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人β_3肾上腺素受体真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β_3-AR的构建及表达 被引量：7
1
作者 曾凡新 董志 +1 位作者 傅洁民 刘晓海 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第21期2070-2072,共3页
目的构建人β3肾上腺素受体(β3-AR)的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR,并通过脂质体介导转染HEK293细胞使之表达该受体蛋白。方法以pENTR_ADRB3-Stop质粒为模板,采用PCR法扩增出人β3-AR cDNA,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建... 目的构建人β3肾上腺素受体(β3-AR)的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR,并通过脂质体介导转染HEK293细胞使之表达该受体蛋白。方法以pENTR_ADRB3-Stop质粒为模板,采用PCR法扩增出人β3-AR cDNA,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建成真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR。将该质粒转染HEK293真核细胞,通过RT-PCR检测β3-AR mRNA在HEK293细胞内的表达,通过免疫荧光法检测β3-AR蛋白在HEK293细胞中的表达。结果酶切和DNA测序鉴定均证实重组质粒含有人β3-AR编码区全长。在转染重组质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR的HEK293细胞中检测到了β3-AR基因的转录和翻译产物。结论通过基因工程方法成功构建了β3-AR的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β-AR,为进一步建立β-AR的稳定表达细胞株,用于筛选高效、高选择性β-AR激动剂奠定了基础。 展开更多
关键词 Β3肾上腺素受体 真核表达载体 HEK293细胞
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p38MAPK基因RNAi慢病毒载体的构建及在MC3T3-E1细胞的表达 被引量：2
2
作者 冯正平 邓华聪 +3 位作者 姜蓉 杜佳 陈丹燕 梁小燕 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第15期1598-1601,共4页
目的构建小鼠p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK表达及细胞凋亡的影响。方法设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPK mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ酶切后的载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定... 目的构建小鼠p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK表达及细胞凋亡的影响。方法设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPK mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ酶切后的载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒,流式细胞仪检测病毒滴度,p38MAPK-shRNA慢病毒载体转染体外培养MC3T3-E1细胞,荧光定量PCR检测MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达,进行p38MAPK干扰有效靶点的筛选。22.2 mol/L葡萄糖刺激培养MC3T3-E1细胞7 d,Westernblot检测MC3T3-E1细胞p38MAPK蛋白的表达,流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡。结果酶切和测序均证实各重组质粒核苷酸序列插入正确,所得质粒分别命名为p38MAPK-shRNA1、p38MAPK-shRNA2、p38MAPK-shRNA3,流式细胞仪测定病毒滴度分别为2.4×108、2.8×108、2.5×108TU/ml。p38MAPK-shRNA转染MC3T3-E1细胞效率达到74%以上,RT-PCR检测结果显示,各p38MAPK-shRNA转染组MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达较正常对照组分别下降了78.8%、84.3%和60.2%(P<0.01),其中以p38MAPK-shRNA2的干扰效率最高。Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组、空载体转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达明显增加(P<0.01)。p38MAPK-shRNA慢病毒转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达水平较高糖组明显下调(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率显著增加(P<0.01);p38MAPK-shRNA慢病毒转染组以及p38MAPK信号转导阻断剂组较高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率明显减少(P<0.05,P<0.01)。结论成功构建了靶向p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,其能有效抑制MC3T3-E1细胞p38MAPK基因表达,减少高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。 展开更多
关键词 P38MAPK 成骨细胞 RNA干扰 慢病毒属
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重组腺病毒CD82／KAI1对小鼠子宫基质细胞内α5、β3、MMP-9、E-cadherin和β-catenin蛋白表达的影响 被引量：2
3
作者 尉晓蔚 张倩 +3 位作者 谭冬梅 赵邦霞 何通川 谭毅 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期572-576,共5页
目的研究CD82/KAI1对着床窗口期小鼠子宫基质细胞内整合素α5、β3、MMP-9、E-cadherin和β-catenin蛋白表达的影响。方法采用基因工程技术,构建CD82/KAI1腺病毒;用免疫细胞化学技术观察妊娠小鼠子宫基质细胞感染CD82/KAI1腺病毒后,细... 目的研究CD82/KAI1对着床窗口期小鼠子宫基质细胞内整合素α5、β3、MMP-9、E-cadherin和β-catenin蛋白表达的影响。方法采用基因工程技术,构建CD82/KAI1腺病毒;用免疫细胞化学技术观察妊娠小鼠子宫基质细胞感染CD82/KAI1腺病毒后,细胞内α5、β3、MMP-9、E-cadherin和β-catenin的表达变化情况。结果①构建的小鼠重组腺病毒的滴度达到6.5×1012pfu/ml,感染原代培养的小鼠子宫基质细胞48h后,CD82/KAI1蛋白有明显表达。②妊娠4d的小鼠子宫基质细胞中E-cadherin、β-catenin、α5、MMP-9均有表达,没有检测到β3的表达;对照组未妊娠小鼠细胞中均没有检测到E-cadherin、β-catenin、α5、MMP-9和β3的表达。③与导空腺病毒组相比,妊娠4d的小鼠子宫基质细胞感染CD82/KAI1腺病毒后,β-catenin和MMP-9表达显著上升(P<0.05),α5表达显著下降(P<0.05),E-cadherin的表达量没有显著变化(P>0.05),未检测到β3的表达。结论成功构建含小鼠CD82/KAI1全基因的重组腺病毒。胚胎植入前小鼠子宫基质细胞内整合素α5、MMP-9、E-cadherin和β-catenin的表达可能受CD82/KAI1的影响。 展开更多
关键词 CD82/KAI1基因 重组腺病毒 子宫基质细胞 原代培养
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miR-23b-3p调控脂蛋白(a)抑制同型半胱氨酸诱导的冠状动脉血管内皮细胞损伤 被引量：3
4
作者 马小峰 刘欢 +1 位作者 李招兵 谭剑凯 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第22期2074-2080,共7页
目的 探讨miR-23b-3p作为一种高效降低载脂蛋白（a）[apolipoprotein（a）,Apo（a）]的内源性miR,对高同型半胱氨酸引起的冠状动脉内皮细胞损伤抑制效果及作用机制。方法 通过生物信息学、miR芯片及基础实验筛选ETS1为靶基因,设计miR-23... 目的 探讨miR-23b-3p作为一种高效降低载脂蛋白（a）[apolipoprotein（a）,Apo（a）]的内源性miR,对高同型半胱氨酸引起的冠状动脉内皮细胞损伤抑制效果及作用机制。方法 通过生物信息学、miR芯片及基础实验筛选ETS1为靶基因,设计miR-23b-3p mimic/inhibitor。构建pmir GLOETS1 3＇-UTR质粒分6组转染人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells,HCAECs）,分别为A组（pmirGLO-ETS1 3＇-UTR转染）、B组（miR-23b-3p inhibitor＋pmir GLO-ETS1 3＇-UTR转染）、C组（miR-23b-3p minics＋pmirGLO-ETS13＇-UTR转染）、D组（pmirGLO-ETS13＇-UTR mut转染）、E组（miR-23b-3p minics＋pmirGLO-ETS13＇-UTR mut转染）和F组（miR-23b-3p inhibitor＋pmirGLO-ETS13＇-UTR mut转染）,经双荧光素酶报告基因实验验证。HCAECs分为：对照组（无干预）、阴性对照组（miR-23b-3p inhibitor转染）和实验组（miR-23b-3p mimic转染）。3组细胞均置于含1. 0 mmol/L同型半胱氨酸（homocysteine,hcy）培养基中培养7 d。检测各组HCAECs存活率、miR-23b-3p和Apo（a） mRNA表达、akt、p-akt和eNOS蛋白表达。结果 双荧光素酶报告基因实验验证miR-23b-3p能够和ETS13＇-UTR直接结合,可得ETS1是miR-23b-3p直接靶基因。实验组HCAECs存活率（66. 22±5. 17）%、阴性对照组（42. 12±2. 35）%和对照组（38. 36±2. 21）%均显著低于正常HCAECs（P 〈0. 01）,实验组HCAECs存活率显著高于阴性对照组和对照组（P 〈0. 01）。转染后,实验组miR-23b-3p mRNA表达显著高于阴性对照组和对照组（P 〈0. 01）,实验组Apo（a） mRNA表达显著低于阴性对照组和对照组（P 〈0. 01）。转染后,实验组p-akt表达和eNOS蛋白相对表达显著高于阴性对照组和对照组（P 〈0. 01）。结论 miR-23b-3p能够以ETS1为靶基因,可能通过akt/eNOS信号通路下调hcy诱导损伤的内皮细胞中Apo（a）表达,从而保护冠状动脉血管内皮细胞。 展开更多
关键词 miR-23b-3p 脂蛋白(a) 同型半胱氨酸 内皮细胞
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人乳腺癌细胞HYAL1基因真核表达载体的构建及其在MCF-7和ZR-75-30细胞中的表达 被引量：1
5
作者 苏新良 任国胜 +1 位作者 王小毅 谭金祥 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期146-149,共4页
目的构建人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体并稳定转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞株,为进一步探讨HYAL1基因在乳腺癌的侵袭和转移中的作用奠定基础。方法采用RT-PCR技术从高表达HYAL1的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S中扩... 目的构建人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体并稳定转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞株,为进一步探讨HYAL1基因在乳腺癌的侵袭和转移中的作用奠定基础。方法采用RT-PCR技术从高表达HYAL1的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S中扩增透明质酸酶HYLAL1基因,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,构建的重组表达质粒经脂质体介导转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞。结果用RT-PCR成功地扩增出1条1332bp的DNA片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序证明已经成功构建了人乳腺癌HY-AL1基因的真核表达载体。RT-PCR证明转染了重组质粒的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞可以高效稳定的表达HYAL1基因,且其穿透细胞外基质的能力增强。结论成功构建了人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体,获得了稳定表达人HYAL1基因的MCF-7和ZR-75-30细胞克隆,且其侵袭能力增强。 展开更多
关键词 透明质酸酶 HYAL1 真核表达 乳腺癌细胞 侵袭
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microRNA 26b-5p靶向下调p300对人脐带间充质干细胞的增殖作用
6
作者 李娅莎 杨珂 +5 位作者 朱静 毕杨 谭彬 田鹤锋 易勤 钟海英 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第16期1614-1618,共5页
目的探讨潜在microRNA靶向下调p300表达水平对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)增殖的影响。方法通过双荧光素酶报告基因(Firefly/Renilla Luciferase)系统筛选出作用于p300 3'... 目的探讨潜在microRNA靶向下调p300表达水平对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)增殖的影响。方法通过双荧光素酶报告基因(Firefly/Renilla Luciferase)系统筛选出作用于p300 3'UTR的目标microRNA,mimic转染UC-MSCs后RT-q PCR检测miRNA表达水平的变化,Western blot检测p300蛋白水平变化,RT-q PCR和Western blot检测多潜能转录因子表达水平的变化,MTT法检测UC-MSCs增殖能力的变化,并比较克隆形成能力的差异。结果证实mir 26b-5p通过不完全互补配对结合p300的3'UTR区,显著降低了荧光素酶的相对活性(P<0.05);mir 26b-5p mimic转染后抑制p300蛋白表达水平(P<0.05),并下调Nanog基因和蛋白表达水平(P<0.05);mir 26b-5p mimic转染后UC-MSCs的增殖受到抑制(P<0.05),克隆形成能力下降(P<0.05)。结论 UC-MSCs高表达mir 26b-5p能够显著抑制p300蛋白表达和干性相关基因Nanog的表达,并且抑制UC-MSCs的增殖能力和克隆形成能力。 展开更多
关键词 人脐带间充质干细胞 转录共激活因子p300 mir 26b-5p NANOG
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慢病毒介导shRNA沉默LAMP-2A和TSG101表达对PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)降解的影响
7
作者 王建东 刘腾 +3 位作者 张君莉 刘海耘 黄永秀 张红 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第14期1393-1399,共7页
目的采用慢病毒介导的shRNA干扰技术,下调PC12细胞中溶酶体相关膜蛋白-2A(lysosome-associated membrane protein type 2A,LAMP-2A)和肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene101,TSG101)的表达,并研究其对EGFP-α-synuclein(A53T)... 目的采用慢病毒介导的shRNA干扰技术,下调PC12细胞中溶酶体相关膜蛋白-2A(lysosome-associated membrane protein type 2A,LAMP-2A)和肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene101,TSG101)的表达,并研究其对EGFP-α-synuclein(A53T)降解的影响。方法以LAMP-2A和TSG101为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切的p HBLV-U6-Puro载体连接获得重组慢病毒载体;将其与病毒包装辅助质粒共感染293T细胞,收集并浓缩上清液获得重组病毒,测定病毒滴度;病毒颗粒转染PC12细胞,经嘌呤酶素筛选获得稳定感染细胞株;Western blot检测LAMP-2A和TSG101蛋白的表达;分别采用LAMP-2A shRNA2和TSG101 shRNA1下调PC12细胞中LAMP-2A和TSG101蛋白的表达,并结合巴佛洛霉素A1处理,研究其对PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP、α-synuclein(A53T)和LC3B蛋白的影响,免疫荧光检测各组PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)和LC3B蛋白的表达。结果成功构建干扰LAMP-2A和TSG101表达的慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒。重组病毒感染PC12细胞后,Western blot检测结果显示LAMP-2A shRNA2和TSG101 shRNA1干扰效果最好;下调LAMP-2A和TSG101蛋白表达均能够抑制细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP和α-synuclein(A53T)蛋白的降解(P<0.01),并提高LC3-Ⅱ蛋白的含量(P<0.01)。结论慢病毒介导的shRNA能有效地沉默PC12细胞中LAMP-2A和TSG101的表达,抑制细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)的降解。 展开更多
关键词 溶酶体相关膜蛋白-2A 肿瘤易感基因101 慢病毒 α-突触蛋白 PC12细胞
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过表达长链非编码RNA H19促进miR-124-3p表达抑制肝癌细胞增殖 被引量：12
8
作者 吕细林 黄刚 +5 位作者 肖曼 刘孟刚 陈玥琦 张楠 张艳 何凤田 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期554-559,共6页
目的探讨长链非编码RNA H19(long non-coding RNA H19,lncRNA H19)对miR-124-3p表达的影响及在肝癌细胞增殖中的作用。方法 Real-time PCR检测肝癌细胞系及临床标本中lncRNA H19和miR-124-3p的表达;在肝癌细胞系Hep G2和SMMC7721中过表... 目的探讨长链非编码RNA H19(long non-coding RNA H19,lncRNA H19)对miR-124-3p表达的影响及在肝癌细胞增殖中的作用。方法 Real-time PCR检测肝癌细胞系及临床标本中lncRNA H19和miR-124-3p的表达;在肝癌细胞系Hep G2和SMMC7721中过表达lncRNA H19,Real-time PCR检测miR-124-3p及其靶基因cyclin D1的表达;Western blot检测cyclin D1蛋白表达水平;CCK-8法检测lncRNA H19对细胞增殖的影响;过表达lncRNA H19同时加入antagomiR-124-3p后,检测miR-124-3p及其靶基因表达情况及细胞增殖情况。结果 lncRNA H19和miR-124-3p在肝癌细胞系及肝癌组织中均低表达(P<0.05);过表达lncRNA H19后miR-124-3p表达显著增加(P<0.05),miR-124-3p的靶基因cyclin D1蛋白和mRNA表达明显下降(P<0.05),细胞增殖受到抑制(P<0.05);过表达lncRNA H19同时干扰miR-124-3p后,细胞增殖抑制作用减弱(P<0.05)。结论长链非编码RNA H19通过促进miR-124-3p表达,进而抑制其靶基因cyclin D1表达而抑制肝癌细胞增殖。 展开更多
关键词 lncRNA H19 miR-124-3p CYCLIN D1 肝癌 细胞增殖
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腺病毒载体介导的siRNA对3T3-L1细胞脂联素表达的影响 被引量：5
9
作者 孟凡萍 杨刚毅 +4 位作者 李钶 李伶 齐晓亚 刘建雷 李荣 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第14期1312-1315,共4页
目的构建携带小鼠脂联素(Acrp30)siRNA腺病毒载体,并检测其对小鼠脂肪细胞Acrp30表达的影响。方法首先用KpnⅠ+NotⅠ双酶切本课题组前期构建的质粒pSilencer1.0-U6-Acrp30-1和pSilencer1.0-U6-Acrp30-3,得到目的片段U6-Acrp30-1和U6-Acr... 目的构建携带小鼠脂联素(Acrp30)siRNA腺病毒载体,并检测其对小鼠脂肪细胞Acrp30表达的影响。方法首先用KpnⅠ+NotⅠ双酶切本课题组前期构建的质粒pSilencer1.0-U6-Acrp30-1和pSilencer1.0-U6-Acrp30-3,得到目的片段U6-Acrp30-1和U6-Acrp30-3,并将目的片段亚克隆入穿梭质粒pShuttle,用PmeⅠ线性化穿梭质粒pShuttle-U6-Acrp30-1和pShuttle-U6-Acrp30-3,并与pAdeasy-1在BJ5183内同源重组,筛选、鉴定、测序后,在XL10-Gold中扩增重组腺病毒质粒,最后在293细胞内包装扩增为重组腺病毒Ad-Acrp30-1和Ad-Acrp30-3。用此重组腺病毒感染3T3-L1脂肪细胞,用RT-PCR和ELISA检测其Acrp30 mRNA和蛋白表达。结果设计并构建了小鼠Acrp30基因特异性siRNA腺病毒载体,该载体感染脂肪细胞后,能显著抑制其Acrp30 mRNA和蛋白表达。结论构建的Acrp30基因特异性siRNA腺病毒载体能有效的抑制脂联素基因在3T3-L1脂肪细胞中的表达。 展开更多
关键词 RNA干扰 腺病毒载体 脂联素 3T3-L1细胞
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miR-143通过抑制AF9调控SKM-1细胞增殖和凋亡 被引量：1
10
作者 崔佳奇 魏春梅 +1 位作者 邓琳丽 王利 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第20期1826-1832,共7页
目的探讨miR-143在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)中的表达情况及AF9对人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1增殖和凋亡的影响。方法利用实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测收集的33位MDS/AML患者以及11位健康人(健康对... 目的探讨miR-143在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)中的表达情况及AF9对人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1增殖和凋亡的影响。方法利用实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测收集的33位MDS/AML患者以及11位健康人(健康对照)的骨髓标本中miR-143的表达;细胞实验分为过表达组(SKM-1细胞感染含LV-hsa-miR-143的慢病毒载体)、低表达组(SKM-1细胞感染含LV-hsa-miR-143-inhibitors的慢病毒载体)和阴性对照组(SKM-1细胞感染含空病毒LV-control的慢病毒载体),分别采用CCK-8法、流式细胞仪检测各组SKM-1细胞增殖、周期和凋亡情况;双荧光素酶报告基因检测miR-143对下游靶基因AF9在转录水平的影响;Western blot测定miR-143对下游靶基因AF9蛋白表达水平的影响。结果与健康对照比较,MDS患者的miR-143相对表达水平明显降低(P <0. 05);过表达组的光密度值在第3天为(0. 562±0. 069),明显低于阴性对照组(P <0. 05);低表达组的光密度值在第3天为(1. 537±0. 094),明显高于阴性对照组(P <0. 05);过表达组G0/G1期细胞比例为(57. 92±3. 58)%,明显高于阴性对照组(P <0. 05);低表达组G0/G1期细胞比例为(29. 73±2. 44)%,明显低于阴性对照组(P <0. 05);过表达组细胞凋亡率为(29. 80±2. 53)%,明显高于阴性对照组(P <0. 05);而低表达组细胞凋亡率为(5. 17±1. 04)%,明显低于阴性对照组(P <0. 05);miR-143可以显著抑制AF9 3’-UTR野生型的报告基因活性;低表达组AF9蛋白表达水平显著高于阴性对照组(P <0. 05)。结论 miR-143在MDS患者中的相对表达水平明显减低;过表达miR-143后骨髓增生异常综合征SKM-1细胞增殖活性降低、G0/G1期细胞阻滞增多、凋亡率增加;同时miR-143能够负性调节其靶基因AF9。 展开更多
关键词 骨髓增生异常综合征 MIR-143 AF9 细胞凋亡 细胞周期
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SRSF1通过增加P53的稳定性抑制乙型肝炎病毒复制
11
作者 刘佳俊 龙少媛 +1 位作者 胡接力 崔静 《陆军军医大学学报》 北大核心 2025年第13期1475-1483,共9页
目的探究丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1,SRSF1)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响和机制。方法通过Southern blot、Northern blot、ELISA实验在不同的HBV复制细胞模型中检测SRSF1... 目的探究丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1,SRSF1)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响和机制。方法通过Southern blot、Northern blot、ELISA实验在不同的HBV复制细胞模型中检测SRSF1对HBV复制的影响;通过荧光定量PCR实验、荧光素酶报告系统以及ChIP实验在HepG2细胞中研究SRSF1对HBV核心启动子/增强子活性的影响。利用Western blot和泛素化检测实验探索SRSF1与P53的关系,同时在不同的HBV复制细胞模型中验证P53对HBV复制的影响,之后明确P53在SRSF1抑制HBV中的作用。结果过表达SRSF1可以在多种HBV复制细胞模型中显著抑制HBV DNA和HBV RNA,降低HBeAg和HBsAg的分泌水平(P<0.0001)。SRSF1还可以抑制HBV核心启动子活性,尽管这种抑制是通过间接机制调控的。此外,SRSF1通过保护P53免受泛素化和随后的蛋白酶体降解从而增强P53的稳定性。同时,过表达P53或敲低P53对HBV的调控作用也在不同的细胞模型中得到了验证(P<0.0001)。结论剪接因子SRSF1的过表达可以显著抑制HBV的复制,且该抑制效应在多种肝癌细胞模型中均有重现性,这一抑制效应由其增强P53的稳定性来介导。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 复制 SRSF1 P53 SR蛋白
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GasderminA3基因在小鼠皮肤上皮中对NF-κB表达的影响
12
作者 余裕 白秀峰 +2 位作者 赖向东 杨恬 连小华 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期313-316,共4页
目的探讨Gasdermin A3(简写为Gsdma3)基因在小鼠皮肤上皮中对NF-κB表达的影响。方法通过组织切片与免疫荧光观察Gasdermin A3突变鼠与正常鼠背部皮肤中NF-κB蛋白的阳性表达区域与强弱情况;免疫荧光观察转染Gsdma3质粒后,小鼠皮肤细胞... 目的探讨Gasdermin A3(简写为Gsdma3)基因在小鼠皮肤上皮中对NF-κB表达的影响。方法通过组织切片与免疫荧光观察Gasdermin A3突变鼠与正常鼠背部皮肤中NF-κB蛋白的阳性表达区域与强弱情况;免疫荧光观察转染Gsdma3质粒后,小鼠皮肤细胞中Gsdma3与NF-κB蛋白的表达情况;RT-PCR检测Gsdma3基因突变或过表达的情况下,在体或离体小鼠皮肤上皮细胞中NF-κB mRNA的表达变化情况;Western blot检测Gsdma3基因突变或过表达的情况下,在体或离体小鼠皮肤上皮细胞中NF-κB蛋白的表达变化情况。结果在小鼠皮肤上皮细胞中,Gsdma3基因突变导致小鼠皮肤上皮细胞中NF-κB mRNA表达平均降低39.53%,(P<0.01),蛋白表达平均降低65.03%(P<0.01),免疫荧光检测NF-κB阳性表达在Gsdma3突变的皮肤上皮中明显减弱;Gsdma3的过表达导致小鼠皮肤上皮细胞中NF-κB mRNA表达平均增强56.25%(P<0.01),蛋白表达平均增强199.6%(P<0.01),免疫荧光检测NF-κB阳性表达在过表达Gsdma3的皮肤上皮细胞中明显增强。结论在小鼠皮肤上皮中,Gsdma3能促进NF-κB的表达。 展开更多
关键词 Gasdermin A3 NF-ΚB 小鼠 皮肤上皮细胞
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miR-378对骨髓增生异常综合征细胞凋亡及增殖的影响
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作者 匡兴怡 魏春梅 +1 位作者 张涛 王利 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期604-608,共5页
目的研究miR-378对骨髓增生异常综合征SKM-1细胞凋亡和增殖的影响。方法我们分别用miR-378重组慢病毒和阴性对照病毒感染SKM-1细胞。然后采用CCK-8检测miR-378对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞仪检测各实验组细胞凋亡和周期情况,并用West... 目的研究miR-378对骨髓增生异常综合征SKM-1细胞凋亡和增殖的影响。方法我们分别用miR-378重组慢病毒和阴性对照病毒感染SKM-1细胞。然后采用CCK-8检测miR-378对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞仪检测各实验组细胞凋亡和周期情况,并用Western blot检测凋亡过程中的关键因子cleaved-caspase-3蛋白的表达。用生物信息学方法预测miR-378可能的靶基因,用PCR和Western blot进行初步验证。结果 miR-378慢病毒转染组的细胞增殖活性明显降低,流式细胞术检测miR-378组的细胞凋亡率为(12.90±3.72)%,明显高于阴性对照病毒转染组和空白对照组[(3.21±1.91)%、(2.78±1.04)%,P<0.01];miR-378组的G0/G1期细胞增多,S期细胞减少。同时,Western blot结果显示miR-378过表达引起了cleaved-caspase-3的表达升高。用生物信息学方法预测抗凋亡蛋白基因BCL2L2为miR-378潜在的靶基因,并发现miR-378可以抑制BCL2L2蛋白的表达。结论 miR-378可以通过引起细胞凋亡和细胞周期阻滞来抑制SKM-1细胞的增殖,并降低BCL2L2蛋白的表达。 展开更多
关键词 骨髓增生异常综合征 miR-378 细胞凋亡 BCL2L2
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miR-409-3p靶向ZEB1负性调控卵巢浆液性癌HO-8910细胞上皮间质转化 被引量：3
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作者 朱静 张龙辉 谢荣凯 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期455-460,共6页
目的探讨miR-409-3p靶向ZEB1对卵巢浆液性癌HO-8910细胞上皮间质转化的影响及作用机制。方法利用脂质体分别将对照mimics和miR-409-3p mimics转染入HO-8910细胞中,qRT-PCR检测其转染效率,Western blot检测各组细胞中ZEB1、E-cadherin、N... 目的探讨miR-409-3p靶向ZEB1对卵巢浆液性癌HO-8910细胞上皮间质转化的影响及作用机制。方法利用脂质体分别将对照mimics和miR-409-3p mimics转染入HO-8910细胞中,qRT-PCR检测其转染效率,Western blot检测各组细胞中ZEB1、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-409-3p与ZEB1之间的靶向调控作用,Transwell侵袭和迁移实验分别各组细胞的侵袭和迁移能力变化。结果与mimics对照组相比,miR-409-3p过表达组中miR-409-3p表达显著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著增加(P<0.05),ZEB1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显减少(P<0.05),上皮间质转化进程被阻断。双荧光素酶报告基因实验结果显示ZEB1是miR-409-3p的直接作用靶点,过表达ZEB1可逆转转染miR-409-3p mimics介导的对细胞侵袭、迁移及上皮间质转化的抑制作用(P<0.05)。结论过表达miR-409-3p通过抑制ZEB1蛋白表达,负性调控卵巢浆液性癌HO-8910细胞上皮间质转化,抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。 展开更多
关键词 miR-409-3p 卵巢浆液性癌 侵袭和转移 上皮间质转化
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PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法 被引量：41
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作者 胡晓红 彭惠民 +2 位作者 刘昕 黄正根 袁科 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2008年第2期155-158,共4页
目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法。方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100+NP40、Chelex-100+TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提... 目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法。方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100+NP40、Chelex-100+TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度。结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100+NP40法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度。结论:Chelex-100+NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR。 展开更多
关键词 DNA提取 PCR 实时荧光定量PCR
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河南汉族人群16个Y-STR基因座遗传多态性 被引量：7
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作者 郭利红 田曾元 +3 位作者 刘亚举 刘海 李效阳 张毅 《法医学杂志》 CAS CSCD 2010年第1期66-67,共2页
采集208名河南汉族无关男性个体的血样，用Chelex一100法提取。采用Yfiler试剂盒（美国AB公司）对16个Y—STR基因座进行PCR扩增。PCR产物在3130XL型遗传分析仪（美国AB公司）上进行毛细管电泳．GeneMapperIDv3．2软件进行基因分型。等... 采集208名河南汉族无关男性个体的血样，用Chelex一100法提取。采用Yfiler试剂盒（美国AB公司）对16个Y—STR基因座进行PCR扩增。PCR产物在3130XL型遗传分析仪（美国AB公司）上进行毛细管电泳．GeneMapperIDv3．2软件进行基因分型。等位基因频率用直接计数法。 展开更多
关键词 法医遗传学 多态现象 遗传 Y—STR 汉族 河南
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miR-29通过ITGB1抑制胃癌侵袭、转移的分子机制 被引量：11
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作者 何兵 余松涛 +3 位作者 吕沐瀚 吴玉云 胡长江 杨仕明 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1037-1042,共6页
目的观察miR-29对胃癌细胞体外侵袭力的影响,探讨miR-29通过ITGB1调节胃癌侵袭和转移的具体机制。方法通过基因芯片筛选胃癌与癌旁组织中差异性表达的miRNA;采用生物信息学预测ITGB1调控相关miRNA,通过比对上述2个结果,筛选出miR-29;进... 目的观察miR-29对胃癌细胞体外侵袭力的影响,探讨miR-29通过ITGB1调节胃癌侵袭和转移的具体机制。方法通过基因芯片筛选胃癌与癌旁组织中差异性表达的miRNA;采用生物信息学预测ITGB1调控相关miRNA,通过比对上述2个结果,筛选出miR-29;进一步以miR-29慢病毒及miR-29mimics过表达miR-29后,用Western blot检测胃癌细胞中ITGB1的表达变化;采用双荧光素酶实验分析miR-29与ITGB1的作用机制;采用Transwell侵袭实验及划痕实验检测miR-29慢病毒感染后细胞体外侵袭能力的变化;qRT-PCR检测60例胃癌患者癌组织和癌旁组织中miR-29的表达差异,并分析miR-29的表达与肝癌患者临床病理之间的关系。结果基因芯片及生物信息学预测发现miR-29在胃癌组织里高表达,同时又可能调控ITGB1;双荧光素酶实验证实miR-29可以结合在ITGB13'UTR,miR-29慢病毒及miR-29mimics过表达miR-29都能在蛋白水平下调ITGB1;qRT-PCR结果显示miR-29家族3条miRNA在胃癌组织中的相对含量均低于癌旁组织[miR-29a:癌旁(32.01±10.38),癌(14.16±6.25);miR-29b:癌旁(26.95±5.05),癌(9.82±1.86);miR-29c:癌旁(53.56±8.05),癌(16.79±1.97),P<0.01];进一步统计学分析表明,miR-29a与淋巴结转移有关(P<0.05),miR-29b在具有远处转移的病例组织中C/P比值较无远处转移的病例组织明显降低(P<0.05)。结论miR-29可以在转录后水平调控ITGB1的表达,从而抑制胃癌细胞的侵袭和转移。 展开更多
关键词 ITGB1 MIR-29 胃肿瘤 肿瘤转移
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5-aza诱导干细胞经乙酰化特异RNAi后心肌细胞发育相关基因检测 被引量：8
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作者 朱静 邓兵 +2 位作者 王金菊 田杰 王应雄 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期535-538,共4页
目的通过组蛋白乙酰化作用相关shRNA质粒转染5氮杂胞苷(5-azacytid ine,5-aza)诱导后不同时间段间充质干细胞心肌发育基因的检测,探讨乙酰化修饰在干细胞特化心肌样细胞转录调控中的作用。方法选择7条组蛋白乙酰化修饰关键因子Gcn5基因... 目的通过组蛋白乙酰化作用相关shRNA质粒转染5氮杂胞苷(5-azacytid ine,5-aza)诱导后不同时间段间充质干细胞心肌发育基因的检测,探讨乙酰化修饰在干细胞特化心肌样细胞转录调控中的作用。方法选择7条组蛋白乙酰化修饰关键因子Gcn5基因片段,用带有绿色荧光蛋白(green fluorescence prote in,GFP)基因的pGenesil-1作为载体,构建相应7个shRNA质粒。5-aza诱导大鼠间充质干细胞(m esenchym al stem cells,MSCs)24 h、2、4、7 d,分别用重组shRNA质粒脂质体共转染后提取RNA,逆转录PCR检测Gcn5基因和心肌早期发育基因GATA4的表达。结果经特异性限制性内切酶酶切分析和DNA序列测定,质粒构建与设计符合;各个时间段对照组Gcn5和GATA4均有表达,而实验组却无相应表达。结论通过实验提示封阻干细胞染色质组蛋白乙酰化可以达到抑制干细胞特化心肌细胞转录过程的作用,这为进一步研究组蛋白末端乙酰化修饰与干细胞分化调节机制奠定实验室基础。 展开更多
关键词 间充质干细胞 心肌细胞 乙酰化修饰 RNA干扰
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抗菌肽PR39真核表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达和抗菌作用 被引量：6
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作者 文阳安 郭金英 +5 位作者 余晓林 岑东 陈彦 张键 罗淼 涂植光 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第21期2044-2046,共3页
目的构建抗菌肽PR39的真核表达载体,转染后观察PR39在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及抗菌作用。方法采用拼接PCR法合成抗菌肽PR39基因,克隆到真核表达载体pIRES2-GFP中,经鉴定后用阳离子脂质体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过RT-PCR和... 目的构建抗菌肽PR39的真核表达载体,转染后观察PR39在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及抗菌作用。方法采用拼接PCR法合成抗菌肽PR39基因,克隆到真核表达载体pIRES2-GFP中,经鉴定后用阳离子脂质体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过RT-PCR和免疫荧光法检测目的基因的表达,并对其抗菌活性进行初步检测。结果成功构建了抗菌肽PR39的真核表达载体pIRES2-GFP/PR39,并能在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达抗菌肽PR39。表达抗菌肽PR39的巨噬细胞杀灭和清除胞内菌的能力明显增强。结论抗菌肽PR39基因能够在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达并发挥抗菌作用。 展开更多
关键词 抗菌肽 PR39 真核表达载体 巨噬细胞 胞内菌
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特异性ILK-siRNA对膀胱癌EJ细胞侵袭和迁移的影响 被引量：6
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作者 朱军 高娟 +2 位作者 李红彦 潘湘阳 陈俊霞 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期360-364,共5页
目的设计合成有效的ILK-siRNA,并检测其对EJ细胞侵袭和迁移的影响。方法构建针对ILK基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体pGenSil-1 siRNA1、pGensil-1 siRNA2和1个阴性对照载体pGenSil-1 siRNA3。稳定转染膀胱癌EJ细胞后,通过RT-PCR检测E... 目的设计合成有效的ILK-siRNA,并检测其对EJ细胞侵袭和迁移的影响。方法构建针对ILK基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体pGenSil-1 siRNA1、pGensil-1 siRNA2和1个阴性对照载体pGenSil-1 siRNA3。稳定转染膀胱癌EJ细胞后,通过RT-PCR检测EJ细胞中ILK mRNA水平的表达,并通过Western blot和细胞免疫荧光检测ILK蛋白水平的表达;观察EJ细胞形态变化;检测EJ细胞迁移、黏附和侵袭能力及基质金属蛋白酶的变化。结果重组质粒构建成功。干扰组细胞ILK mRNA及蛋白的表达分别较3个对照组(未转染组、转空质粒组和转阴性对照质粒组)比较,呈显著性下降(P<0.05);HE染色结果显示,细胞铺展良好,核质比减小;转染干扰质粒的2个实验组细胞的黏附能力相对于对照组分别增加87%和76%,黏附能力显著升高,迁移及侵袭能力明显降低(P<0.05);与3个对照组比较,转染pGenSil-1 siRNA1与pGensil-1 siRNA2质粒到EJ细胞后,MMP-2及MMP-9的表达水平明显降低(P<0.05)。结论成功构建的干扰质粒能抑制ILK基因及蛋白水平的表达,显著抑制细胞的生长、侵袭及迁移能力。 展开更多
关键词 RNA 小分子干扰 膀胱肿瘤 细胞系 肿瘤 侵袭 迁移 整合素连接激酶
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