胞毒性T细胞(CTL)免疫应答的核心分子。在机体内,SLA I负责将内源性抗原肽递呈至细胞膜表面,由CD8+T细胞识别,启动机体适应性免疫应答。为了制备SLA I的单克隆抗体... 猪I类白细胞抗原(SLA I)是机体内至关重要的免疫相关蛋白,是启动特异性细胞毒性T细胞(CTL)免疫应答的核心分子。在机体内,SLA I负责将内源性抗原肽递呈至细胞膜表面,由CD8+T细胞识别,启动机体适应性免疫应答。为了制备SLA I的单克隆抗体(MAb),本研究将SLA I-1*04:01等位基因胞外区序列与麦芽糖结合蛋白(MBP)序列连接,在大肠杆菌原核表达系统中表达,获得可溶性重组蛋白MBP-SLA I。经亲和层析纯化后,采用MBP-SLA I免疫BALB/c小鼠3次,采用ELISA检测小鼠血清抗体水平,对血清抗体效价在1:10 000以上的小鼠进一步冲击免疫后,分离小鼠脾脏B淋巴细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合。采用ELISA方法筛选阳性的杂交瘤细胞进行3次克隆纯化,最终筛选得到稳定分泌SLA I抗体的杂交瘤细胞株MAb-1A11。经ELISA检测纯化后的MAb-1A11效价可达1:3 200,经小鼠MAb抗体亚类鉴定试剂盒鉴定其重链为IgG2b,轻链为κ。采用western blot检测该抗体的特异性,结果显示,MAb-1A11能够识别猪肺泡巨噬细胞(PAM)表达的内源性SLA I,在42 ku处出特异性条带,而对HEK293T细胞中表达的同源物人白细胞抗原无交叉识别作用。利用MAb-1A11为一抗,采用western blot进一步检测非洲猪瘟病毒(ASFV)HLJ/18-6GD株感染的PAM中SLA I的表达水平,结果显示,随着ASFV感染时间的延长,SLA I表达水平出现轻微下降。本研究制备了SLA I的MAb,并初步将其应用于ASFV感染机制的研究中,为深入了解SLA I所受调控的机制提供了可靠工具。 展开更多
关键词 猪白细胞抗原I 单克隆抗体 WESTERNBLOT 非洲猪瘟病毒
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非洲猪瘟病毒p72蛋白抗体全自动化学发光酶免疫检测方法的建立
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作者 马晓莉 李段 +6 位作者 曾道平 刘燕玲 王晓敏 彭国良 宋长绪 王磊 徐铮 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第3期1355-1365,共11页
抗体检测对于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染诊断和疫苗研究至关重要,因此建立一种基于ASFV p72蛋白抗体的全自动化学发光酶免疫分析方法(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA)具有重要意义。本研究以重组p7... 抗体检测对于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染诊断和疫苗研究至关重要,因此建立一种基于ASFV p72蛋白抗体的全自动化学发光酶免疫分析方法(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA)具有重要意义。本研究以重组p72蛋白偶联的磁微粒(magnetic particles,MPs)捕获p72蛋白抗体,再结合碱性磷酸酶(alkaline phosphates,AP)标记的p72蛋白,借助全自动化学发光分析仪,分析猪血清中p72蛋白特异性抗体水平。经反应条件优化,建立了一种ASFV p72蛋白抗体全自动化学发光酶免疫检测方法。结果显示,建立的CLEIA阴性、阳性临界值为9.505 U·mL^(-1),诊断特异性和灵敏性分别为98.33%和100%,与其他猪病原阳性血清无交叉反应,批内和批间变异系数分别小于5%和10%,各种试剂组分可以保存6个月以上,对ASFV阳性标准血清,分析敏感性为1∶12800,与国产商品化试剂盒的总符合率达95.90%。综上,本研究建立的化学发光方法具有高灵敏性和可重复性,有自动化检测、操作步骤简单的优势,可为ASFV的检测提供新的技术支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p72 化学发光酶免疫 抗体检测
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非洲猪瘟病毒减毒活疫苗研究进展
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作者 牛鑫鑫 沈冬冬 +2 位作者 李芳 步志高 赵东明 《宁夏农林科技》 2025年第1期5-21,50,共18页
非洲猪瘟(ASF)是非洲猪瘟病毒(ASFV)感染野猪或家猪引起的一种急性、高度接触性的烈性动物传染病。ASFV传染性强、发病率高、急性感染死亡率可高达100%,是目前对全球养猪行业最具威胁性的疫病之一。由于减毒活疫苗在免疫保护效力方面的... 非洲猪瘟(ASF)是非洲猪瘟病毒(ASFV)感染野猪或家猪引起的一种急性、高度接触性的烈性动物传染病。ASFV传染性强、发病率高、急性感染死亡率可高达100%,是目前对全球养猪行业最具威胁性的疫病之一。由于减毒活疫苗在免疫保护效力方面的突出优势,被认为是短周期内最有希望的ASF疫苗。总结了ASF减毒活疫苗的研究进展,重点介绍基于病毒基因组复制必需基因缺失、多基因家族(MGF)基因缺失、介导红细胞吸附基因缺失、其他ASFV功能基因缺失,以及多毒力基因联合缺失等方向的ASF基因缺失候选疫苗研究成果,以期为ASF减毒活疫苗研究提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 非洲猪瘟病毒 疫苗
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“检测淘汰法”在温州地区规模猪场动物疫病净化中的应用 被引量：1
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作者 吴波 章国永 +2 位作者 赵妍 麻武飞 周轩伦 《浙江农业科学》 2025年第1期189-192,共4页
为推动及改进规模猪场动物疫病净化,该试验以“检测淘汰法”为核心,以本底调查、免疫程序优化、免疫干扰分析和生物安全体系改进等为配套的净化集成技术,将温州一个规模猪场作为示范场点,以O型口蹄疫和非洲猪瘟为净化对象。净化实施后... 为推动及改进规模猪场动物疫病净化,该试验以“检测淘汰法”为核心,以本底调查、免疫程序优化、免疫干扰分析和生物安全体系改进等为配套的净化集成技术,将温州一个规模猪场作为示范场点,以O型口蹄疫和非洲猪瘟为净化对象。净化实施后该猪场生产防疫指标有所改善,口蹄疫免疫抗体合格率从76.84%提高至91.09%,口蹄疫野生型抗体阳性率从4.21%降低至0,口蹄疫野生型核酸阳性率从3.68%降低至0,非洲猪瘟野生型核酸阳性率一直维持在0。在示范场跟踪监测4 a后,推广至全市10家规模猪场,O型口蹄疫免疫抗体合格率整体呈现逐年上升趋势,口蹄疫感染抗体阳性数和病毒核酸阳性数整体呈现逐年下降趋势,非洲猪瘟病毒核酸阳性数历年跟踪监测检出率均为0。 展开更多
关键词 猪 检测淘汰法 疫病净化 口蹄疫 非洲猪瘟
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非洲猪瘟病毒结构蛋白与宿主蛋白相互作用研究进展
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作者 张素 孙丽芳 +3 位作者 李兰兰 吴琳娇 陈磊清 吴允昆 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第1期95-106,共12页
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染所引起的一种家猪和各种野猪急性出血的传染性疾病,由于高发病率和高致死性的特性对全球家猪养殖产业造成严重的经济损失。ASFV编码蛋白高达... 非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染所引起的一种家猪和各种野猪急性出血的传染性疾病,由于高发病率和高致死性的特性对全球家猪养殖产业造成严重的经济损失。ASFV编码蛋白高达150多种,而ASFV结构蛋白作为病毒粒子的主要组成部分,在协助病毒吸附入侵宿主细胞、促进子代病毒颗粒复制、组装以及释放等过程发挥着重要作用。研究表明,病毒结构蛋白可通过与宿主蛋白的相互作用,促进病毒入侵、增殖、影响病毒毒力以及拮抗宿主免疫反应等。因此,本文通过概述ASFV结构蛋白与宿主蛋白的相互作用及其机制,为研究ASFV的致病机制以及ASF的防治提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 结构蛋白 宿主蛋白 蛋白相互作用
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非洲猪瘟与宿主的先天性免疫调节
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作者 刘艳 袁翠霞 +5 位作者 杨源 刘亚娟 张海 杨峰 唐娇龙 徐春志 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期214-219,共6页
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、高度传染性动物疫病,在全球范围内广泛传播,危害巨大。了解病毒与宿主的先天性免疫调节对于认识、防控病毒意义重大,但对于ASFV,目前仍缺乏对其发病机制,特别是对免疫逃避机制的深... 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、高度传染性动物疫病,在全球范围内广泛传播,危害巨大。了解病毒与宿主的先天性免疫调节对于认识、防控病毒意义重大,但对于ASFV,目前仍缺乏对其发病机制,特别是对免疫逃避机制的深入了解。本文综述了ASF在我国流行概况、ASFV与宿主先天性免疫反应的最新研究进展,以期为ASFV的防控研究及疫苗研制提供启发思路。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 发病机制 免疫逃避 先天性免疫反应
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非洲猪瘟防控技术研究进展
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作者 马春霞 张洋 +5 位作者 欧云文 刘雪霜 吴亚 潘琴 任绍科 邓书明 《现代畜牧兽医》 2025年第7期79-85,共7页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪群引起的一种高度急性、烈性传染病。ASFV为有囊膜的双链DNA病毒,遗传变异多样,免疫逃逸机制复杂,尚无可靠疫苗用于猪群免疫,防控难度较高。... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪群引起的一种高度急性、烈性传染病。ASFV为有囊膜的双链DNA病毒,遗传变异多样,免疫逃逸机制复杂,尚无可靠疫苗用于猪群免疫,防控难度较高。自2018年传入我国后,ASF给养猪业造成了巨大的经济损失和社会影响。近年来,随着对ASFV的不断深入研究,相关诊断技术、疫苗和防控药物已取得显著成果。文章系统总结了ASF诊断技术、疫苗、中西药和生物安全等方面的研究现状,以期为我国ASF防控及研究提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 非洲猪瘟病毒 诊断技术 疫苗 中药 生物安全
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ASFV、PRV和PCV2多重荧光定量PCR检测方法的建立和应用 被引量：7
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作者 李玲 邹宏 +7 位作者 徐璐 宋新宇 朱明哲 王程 王震 刘业兵 马小军 夏应菊 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期807-813,共7页
非洲猪瘟病毒(ASFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)是危害养猪业的3种重要病毒,但目前国内外尚无可同时检测这3种病原的方法。为建立一种可同时检测上述3种病原的方法,本研究以ASFV的B646L基因、PRV的gE基因及PCV2的rep基因为... 非洲猪瘟病毒(ASFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)是危害养猪业的3种重要病毒,但目前国内外尚无可同时检测这3种病原的方法。为建立一种可同时检测上述3种病原的方法,本研究以ASFV的B646L基因、PRV的gE基因及PCV2的rep基因为靶基因,采用Prime 3 web软件分别设计特异性引物和探针。采用相应引物分别构建上述3种靶基因的重组质粒,经测序鉴定后分别作为质粒标准品,并均稀释到1×105拷贝/μL后按照体积比1∶1∶1混匀后作为模板,采用方阵法对引物、探针、酶和各反应条件等的优化,初步建立ASFV、PRV和PCV2多重荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法标准曲线Ct值与相应质粒标准品浓度均存在良好的线性关系,相关系数(R2)均大于0.99。利用该方法同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病原,结果显示,本实验建立的该方法仅特异性扩增ASFV、PRV和PCV2,与其他病原均无交叉反应,特异性强;分别利用该方法与已公布的中华人民共和国农业农村部公告第172号中ASFV荧光定量PCR检测方法、PCV2荧光定量PCR方法(GB/T 35901-2018)、PRV荧光定量PCR检测方法(GB/T 35911-2018)对10倍倍比稀释(1.0×10^(4)拷贝/μL~1.0×10_(0)拷贝/μL)后的pUC57-ASFV-B646L、pUC57-PRV-gE、pGEMT-PCV2-rep质粒标准品1∶1∶1的混合物检测,结果显示该方法对3种质粒标准品的最低检测限均为10拷贝/μL,相同或略高于上述各病原的单一qPCR检测结果,表明本实验建立的该方法敏感性较高;选取3个稀释度的质粒标准品分别按1∶1∶1比例混合后进行组内和组间重复性试验,结果显示组内组间变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验建立的方法和上述3种病原标准检测方法对114份临床样品检测,结果显示,本实验建立的方法对ASFV、PRV和PCV2检测的的阳性样品数分别为10份、10份和42份,未发现混合感染现象,与3种病原的标准方法相比符合率均为100%。以上结果表明,本研究建立的ASFV、PRV和PCV2多重荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于这3种常见猪病的鉴别诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 猪圆环病毒2型 伪狂犬病毒 多重荧光定量PCR
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