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携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义 被引量:5
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作者 章涛 杨贵忠 +4 位作者 袁野 李苌清 万敬员 蒋建新 周岐新 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期413-417,共5页
目的构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αhPPARα)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARα受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,... 目的构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αhPPARα)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARα受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRES2-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα基因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论成功构建重组质粒phPPARα-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。 展开更多
关键词 过氧化物酶体增殖物激活受体Α 基因克隆 真核表达
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高糖对人肾系膜细胞GSH-PX和PDGF-B表达影响及茶多酚干预作用 被引量:2
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作者 王筠 邓红 +1 位作者 曾玉 苏宁 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期476-479,共4页
目的探讨高糖条件下系膜细胞氧化失衡与血小板源性生长因子B(PDGFB)表达之间的关系,通过抗氧化剂茶多酚证实氧化应激在早期糖尿病中的作用。方法将培养的系膜细胞分为正常对照组、高糖组、茶多酚对照组和茶多酚干预组,分别在0、12、24... 目的探讨高糖条件下系膜细胞氧化失衡与血小板源性生长因子B(PDGFB)表达之间的关系,通过抗氧化剂茶多酚证实氧化应激在早期糖尿病中的作用。方法将培养的系膜细胞分为正常对照组、高糖组、茶多酚对照组和茶多酚干预组,分别在0、12、24、36、48h采用分光光度法检测上清液还原型谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)活性,以及免疫细胞化学法和RTPCR法检测0、12、36h的PDGFBmRNA和蛋白的表达情况。结果①高糖条件下GSHPX活性下降,抗氧化能力下降,氧化失平衡;茶多酚可增加抗氧化酶GSHPX的活性。②高糖组系膜细胞PDGFBmRNA和蛋白的表达比正常对照组均增加(P<0.05);茶多酚干预组比高糖组有明显下降(P<0.05)。结论高糖能促进系膜细胞活性氧和PDGFB的表达增加,茶多酚可抑制该作用。 展开更多
关键词 高糖 茶多酚 人肾系膜细胞 还原型谷胱甘肽过氧化物酶 血小板源性生长因子—B
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中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶表达、纯化及活性特征 被引量:1
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作者 廖剑 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期781-786,共6页
目的:将编码青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)的基因克隆于原核表达载体,并通过表达获得重组的TPx蛋白。方法:将已获得的TPxcDNA片段克隆于原核表达载体pET-32a(+)M,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组表达质粒pET-32a(+)M-TPx。37℃下... 目的:将编码青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)的基因克隆于原核表达载体,并通过表达获得重组的TPx蛋白。方法:将已获得的TPxcDNA片段克隆于原核表达载体pET-32a(+)M,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组表达质粒pET-32a(+)M-TPx。37℃下经IPTG诱导,该融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。获得的重组TPx蛋白再经过纯化,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白。并对重组蛋白进行活性鉴定和结构分析。结果:构建的重组质粒pET-32a(+)M-TPx在大肠杆菌中高效表达,经纯化后的重组TPx蛋白纯度可达90%以上,其单体相对分子质量为24460。重组TPx蛋白是以同源二聚体和单体混合的形式存在,在二硫苏糖醇(DTT)存在时具有还原H2O2活性和对超螺旋DNA或对硫醇基敏感蛋白的保护作用。结论:本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了重组TPx蛋白,并且证实其活性与其高级结构紧密相关。 展开更多
关键词 硫氧还蛋白过氧化物酶 青岛文昌鱼 原核表达 蛋白质纯化 酶活性 结构
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甲状腺过氧化物酶mRNA cRNA探针的构建及意义
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作者 陈云 朱明华 +1 位作者 周晓军 倪灿荣 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期584-588,共5页
目的探讨甲状腺过氧化物酶(thyroperoxidase,TPO)mRNA cRNA探针的构建及原位表达的检测方法和意义。方法取甲状腺结节新鲜组织,在RT-PCR扩增TPO cDNA的基础上,构建pSPT19-TPO质粒,经HindⅢ和BamHⅠ单酶切后成线性化模板,在SP6和T7 RNA... 目的探讨甲状腺过氧化物酶(thyroperoxidase,TPO)mRNA cRNA探针的构建及原位表达的检测方法和意义。方法取甲状腺结节新鲜组织,在RT-PCR扩增TPO cDNA的基础上,构建pSPT19-TPO质粒,经HindⅢ和BamHⅠ单酶切后成线性化模板,在SP6和T7 RNA聚合酶作用下,体外转录合成地高辛标记的TPO cRNA反义和正义探针,进行TPO mRNA的原位杂交实验。结果TPO mRNA阳性杂交信号分布于甲状腺滤泡细胞的胞质,本组腺瘤2例、结节性甲状腺肿4例、瘤周甲状腺组织1例原位杂交阳性,乳头状癌2例、桥本病1例原位杂交阴性。核酸原位杂交和RT-PCR检测甲状腺组织TPO mRNA的表达,结果一致。结论成功构建甲状腺过氧化物酶mRNA的cRNA探针;检测TPO mRNA是一种较准确反映甲状腺组织TPO状态的方法,TPO mRNA的原位检测可结合组织形态学了解甲状腺滤泡细胞的功能表达状况。 展开更多
关键词 甲状腺过氧化物酶 甲状腺 CRNA探针 原位杂交
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过氧化物酶体增殖物激活受体与心肌缺血再灌注损伤的关系
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作者 王东 杨兴易 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1312-1313,共2页
关键词 过氧化物酶体增殖物激活受体 心肺复苏术 再灌注损伤
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脂多糖下调过氧化物酶增殖体激活受体γ在大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的表达 被引量:3
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作者 肖波 王建春 +3 位作者 王关嵩 邓朝霞 徐静 钱桂生 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第20期1960-1963,共4页
目的观察脂多糖(lipopolysac charide,LPS)作用下大鼠肺泡Ⅱ型上皮(typeⅡalveol arepith elial,AT-Ⅱ)细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)的表达变化情况。方法通过酶消化分离和免疫黏附法纯化原代培养AT-Ⅱ细胞,并进行碱性磷酸... 目的观察脂多糖(lipopolysac charide,LPS)作用下大鼠肺泡Ⅱ型上皮(typeⅡalveol arepith elial,AT-Ⅱ)细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)的表达变化情况。方法通过酶消化分离和免疫黏附法纯化原代培养AT-Ⅱ细胞,并进行碱性磷酸酶、肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)和电镜鉴定。采用RT-PCR法检测细胞经LPS作用后PPARγ、TNF-α、SP-AmRNA的改变,Westernblot法检测LPS作用后细胞PPARγ表达,ELISA法检测TNF-α蛋白表达。结果经碱性磷酸酶、SP-A和电镜鉴定,原代培养AT-Ⅱ细胞成功;在致炎因子LPS作用下,PPARγmRNA和蛋白表达均下降,这一变化伴随炎性因子TNF-α的升高。结论在LPS作用下,AT-Ⅱ细胞内PPARγ表达降低,提示PPARγ参与炎症反应。 展开更多
关键词 过氧化物酶增殖体激活受体Γ 肺泡Ⅱ型上皮细胞 炎症
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蛇莓提取物通过GPX4诱导铁死亡抑制肾癌细胞OS-RC-2增殖 被引量:2
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作者 游赣花 安群英 +5 位作者 何娟 李凯 杨萌 文周 钱城 朱建国 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期662-670,共9页
目的探讨蛇莓醇提物通过铁死亡抑制肾癌细胞OS-RC-2增殖的作用机制。方法蛇莓醇提物给药,CCK-8试验检测细胞增殖;活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒、GSH试剂盒、MDA试剂盒、细胞凋亡试剂盒分别检测细胞ROS、GSH、MDA含量... 目的探讨蛇莓醇提物通过铁死亡抑制肾癌细胞OS-RC-2增殖的作用机制。方法蛇莓醇提物给药,CCK-8试验检测细胞增殖;活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒、GSH试剂盒、MDA试剂盒、细胞凋亡试剂盒分别检测细胞ROS、GSH、MDA含量及凋亡水平;网络药理学分析蛇莓成分-靶点;分子对接检测蛇莓成分与铁死亡核心靶点GPX4的结合能力;Western blot对铁死亡信号通路关键蛋白进行检测;利用铁死亡的抑制剂Fer-1和ROS抑制剂NAC进行回复试验,检测细胞增殖及铁死亡蛋白的变化;蛇莓醇提物中的Dulcitol(卫矛醇)给药,检测细胞增殖及GPX4蛋白的变化。结果蛇莓可在一定程度上呈时间-浓度依赖性抑制细胞增殖,显著增加ROS、MDA水平而降低GSH水平;流式细胞术显示蛇莓可显著促进细胞凋亡,但并没有呈浓度依赖方式;网络药理学和分子对接结果显示蛇莓中的卫矛醇与GPX4结合稳定(-6.5 kJ·mol^(-1));Western blot结果显示蛇莓明显降低GPX4、SLC7A11并升高HO-1及Transferrin蛋白水平;回复试验结果显示,Fer-1与蛇莓联合给药、NAC与蛇莓联合给药均可显著逆转蛇莓单独给药引起的细胞活力降低和铁死亡关键蛋白GPX4、SLC7A11、HO-1及Transferrin的蛋白水平变化。卫矛醇给药可抑制OS-RC-2细胞增殖并降低GPX4蛋白表达水平。结论综上所述,蛇莓醇提物可能通过降低GPX4的表达,促使肾癌细胞发生增殖抑制及ROS积累,进一步驱动细胞铁死亡,且卫矛醇可能是蛇莓中潜在的直接作用于GPX4的药效物质。 展开更多
关键词 蛇莓 卫矛醇 OS-RC-2细胞 谷胱甘肽过氧化物酶4 活性氧 铁死亡
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