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鹅星状病毒通用型TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
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作者 陈立功 穆英丽 +5 位作者 张诚 潘保革 范乐乐 魏忠华 王学静 刘聚祥 《中国家禽》 北大核心 2025年第2期53-59,共7页
为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量RT-PCR方法,试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针,采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度,在优化退火温度的基础... 为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量RT-PCR方法,试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针,采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度,在优化退火温度的基础上,分别建立扩增GAstV 1和GAstV 2的标准曲线,进一步验证该方法的特异性、敏感性和重复性,建立的方法用于临床样品的检测,并与文献报道的常规RT-PCR方法进行比较。结果显示:优化后的反应体系中最优上、下游引物浓度均为0.40(或0.50)μmol/L,探针浓度均为0.50μmol/L,扩增线性范围分别为3.26×10^(3)~3.26×10^(8)拷贝/μL和7.09×10^(3)~7.09×10^(8)拷贝/μL,相关系数均为0.998;该方法可特异性检出两种GAstV,但对新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鹅细小病毒和血清4型禽腺病毒6种鹅病相关病毒的核酸均无扩增信号;其检测限分别为3.26×10^(2)拷贝/μL和7.09×10^(1)拷贝/μL;组内变异系数和组间变异系数均低于3%。建立的实时荧光定量RT-PCR方法对临床样品的检测结果显示,GAstV阳性率为90.57%(96/106);而文献报道的常规RT-PCR方法对GAstV 1和GAstV 2的混合阳性率为62.26%。研究表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法为同时检测GAstV 1和GAstV 2提供了快速、敏感、特异且能满足临床样本需求的检测方法。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 荧光定量rt-pcr TAQMAN探针
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兔出血症病毒RHDV1和RHDV2一步法双重TaqMan探针荧光定量RT-PCR体系的建立和应用
2
作者 陈萌萌 王冠萱 +8 位作者 仇汝龙 范志宇 胡波 宋艳华 魏后军 徐为中 葛雷 李一鸣 王芳 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第5期937-942,共6页
兔出血症病毒(RHDV)引起的兔出血症是一种急性、高度致死性传染病,对养兔业造成严重危害。本研究基于RHDV衣壳蛋白(VP60)基因序列设计引物和TaqMan探针,建立可同时检测RHDV1和RHDV2两种毒株的双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系。反应体... 兔出血症病毒(RHDV)引起的兔出血症是一种急性、高度致死性传染病,对养兔业造成严重危害。本研究基于RHDV衣壳蛋白(VP60)基因序列设计引物和TaqMan探针,建立可同时检测RHDV1和RHDV2两种毒株的双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系。反应体系:2×One Step RT-PCR BufferⅢ10.0μL,上下游引物(10μmol/L)各0.6μL,ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4μL,两种荧光探针(10μmol/L)各0.8μL,待测样本2.0μL,ddH_(2)O 4.8μL。反应程序:42℃5 min,95℃10 s,95℃5 s,60℃30 s,40个循环。试验结果表明,该体系特异性强,与轮状病毒、兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌、绿脓杆菌、沙门氏菌无交叉反应;灵敏度高,最低检测限为1μL 100拷贝。通过组内重复和组间重复进行重复性分析,Ct值变异系数为0.2%~2.9%,表明该体系稳定性较好。使用该体系对112份临床样本(60份肝脏组织、52份鼻肛拭子)进行检测,RHDV总检出率为69%,而常规RT-PCR体系的检出率仅为51%。本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法具有高灵敏度、强特异性和良好的重复性,可为RHDV的临床快速诊断及定量分析提供可靠技术支持。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 荧光定量rt-pcr TAQMAN探针
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猫传染性腹膜炎的RT-PCR诊断及病理组织学观察
3
作者 王成丽 祝启成 +7 位作者 吴明慧 蔡敏欢 孙宇旭 高德翔 高峰 张杰 王文杰 静争 《特产研究》 2025年第4期145-151,共7页
本文对两例疑似感染猫传染性腹膜炎病毒的死亡患猫,通过观察临床症状、实验室检查、病原RT-PCR检测以及病理组织切片等方法进行确诊。首先,收集患猫腹水样品进行RT-PCR检测呈阳性,并构建系统发育树、进行同源性分析,显示两猫腹水样品均... 本文对两例疑似感染猫传染性腹膜炎病毒的死亡患猫,通过观察临床症状、实验室检查、病原RT-PCR检测以及病理组织切片等方法进行确诊。首先,收集患猫腹水样品进行RT-PCR检测呈阳性,并构建系统发育树、进行同源性分析,显示两猫腹水样品均能扩增出417 bp大小的阳性目的条带,序列与猫冠状病毒有很高的同源性。系统发育树显示,与猫传染性腹膜炎病毒处于同一发育分支;再次通过病理组织切片镜检结果显示肝脏、脾脏、肾脏等被膜外均有大量纤维素渗出,并伴有炎性细胞、广泛性脂肪变性,心肌纤维发生颗粒变性等严重病理损伤。最终确诊2例患猫均感染了猫传染性腹膜炎病毒,且该病毒对猫多种主要器官造成了严重损伤。 展开更多
关键词 猫传染性腹膜炎 rt-pcr 系统发育树 病理组织学
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H3、H4、H6和H9亚型禽流感病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
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作者 龙凤 熊陈勇 +11 位作者 施开创 郑敏 林昌华 林宝江 杜忠 韦显凯 冯淑萍 屈素洁 陆文俊 李剑锋 周明旭 尹彦文 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第1期31-38,共8页
为同时鉴别检测H3、H4、H6和H9亚型禽流感病毒(AIV),本研究根据上述4种亚型AIV HA基因的保守区,采用primer6.0设计4对特异性引物和TaqMan探针,经PCR扩增上述4种亚型AIVHA基因后,分别克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒p-H3、p-H4、p-H6和p... 为同时鉴别检测H3、H4、H6和H9亚型禽流感病毒(AIV),本研究根据上述4种亚型AIV HA基因的保守区,采用primer6.0设计4对特异性引物和TaqMan探针,经PCR扩增上述4种亚型AIVHA基因后,分别克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒p-H3、p-H4、p-H6和p-H9,并均经PCR与测序鉴定正确后作为标准品。通过优化各反应条件,初步建立了检测H3、H4、H6和H9亚型AIV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法。分别以H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9亚型AIV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭圆环病毒(DuCV)、番鸭细小病毒(MDPV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和新城疫病毒(NDV)的RNA或者DNA作为模板,采用本研究建立的多重RT-qPCR检测,评估该方法的特异性;将4个重组质粒标准品等体积混合物10倍倍比稀释后作为模板,采用本研究建立的多重RT-qPCR检测,评估该方法的敏感性;选择3个浓度的重组质粒标准品等体积混合物作为模板,采用本研究建立的多重RT-qPCR分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅H3、H4、H6和H9亚型AIV出现扩增曲线,其他相关禽病病原均为阴性,特异性较强;该方法对H3、H4、H6和H9亚型AIV的检测限均为1.0×101拷贝/µL,敏感性较高;批内和批间重复性试验的变异系数为0.06%~1.09%,重复性较好。利用该方法检测来自广西不同地区的3360份临床家禽咽喉、泄殖腔拭子样品,结果显示H3、H4、H6和H9亚型AIV的检出率分别为4.08%(137/3360)、0.21%(7/3360)、1.13%(38/3360)和3.51%(118/3360),与各亚型AIV单一RT-qPCR商品化试剂盒的检测结果均一致,符合率达100%。表明本研究建立的多重RT-qPCR准确性较好,可以用于临床各类样品的检测。本研究建立了一种同时鉴别检测H3、H4、H6和H9亚型AIV的多重RT-qPCR方法,为AIV基因分型和流行病学调查提供便捷的技术手段。 展开更多
关键词 禽流感病毒 荧光定量rt-pcr TAQMAN
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不同基因型PRRSV鉴别诊断多重RT-PCR检测方法的建立 被引量：1
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作者 贾钦瑞 闫乙鑫 +4 位作者 罗志鹏 徐通 陈弟诗 周远成 朱玲 《四川农业大学学报》 北大核心 2025年第2期452-457,478,共7页
【目的】针对PRRSV的多基因型特性,旨在建立一种灵敏、特异且稳定的多重RT-PCR检测方法。【方法】根据GeneBank数据库中公布的ORF1、ORF6和Nsp2基因保守序列分别设计合成3对特异性引物,分别以PRRSV欧洲株(PRRSV-1)、高致病性毒株(HP-PRR... 【目的】针对PRRSV的多基因型特性,旨在建立一种灵敏、特异且稳定的多重RT-PCR检测方法。【方法】根据GeneBank数据库中公布的ORF1、ORF6和Nsp2基因保守序列分别设计合成3对特异性引物,分别以PRRSV欧洲株(PRRSV-1)、高致病性毒株(HP-PRRSV)、美洲经典株(Classic-PRRSV)和NADC30-like株cDNA为模板进行PCR扩增并构建重组质粒,通过对反应体系和反应条件的优化建立不同基因型PRRSV鉴别诊断多重RT-PCR检测方法。对该方法进行特异性、灵敏性、重复性和准确性验证。【结果】优化过后的cDNA模板为7.5μL,引物为0.5μL,退火温度为56℃;该方法与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)无交叉反应,特异性强。对PRRSV-1、NADC30、HP-PRRSV、Classic-PRRSV株的最低检测下限分别为3.93×10^(2)、4.52×10^(2)、3.70×10^(2)和4.58×10^(2)copies/μL,灵敏性较高。分别以10^(4)copies/μL的混合阳性质粒和4种单一阳性质粒为模板,进行PCR扩增,重复性较好。对来自四川各地的118份临床样本进行检测,总符合率达到98%。【结论】该方法能够精确鉴别PRRSV的不同基因型毒株,具有良好特异性、灵敏性、重复性和准确性,在临床样品中鉴别不同基因型PRRSV毒株的方面具有较高的应用价值。 展开更多
关键词 PRRSV欧洲株 高致病性毒株 美洲经典株 NADC30-like株 多重rt-pcr
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牛阿卡斑病RT-PCR检测方法的建立 被引量：1
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作者 尚佳富 李明科 +6 位作者 徐婷婷 杨晓伟 刘霞 张立武 曹礼静 倪兴维 赵光伟 《贵州农业科学》 2025年第1期55-61,共7页
【目的】建立牛阿卡斑病(Akabane disease,AKAD)RT-PCR实验室快速检测方法,为该病的临床防控提供技术支撑。【方法】参考前期获得的阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)S基因序列(OR791104.1),针对其保守区域设计特异性扩增引物,以构建的pMD... 【目的】建立牛阿卡斑病(Akabane disease,AKAD)RT-PCR实验室快速检测方法,为该病的临床防控提供技术支撑。【方法】参考前期获得的阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)S基因序列(OR791104.1),针对其保守区域设计特异性扩增引物,以构建的pMD-AKAV重组质粒为模板,建立RT-PCR检测方法,并对其扩增条件进行优化,进而对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,最后将所建方法对实验室保存的19份阳性和279份阴性牛血清临床样本进行符合性检测,验证该方法的准确性。【结果】所建方法的最佳反应条件为95℃预变性3 min;95℃变性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸15 s,共37个循环;72℃延伸5 min。对牛蓝舌病病毒、多杀性巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒和牛支原体等病原均为阴性,特异性良好;对阳性质粒检测最低限为2.5×10^(3) copies/μL,灵敏性高;重复性试验显示不同批次样本检测结果均一致,可重复性强;对实验室保存的298份(19份阳性、279份阴性)临床样本进行检测,其结果均与预期一致,符合率100%。【结论】建立的牛阿卡斑病RT-PCR检测方法特异性良好、灵敏性高、可重复性强。 展开更多
关键词 牛 赤羽病 阿卡斑病毒 rt-pcr 检测 防控
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猪繁殖与呼吸综合征病毒三重纳米RT-PCR检测方法的建立 被引量：1
7
作者 茹敏 高洁 +3 位作者 赵治钤 郑丹阳 赵谜 穆杨 《动物医学进展》 北大核心 2025年第7期18-25,共8页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在猪群中不断变异和传播,给世界养猪业造成严重的经济损失。将纳米颗粒与传统RT-PCR技术相结合,根据不同毒株Nsp2核苷酸序列,设计合成PRRSV特异性通用引物,在对退火温度、引物浓度、反应循环数等进行优化... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在猪群中不断变异和传播,给世界养猪业造成严重的经济损失。将纳米颗粒与传统RT-PCR技术相结合,根据不同毒株Nsp2核苷酸序列,设计合成PRRSV特异性通用引物,在对退火温度、引物浓度、反应循环数等进行优化后,建立了能鉴别经典、高致病性和NADC30样PRRSV毒株的三重纳米RT-PCR(Nano RT-PCR)检测方法。特异性试验结果显示,使用该方法检测猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪细小病毒等病毒均无交叉反应。该方法对经典、高致病性和NADC30样PRRSV毒株的Nsp2重组质粒的检出限分别为3.32×10^(2)、6.18×10^(3)、3.26×10^(3)拷贝/μL,高于常规RT-PCR方法的灵敏度。对80份临床样本的检测结果显示,该方法可用于临床样品中PRRSV经典毒株、高致病性毒株和NADC30样毒株的鉴别检测,并可确定毒株类型,为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测提供了技术支撑。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 经典毒株 高致病性毒株 NADC30样毒株 纳米rt-pcr
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牛轮状病毒微滴式数字RT-PCR检测方法的建立及初步应用
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作者 谢世斌 郑辉 +6 位作者 沙洲 房琳琳 尼博 张慧 董雅琴 魏荣 崔进 《中国草食动物科学》 北大核心 2025年第1期44-49,共6页
本研究旨在建立更加灵敏的牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)检测方法,为BRV的病原学调查及畜牧养殖行业疫病防控提供更加准确和灵敏的技术支持。根据BRV VP6基因组序列,利用Oligo7.56软件设计并合成特异性引物与探针,通过优化反应条件... 本研究旨在建立更加灵敏的牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)检测方法,为BRV的病原学调查及畜牧养殖行业疫病防控提供更加准确和灵敏的技术支持。根据BRV VP6基因组序列,利用Oligo7.56软件设计并合成特异性引物与探针,通过优化反应条件,建立检测BRV的微滴式数字RT-PCR方法,同时开展特异性、敏感性和重复性试验,并将建立的方法应用于14份临床样品的检测。结果表明,本研究所建方法的最低检测限为1.83 copies/μL,具有良好的可重复性,与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型均无交叉反应。对14份临床样品进行检测,共检测出4份阳性样品,阳性率为28.57%,检测结果与实时荧光定量RT-PCR检测结果的符合率为100.00%。综上说明,本研究建立的BRV微滴式数字RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床样本的检测,为BRV的诊断和流行病学调查提供了技术支持。 展开更多
关键词 牛轮状病毒 VP6基因 微滴式数字rt-pcr
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盖塔病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 顾志刚 郭洁真 +4 位作者 王子涵 孙彤 陈鸿军 孙竹筠 陈丹清 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期112-118,共7页
盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引... 盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引物探针,筛选出最佳的引物探针,建立一种灵敏度高、特异性强的针对盖塔病毒的TaqMan探针实时荧光定量RTPCR检测方法。对该方法进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品检测。标准曲线Ct值与相应质粒标准品浓度存在良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9989;对含GETV基因的重组质粒pCDNA3.1-nsP1体外转录RNA进行敏感性试验,最低检出限达10 copies,是普通RT-PCR方法的1000倍,敏感性高;与PRRSV、CSFV与PEDV的核酸不发生交叉反应,特异性好;变异系数小于2%,重复性好。本研究建立了一种敏感、特异的GETV检测方法,对GETV的快速诊断具有重要意义。 展开更多
关键词 盖塔病毒 nsP1 TAQMAN探针 实时荧光定量rt-pcr
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西番莲3种病毒多重RT-PCR检测技术的建立与应用
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作者 韩俊娜 张继荣 +2 位作者 旷艺璇 王莹 黄爱军 《植物保护》 北大核心 2025年第3期289-295,300,共8页
西番莲Passiflora edulis是一种广泛分布于我国热带、亚热带地区的高经济作物,但病毒病害严重制约西番莲的产业发展。尤其马铃薯Y病毒属Potyvirus的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,TeMV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora v... 西番莲Passiflora edulis是一种广泛分布于我国热带、亚热带地区的高经济作物,但病毒病害严重制约西番莲的产业发展。尤其马铃薯Y病毒属Potyvirus的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,TeMV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)以及西番莲斑驳病毒(Passiflora mottle virus,PaMoV)是西番莲上发生较为普遍的病毒,这些病毒单独或者混合侵染均可在西番莲上引起严重危害。本研究针对3种病毒基因组保守区域设计特异引物并筛选,优化引物浓度、退火温度,建立了可同时扩增3种病毒的多重RT-PCR检测体系。该检测体系产物片段大小分别是TeMV 685 bp、PaMoV 405 bp和EAPV 248 bp,扩增产物清晰、特异,检测TeMV与EAPV的灵敏度分别较普通单重RT-PCR灵敏度低约10倍和100倍,PaMoV灵敏度与普通单重RT-PCR灵敏度一致。采用多重RT-PCR和单一RT-PCR对收集到的田间样品分别检测,结果显示,2种方法检测结果一致,表明该方法可准确、快速、灵敏地检测复合侵染的3种病毒,可用于田间发病样品的检测。 展开更多
关键词 西番莲 夜来香花叶病毒 东亚西番莲病毒 西番莲斑驳病毒 多重rt-pcr
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车前草花叶病毒外壳蛋白基因实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用
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作者 李鑫 李扬 +2 位作者 李辉 李可 王秀芬 《生物安全学报(中英文)》 北大核心 2025年第3期212-220,共9页
【目的】建立一套适用于百合车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)快筛的实时荧光RT-PCR检测方法。【方法】以PlAMV为检测目标,在NCBI网站上Blast检索数据库中的PlAMV以及相同寄主上常见的16种病毒的特异性基因外壳蛋... 【目的】建立一套适用于百合车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)快筛的实时荧光RT-PCR检测方法。【方法】以PlAMV为检测目标,在NCBI网站上Blast检索数据库中的PlAMV以及相同寄主上常见的16种病毒的特异性基因外壳蛋白(coat protein,CP)序列信息,根据序列碱基替换的饱和性分析、系统发育树分析以及遗传距离分析结果,确定PlAMV的特异性基因,以CP基因为靶标,设计特异性强的引物和探针,建立特异性实时荧光检测方法,验证引物特异性,测试反应的灵敏度,并对21份疑似感染PlAMV的百合样品测试检测效果。【结果】确定CP基因作为PlAMV检测的特异性基因,设计2组特异性引物和探针,利用疑似感染PlAMV的百合样品进行检测效果验证,建立了2套快筛的PlAMV实时荧光RT-PCR检测体系,检出限达到1 pg·μL^(-1),2组引物和探针均检测出21份阳性样品,检出率均为100%,2组引物和探针的扩增效率相近。【结论】建立的实时荧光RT-PCR反应体系可特异性定量检测PlAMV,并可应用于口岸样品进行快速、准确的筛查,为加强对PlAMV的分析与管控,制定全面系统的控制措施提供了技术支持。 展开更多
关键词 车前草花叶病毒 外壳蛋白 实时荧光 rt-pcr 生物信息学
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猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30毒株鉴别诊断荧光RT-PCR检测方法的建立
12
作者 覃国喜 米树运 +3 位作者 孙竹筠 刘德清 罗婷婷 熊炜 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期84-90,共7页
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的危害生猪养殖业的重要传染病之一。NADC30毒株是PRRSV的一种新毒株,其Nsp2存在131个不连续氨基酸缺失。该毒株在临床流行中致病力不同,且常规PRRSV疫苗免疫无法有效预... 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的危害生猪养殖业的重要传染病之一。NADC30毒株是PRRSV的一种新毒株,其Nsp2存在131个不连续氨基酸缺失。该毒株在临床流行中致病力不同,且常规PRRSV疫苗免疫无法有效预防其感染,给养殖企业防控PRRSV带来困难。本研究基于TaqMan探针技术,针对经典型PRRSV保守基因序列及PRRSV NADC30缺失区域保守序列,设计不同荧光标记探针,建立双重实时荧光RT-PCR鉴别方法,可区分经典型PRRSV与PRRSV NADC30毒株。结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可快速区分经典型PRRSV毒株与PRRSV NADC30毒株,对PRRSV经典型疫苗毒株及临床NADC30毒株样本检测效果良好,适用于猪场临床样品中PRRSV NADC30毒株的快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 NDAC30毒株 双重实时荧光rt-pcr
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传染性造血器官坏死病毒和传染性胰脏坏死病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立
13
作者 张文 徐立蒲 +7 位作者 吕晓楠 潘勇 王小亮 曹欢 王静波 王姝 阴鸿达 王澎 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期494-500,共7页
为建立一种快速、高效、敏感的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的双重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参照世界动物卫生组织(WOAH)最新推荐的IHNV RT-qPCR方法,根据IHNV N基因合成1对特异性引物和1条经... 为建立一种快速、高效、敏感的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的双重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参照世界动物卫生组织(WOAH)最新推荐的IHNV RT-qPCR方法,根据IHNV N基因合成1对特异性引物和1条经FAM标记的Taq Man探针;根据本研究室建立的6种基因型IPNV(VP2基因)RT-qPCR方法合成1对特异性引物和1条经VIC标记的Taq Man探针。经优化各反应条件,初步建立了IHNV的和IPNV双重RT-qPCR检测方法。分别以IHNV、IPNV、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的cDNA以及病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)的重组质粒作为模板,采用本研究建立的双重RT-qPCR检测,评估该方法的特异性;以终浓度分别为1.0×10^(1)拷贝/μL~1.0×10^(9)拷贝/μL pIHNV和p IPNV质粒标准品的混合物作为模板,采用建立的双重RT-qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3个不同终浓度的质粒标准品混合物作为模板,采用本研究建立的双重RT-qPCR分别于同一时间和不同时间检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增IHNV和IPNV及二者的质粒标准品混合物,其他相关水生动物病毒均无扩增曲线,特异性较强;对pIHNV和pIPNV质粒标准品的检测限均为1.25拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。将本实验室保存的45份虹鳟组织上清液传1~2代后,取出现典型CPE的细胞培养物,采用本实验建立的双重RT-qPCR方法和国标中的IHNV RT-PCR及已报道的IPNV RT-PCR方法同时检测。结果显示,3种方法均检出35份阳性样品,其中,IHNV的阳性检出率均为33.3%(15/45),IPNV的阳性检出率均为44.4%(20/45),3种方法的符合率均达100%。本研究首次建立了同时鉴别检测IHNV和IPNV的双重RT-qPCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好,可为IHNV和IPNV的鉴别检测及流行病学调查提供新的技术手段。 展开更多
关键词 传染性造血器官坏死病毒 传染性胰脏坏死病毒 双重荧光定量rt-pcr
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恒温荧光法及RT-PCR法检测南美白对虾常见病
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作者 赵龙飞 韩煜茹 +1 位作者 王万兴 蔡树东 《现代畜牧兽医》 2025年第2期27-30,共4页
试验旨在探究恒温荧光法及RT-PCR法检测南美白对虾常见3类疾病(病毒类、细菌类、寄生虫类)的应用效果。试验随机抽取3份虾苗样品,每份样品15~20头,采用RT-PCR法检测肝胰腺细小病毒(HPV)、对虾杆状病毒(BPV),恒温荧光法检测致急性肝胰腺... 试验旨在探究恒温荧光法及RT-PCR法检测南美白对虾常见3类疾病(病毒类、细菌类、寄生虫类)的应用效果。试验随机抽取3份虾苗样品,每份样品15~20头,采用RT-PCR法检测肝胰腺细小病毒(HPV)、对虾杆状病毒(BPV),恒温荧光法检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(Vp_(AHPND))、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、黄头病毒(YHV)、虹彩病毒(DIVI)、哈维氏弧菌(HVS)、桃拉病毒(TSV)、虾肝肠胞虫(EHP)、白斑综合征病毒(WSSV)。结果显示,恒温荧光法检测Vp_(AHPND)、IHHNV、YHV、DIVI、TSV、HVS、WSSV、EHP等8种病原结果均为阴性,凝胶电泳试验中未出现HPV、BPV条带,表明虾苗未携带上述病原。研究表明,RT-PCR法与恒温荧光法可快速有效地检测南美白对虾虾苗病原携带情况。 展开更多
关键词 南美白对虾 恒温荧光法 rt-pcr法
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1种牛轮状病毒Taq-Man荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 王秀明 陈君彦 +1 位作者 础鲁 刘艳霞 《现代畜牧兽医》 2025年第3期11-15,共5页
试验旨在建立一种可简便、快速地检测牛轮状病毒(BRV)的Taq-Man荧光定量RT-PCR方法,试验通过分析比对NCBI下载的BRV VP7基因序列,在VP7基因的保守区设计两对特异性引物及Taq-Man探针,经反应条件优化,建立BRV的Taq-Man荧光定量RT-PCR方... 试验旨在建立一种可简便、快速地检测牛轮状病毒(BRV)的Taq-Man荧光定量RT-PCR方法,试验通过分析比对NCBI下载的BRV VP7基因序列,在VP7基因的保守区设计两对特异性引物及Taq-Man探针,经反应条件优化,建立BRV的Taq-Man荧光定量RT-PCR方法。利用建立的检测方法检测标准品,绘制标准曲线,检测方法的特异性、灵敏性和稳定性,并对临床样品及疫苗半成品进行检验。结果显示,建立的Taq-Man荧光定量RT-PCR方法的最低检测限为10 copies/μL,组内和组间重复变异系数(CV)均小于3.50%。检测临床样品和疫苗半成品,疫苗半成品均检测阳性,临床样品检测阳性率69%。研究表明,BRV Taq-Man荧光定量RTPCR检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高,对BRV的诊断检测及疫苗生产具有重要的参考价值。 展开更多
关键词 牛轮状病毒(BRV) Taq-Man探针 荧光定量rt-pcr VP7基因
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蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立
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作者 马晓菁 谷文喜 +5 位作者 叶锋 刘帅 刘丽娅 谢彩云 钟旗 易新萍 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期253-259,共7页
【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blas... 【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blast比对,用软件MEGA 5.0分析序列差异,根据蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,运用软件Oligo6.0设计引物,对蓝舌病新疆分离株S7基因进行RT-PCR扩增,并验证该方法的特异性及敏感性。【结果】蓝舌病中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与哈尔滨报道BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%;与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%,其余均无同源性序列。中国新疆分离株S7基因片段序列与4条同源序列间存在26处核苷酸差异,9处氨基酸差异。【结论】建立的蓝舌病中国新疆分离株S7基因片段一步法RT-PCR方法具有良好的特异性,仅BTV中国新疆分离株扩增获得目的条带,该方法的敏感性为4.0×10^(3)copies/mL。 展开更多
关键词 蓝舌病 VP7蛋白 rt-pcr
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河南郑州桃园桃病毒T的RT-PCR检测
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作者 王新卫 刘立立 +6 位作者 方伟超 陈昌文 朱更瑞 曹珂 李勇 吴金龙 王力荣 《中国果树》 2024年第9期86-89,共4页
通过选取河南省郑州市周边桃园生长不正常的树体叶片,进行RT-PCR检测桃病毒T的感染。结果表明,18份样品中检测到了6份样品存在病毒感染,检出率为33.3%。检出病毒的桃树样品分布在新郑市多个乡镇的果园,共有5个品种检出病毒;来自巩义市... 通过选取河南省郑州市周边桃园生长不正常的树体叶片,进行RT-PCR检测桃病毒T的感染。结果表明,18份样品中检测到了6份样品存在病毒感染,检出率为33.3%。检出病毒的桃树样品分布在新郑市多个乡镇的果园,共有5个品种检出病毒;来自巩义市的样品未检测出桃病毒T。检出病毒的桃品种既有生产上的老品种,又有近几年栽植的新品种。结合多个桃园的病毒检出,说明病毒T已在生产中存在较长时间,并在局部区域呈扩散趋势。 展开更多
关键词 桃园 病毒病防控 rt-pcr 桃病毒T(PVT) 感染
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：2
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作者 李鹏飞 高桂琴 +6 位作者 周广青 吴锦艳 颜新敏 曹小安 何继军 袁莉刚 尚佑军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2259-2266,共8页
山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在... 山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 羊内源性逆转录病毒 TAQMAN 荧光定量rt-pcr
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3种苹果病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立 被引量：1
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作者 李紫腾 潘媛 +4 位作者 马子文 胡同乐 王树桐 曹克强 王亚南 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期84-92,共9页
苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病... 苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病毒,本研究根据ASPV、ASGV和ApNMV基因组保守序列设计特异引物建立了3种病毒高灵敏度的实时荧光定量PCR检测体系(Real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)。结果表明:引物ASGV-qF/qR-1、ASPV-qF/R-2和ApNMV-qF/R-3有较高的特异性,最适宜的退火温度分别为60℃、58℃和58℃,ASGV、ASPV和ApNMV 3种病毒的RT-qPCR体系比常规RT-2 PCR检测体系灵敏度高100倍,最低检出限分别为82.6、1.49×10^(2)和13.3 copies/μL。检测体系的Ct值的变异系数均小于5%,组间的变异系数在5%以内。河北农业大学果园中经RT-PCR确定带毒的88棵苹果树RT-qPCR检出率为100%,表明建立的RT-qPCR方法的可靠性和稳定性高,适用于田间果树3种病毒的检测,为苹果病毒的准确诊断提供了技术支撑。 展开更多
关键词 苹果茎沟病毒 苹果茎痘病毒 苹果坏死花叶病毒 荧光定量rt-pcr检测体系
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鹅源class I类NDV生物学特性的研究及荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：1
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作者 李长宇 孙军峰 +3 位作者 赵冉 王芳芳 韩宗玺 刘胜旺 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期923-930,共8页
为了解鹅源class I类新城疫病毒(NDV)的生物学特性,本研究以2022年在安徽活禽市场的鹅中分离到的AH713/22株为研究对象,测定其全基因组序列,分析其基因组分子特征和遗传进化特性;将AH713/22株感染鸡胚,接种1日龄雏鸡脑内,分析其致病性;... 为了解鹅源class I类新城疫病毒(NDV)的生物学特性,本研究以2022年在安徽活禽市场的鹅中分离到的AH713/22株为研究对象,测定其全基因组序列,分析其基因组分子特征和遗传进化特性;将AH713/22株感染鸡胚,接种1日龄雏鸡脑内,分析其致病性;利用制备的单因子血清进行交叉血凝抑制试验,分析其抗原性;将AH713/22株56℃水浴不同时间后检测HA效价,分析其耐热特性。结果显示,AH713/22株基因组长15198 bp,具有典型的class I类NDV的基因组结构和分子特征,属于基因1.1.2亚型。F蛋白裂解位点为ERQERL,HN蛋白长度不同于已往报道的病毒株,含有618个氨基酸;鸡胚平均死亡时间(MDT)为134 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为0.32,表明AH713/22属于弱毒株;抗原性检测结果显示AH713/22株与class II类基因II型NDV以及class I类代表性NDV之间存在不同程度的抗原性差异;耐热性试验显示AH713/22株在56℃热处理60 min后HA效价仍无显著变化,表明AH713/22株具有优良的热稳定性。进一步基于class I类基因1.1.2亚型NDV F基因的序列比对分析,针对其保守区域设计引物和探针,建立了荧光定量RT-PCR检测方法,结果显示该方法对质粒标准品的检测限为10^(2)拷贝数/μL,且能够特异性的检测class I类1.1.2亚型NDV,与其他常见的禽呼吸道病原核酸均无交叉反应。该方法用于临床样品检测结果与常规PCR检测结果一致。本研究系统鉴定了一株鹅源class I类NDV的遗传和分子生物学特性,加深了对我国class I类NDV遗传演化的认知,并建立了适用于我国优势基因型(1.1.2亚型)NDV的检测方法,为class I类NDV的监测和流行病学调查提供了技术支撑。 展开更多
关键词 新城疫病毒 鹅 分子特征 抗原性 热稳定性 荧光定量rt-pcr方法
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