大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究 被引量：10

1

作者 许崇波 卫广森 +5 位作者 王卓 冯书章 吴广谋 王文成 马成国 张万林 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 1999年第1期43-45,共3页

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，... 已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗１５ＭＬＤ的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ，ＳＴ＋，ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。 展开更多

关键词 大肠杆菌 ST1 LTb 免疫原性

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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定 被引量：7

2

作者 陈明 李超 +7 位作者 王瑞 王秋华 黄婷 雷爱莹 陈福艳 甘西 余晓丽 梁万文 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第6期2093-2097,共5页

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核... 为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。 展开更多

关键词 大肠杆菌肠毒素b亚单位(LTb) 基因表达 毕赤酵母 粘膜免疫佐剂

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表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究 被引量：5

3

作者 许崇波 卫广森 +1 位作者 王文成 王卓 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期9-12,共4页

已构建的能表达大肠杆菌K88ac_ST1_LTB 融合蛋白的工程菌株BL2 1 (DE3 ) (pXKST3LT5 )及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原 ,免疫小鼠 ,结果免疫小鼠至少能抵抗 2... 已构建的能表达大肠杆菌K88ac_ST1_LTB 融合蛋白的工程菌株BL2 1 (DE3 ) (pXKST3LT5 )及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原 ,免疫小鼠 ,结果免疫小鼠至少能抵抗 2MLD的大肠杆菌强毒株C83 90 2 (K88ac,ST+ ,LT+ )的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后 ,采集的血清能够中和天然ST1的毒性。这表明构建的工程菌株BL2 1 (DE3 ) (pXKST3LT5 )可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。 展开更多

关键词 K88ac-ST1-LTb融合蛋白 大肠杆菌 免疫原性 基因工程菌苗 大肠杆菌性腹泻

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LT-B转基因烟草植株的建立 被引量：4

4

作者 刘红莉 雷霆 +6 位作者 张铮 郑瑾 来宝长 孔令洪 王喆之 王一理 司履生 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期425-429,共5页

目的　构建大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 (LT B)基因的植物表达载体 ,并建立LT B转基因烟草植株。方法　用PCR从pMMB6 8扩增LT B编码基因 ,将其克隆于 pUCmT和 pBI12 1载体 ,进而构建植物表达双元载体pBI LTB ,LT B基因由CaMV 35S启... 目的　构建大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 (LT B)基因的植物表达载体 ,并建立LT B转基因烟草植株。方法　用PCR从pMMB6 8扩增LT B编码基因 ,将其克隆于 pUCmT和 pBI12 1载体 ,进而构建植物表达双元载体pBI LTB ,LT B基因由CaMV 35S启动子控制表达 ;将pBI LTB用电穿孔法导入根瘤农杆菌LBA4 4 0 4 ;采用叶盘共培育法经根瘤农杆菌介导转化烟草 ,获得转基因烟草植株 ;用PCR、Southern、Westernblot和ELISA检测转基因植株。结果　经PCR及Southern杂交分析 ,共发现 12株烟草的基因组中有LT B基因整合 ;Westernblot和ELISA分析表明有 9株转基因烟草能有效表达LT B蛋白 ,其表达量为烟草叶片总可溶蛋白的 3.36～ 10 .5 6 μg·g-1TSP。结论　建立的LT B转基因烟草植株可成功表达LT B ,并具有五聚体结构 ,为进一步生产预防婴幼儿大肠杆菌腹泻可食用疫苗及黏膜免疫佐剂奠定了基础。 展开更多

关键词 大肠杆菌热不稳定肠毒素b亚单位 转基因烟草 植物疫苗 根瘤农杆菌

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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究 被引量：4

5

作者 田文标 邹全明 张卫军 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期115-118,共4页

目的　研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因工程菌的发酵工艺。方法　先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件 ,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件 ,并进一步对发酵工艺进行... 目的　研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因工程菌的发酵工艺。方法　先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件 ,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件 ,并进一步对发酵工艺进行改良优化。结果　经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合 ,优化后工程菌菌体产量平均可达 40 5g/L ,目的蛋白的表达率平均为 3 0 6%。结论　建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺。 展开更多

关键词 产毒素性大肠杆菌 不耐热肠毒素b亚单位 发酵

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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合表达载体的构建及应用 被引量：2

6

作者 鲁东水 毛旭虎 +1 位作者 吴超 邹全明 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第14期1275-1277,共3页

目的　构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的融合表达载体。方法　PCR扩增LTB基因 ,并在其 3′端去掉终止密码子 ,引入编码TAPI接头 ,通过EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切位点重组于PinpointXa Ⅰ载体上 ,将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合 ,转化E .c... 目的　构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的融合表达载体。方法　PCR扩增LTB基因 ,并在其 3′端去掉终止密码子 ,引入编码TAPI接头 ,通过EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切位点重组于PinpointXa Ⅰ载体上 ,将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合 ,转化E .coliJM10 9,SDS PAGE及Westernblotting分析其表达。结果　成功构建了LTB融合表达质粒 ,并获得了幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合表达。结论　LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内佐剂疫苗奠定了实验基础。 展开更多

关键词 不耐热肠毒素b亚单位 融合表达 载体 幽门螺杆菌尿素酶b亚单位

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表达大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合蛋白双价基因工程菌株的构建 被引量：2

7

作者 卫广森 许崇波 《中国兽药杂志》 北大核心 1999年第2期1-5,共5页

重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ，... 重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ，而且已失去天然ＳＴ１肠毒素生物毒性。用从ＩＰＴＧ 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＭＬＤ 的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ，ＳＴ＋ ，ＬＴ＋ ）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性。 展开更多

关键词 大肠杆菌 肠毒素 ST1 LTb 融合蛋白 基因工程菌

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重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因表达系统构建 被引量：1

8

作者 全胜 严杰 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2003年第2期14-15,20,共3页

从E .coli 4 4 815株基因组DNA中扩增不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因并分析了核苷酸序列 ,构建pET32a的LTB表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用SDS PAGE鉴定表达产物。克隆的LTB基因与报道的核苷酸和氨... 从E .coli 4 4 815株基因组DNA中扩增不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因并分析了核苷酸序列 ,构建pET32a的LTB表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用SDS PAGE鉴定表达产物。克隆的LTB基因与报道的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 97.5 8%～ 99.19% ,pET32a LTB BL2 1DE3系统表达的rLTB量约占细菌总蛋白的 30 %。 展开更多

关键词 重组大肠杆菌不耐热肠毒素 b亚单位 基因表达系统 构建

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大肠杆菌LTB与幽门螺杆菌HSPA融合表达载体的构建与表达

9

作者 郭红 邹全明 +2 位作者 赵晓晏 吴超 毛旭虎 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期644-646,共3页

目的　构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的包涵体形式融合表达载体。方法　PCR扩增LtB基因 ,并在其 5’端去掉信号肽 ,3’端去掉终止子 ,引入编码YPQD接头 ,通过PstI +BamHI酶切位点重组于PinPointTM Xa Ⅲ载体上 ,转化E .coliJM1 0 9,S... 目的　构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的包涵体形式融合表达载体。方法　PCR扩增LtB基因 ,并在其 5’端去掉信号肽 ,3’端去掉终止子 ,引入编码YPQD接头 ,通过PstI +BamHI酶切位点重组于PinPointTM Xa Ⅲ载体上 ,转化E .coliJM1 0 9,SDS PAGE及Western blot分析其表达。结果　成功构建了LTB融合表达质粒 ,并将幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与之融合获得了表达。结论　LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内粘膜佐剂特性奠定了基础。 展开更多

关键词 不耐热肠毒素b亚单位 融合表达 载体 HSPA 幽门螺杆菌 大肠杆菌 LTb

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重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在鸭体内的吸收代谢及组织分布

10

作者 周晓丽 王一成 +3 位作者 姜平 袁秀芳 李军星 杜晓莉 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2014年第2期104-109,共6页

研究重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(rLTB)在鸭体内的吸收代谢及组织分布,为rLTB的临床应用安全性提供依据。试验鸭分别肌注1,50,100 mg/kg rLTB后,以神经节苷脂GM1酶联免疫吸附法(GM1-ELISA)测定注射后不同时间点鸭血清中的rLTB含量... 研究重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(rLTB)在鸭体内的吸收代谢及组织分布,为rLTB的临床应用安全性提供依据。试验鸭分别肌注1,50,100 mg/kg rLTB后,以神经节苷脂GM1酶联免疫吸附法(GM1-ELISA)测定注射后不同时间点鸭血清中的rLTB含量;连续3次肌注rLTB后,观察临床症状和剖检病理变化,并采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑制备组织切片,HE染色观察组织病理学变化,免疫酶组织化学染色观察rLTB在各脏器内的分布及含量变化。结果表明:鸭血清中的rLTB含量变化及维持时间与rLTB注射剂量呈正相关。1 mg/kg注射组2 h达到峰值,维持至6 h开始下降,24 h后基本检测不到;50,100 mg/kg注射组分别于2 h和1 h达到峰值,并均维持至12 h才开始下降,48 h后基本检测不到。HE染色切片显示50 mg/kg注射组肝细胞轻度浊肿变性,肺脏轻微炎症;100mg/kg注射组肝细胞浊肿变性明显、肺脏重度炎症、脑组织出现局灶性坏死。免疫组化染色结果显示,在被检脏器中均检出rLTB,以大脑含量最高,脾脏和肝脏次之,心脏和肺脏检出量低。rLTB大剂量肌肉注射可引起鸭一定的组织学病变,对鸭的安全使用剂量应不超过50 mg/kg。 展开更多

关键词 大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位 鸭 吸收代谢 组织分布

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幽门螺杆菌UreB414-OMP18-LTB融合蛋白的构建及免疫原性初步研究 被引量：3

11

作者 葛迪 郭刚 +2 位作者 毛旭虎 张卫军 邹全明 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1107-1110,共4页

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylor,iHp)尿素酶B亚单位活性片段(UreB414)、外膜蛋白(OMP18)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其抗原性。方法PCR扩增ureb414、omp18、ltb基因,分别克隆入pMD18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融... 目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylor,iHp)尿素酶B亚单位活性片段(UreB414)、外膜蛋白(OMP18)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其抗原性。方法PCR扩增ureb414、omp18、ltb基因,分别克隆入pMD18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UOL,然后将其亚克隆入原核表达载体pET-28 a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS-PAGE电泳进行表达,W estern印迹检测表达蛋白的抗原性。结果PCR扩增分别获得约414、537 bp和320 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约1 200 bp目的基因。重组融合蛋白表达量可达细菌总蛋白的15%,免疫印迹检测结果显示该重组蛋白可为UreB、OMP18、LTB兔抗血清特异识别,具有良好的抗原性。结论成功构建了具有良好免疫原性的UreB-OMP18-LTB融合蛋白。 展开更多

关键词 幽门螺杆菌 尿素酶 外膜蛋白 大肠埃希菌不耐热毒素b亚单位 疫苗

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产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位可有效诱导和增强对肠道病毒71型的黏膜免疫应答 被引量：2

12

作者 谢婷婷 胡琼文 马永平 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1233-1237,共5页

目的研究产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的免疫原性。评价肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1联合LTB的鼻腔免疫效果。方法构建重组质粒pET32a-LTB,表达的6×His-LTB融合蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化后免疫新西兰大白兔制备抗血清... 目的研究产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的免疫原性。评价肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1联合LTB的鼻腔免疫效果。方法构建重组质粒pET32a-LTB,表达的6×His-LTB融合蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化后免疫新西兰大白兔制备抗血清,ELISA检测抗血清效价。用纯化的EV71 VP1、LTB联合EV71 VP1、生理盐水分别经鼻腔免疫BALB/c小鼠,收集血清、肺和小肠黏膜冲洗液,采用间接ELISA检测IgG和分泌性IgA(sIgA)。结果已成功构建重组质粒pET32a-LTB。表达的6×His-LTB融合蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,免疫兔所制备的抗血清效价为1∶125 000。EV71 VP1联合LTB组的小鼠特异性IgG和sIgA水平较EV71 VP1单独免疫组和对照组有明显增高。结论在E.coli BL21(DE3)中成功表达了6×His-LTB融合蛋白,纯化的融合蛋白具有良好的免疫活性和佐剂活性。通过滴鼻免疫,LTB可有效增强特异性血清抗体反应,诱导黏膜免疫应答。 展开更多

关键词 不耐热肠毒素b亚单位 肠道病毒71型 免疫原性 黏膜免疫

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