人端粒相关蛋白T-STAR的克隆及其与端粒酶催化亚单位hTERT的相互作用研究 被引量：1

1

作者 周平 房殿春 +4 位作者 毛高平 张启杰 曹传平 步晓华 刘为纹 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期546-548,共3页

目的克隆人端粒相关蛋白T-STAR并研究其与端粒酶催化亚单位hTERT在哺乳细胞内的相互作用。方法构建表达载体pGBKT7-hTERT,以pGBKT7-hTERT为诱饵,采用酵母双杂交技术进行cDNA文库筛选;构建pVP16-T-STAR和pMhTERT重组载体,脂质体法将其与... 目的克隆人端粒相关蛋白T-STAR并研究其与端粒酶催化亚单位hTERT在哺乳细胞内的相互作用。方法构建表达载体pGBKT7-hTERT,以pGBKT7-hTERT为诱饵,采用酵母双杂交技术进行cDNA文库筛选;构建pVP16-T-STAR和pMhTERT重组载体,脂质体法将其与报告质粒共转染入胃腺癌细胞株SGC-7901,以pM-53＋pVP16-T、pM3-VP16为阳性对照,以pM53＋pVP16-CP为阴性对照;以pM-hTERT＋pVP16、pM＋pVP16-T-STAR、pM＋pVP16为交叉阴性对照。ELISA法检测报告基因CAT的表达。结果成功构建真核表达载体pGBKT7-hTERT,将获得的阳性克隆测序,并进行同源性比较证实为是已收录的人cDNA序列T-STAR。pGBKT7-hTERT和pVP16-T-STAR共转染之后,报告基因CAT的表达（A值为0.258）显著高于阴性对照（A值为0.002~0.015）。结论T-STAR与hTERT在胃癌细胞内发生了相互作用,T-STAR可能是人端粒相关蛋白新成员,通过hTER参与端粒酶活性的调控。 展开更多

关键词 端粒 末端转移酶 端粒结合蛋白质类 双杂交系统技术

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HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化

2

作者 宋银宏 刘燕 +4 位作者 牛力 翁秀芳 孙伟 于倩 吴雄文 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期305-310,共6页

目的构建HLA-DR1(由DRA和DRB1*01基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达。方法采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为D... 目的构建HLA-DR1(由DRA和DRB1*01基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达。方法采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoRⅠ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体。分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc]。对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Westernblot检测HLA-DR1的表达。结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致。ELISA和Westernblot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象。结论成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础。 展开更多

关键词 HLA-DR1 二聚体 杆状病毒载体 昆虫细胞 基因表达

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肿瘤抑制基因XAF1启动子序列中活性IRF-1作用元件的鉴定 被引量：1

3

作者 师雷锋 高春芳 +1 位作者 徐迪辉 王继德 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期388-390,共3页

目的在XAF1的转录起始序列中鉴定一具有高度活性的IRF-1作用元件。方法通过生物信息学分析发现XAF1转录起始处(-30^-38nt)有一潜在的干扰素(IFN)调节因子1结合元件(IRF-E),与同义IRF-E序列同源性达76.2%,命名为IRFE-XAF1。应用凝胶电泳... 目的在XAF1的转录起始序列中鉴定一具有高度活性的IRF-1作用元件。方法通过生物信息学分析发现XAF1转录起始处(-30^-38nt)有一潜在的干扰素(IFN)调节因子1结合元件(IRF-E),与同义IRF-E序列同源性达76.2%,命名为IRFE-XAF1。应用凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测IRFE-XAF1的核蛋白结合活性,并分别定点突变其核心序列内-34nt和序列旁-28nt,检测突变后XAF1启动子活性变化及对IFN-α作用的影响。结果EMSA实验发现32P标记的含IRFE-XAF1的双链寡核苷酸DNA探针可与细胞核蛋白结合,且可被IRF-E同义探针阻断,定点突变后结合活性丧失,证实该IRFE-XAF1位点具有与转录因子结合的活性。含该IRFE-XAF1位点的XAF1启动子序列具有启动子活性且可被IFN-α诱导,IRFE-XAF1序列定点突变后启动子活性明显降低,其中-34nt突变后完全消除了IFN-α上调启动子活性的作用。结论XAF1的转录起始序列具有一高度活性的IRF-E,其序列为-38ntGAAACGAAA-30nt,这一发现提示XAF1是IFN-α诱导肿瘤细胞分化的作用基因。 展开更多

关键词 XAF1 干扰素调节因子-1 点突变

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HT29细胞黏着斑激酶表达与其对5-氟尿嘧啶敏感性的关系研究 被引量：5

4

作者 陈玉英 杨黎 +1 位作者 潘凤 梁后杰 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期421-424,共4页

目的构建人结肠癌细胞株HT29的RNA干扰(RNAi)表达载体以抑制黏着斑激酶(FAK),检测FAK沉默后细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的变化。方法利用针对FAK基因的特异性寡核苷酸序列及对照序列构建重组体,酶切并测序鉴定,用脂质体2000转染细胞,G... 目的构建人结肠癌细胞株HT29的RNA干扰(RNAi)表达载体以抑制黏着斑激酶(FAK),检测FAK沉默后细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的变化。方法利用针对FAK基因的特异性寡核苷酸序列及对照序列构建重组体,酶切并测序鉴定,用脂质体2000转染细胞,G418筛选。采用RT-PCR和免疫组化检测干扰前后细胞内FAK的表达变化,MTT法检测细胞对5-FU敏感性的变化。结果酶切鉴定和测序证实插入序列完全正确。靶向FAK干扰后,免疫组化显示FAK蛋白表达显著降低,RT-PCR显示FAKmRNA的表达下调了76.94%,MTT显示HT29细胞对5-FU敏感性较其他组显著提高,IC50值明显下降(P<0.05)。结论成功构建靶向FAK的RNAi载体并有效抑制了FAK的表达,后者显著提高了HT29细胞对5-FU的敏感性,为寻求新的基因治疗方法提供了可能。 展开更多

关键词 黏着斑激酶 RNA干扰 结肠肿瘤 基因表达

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原发性肝细胞癌与癌旁组织中TRPC6表达的研究 被引量：4

5

作者 孙宏伟 沈锋 +4 位作者 王以政 赵义军 张诗琳 李成林 崔彦 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期115-115,共1页

关键词 钙通道 肝肿瘤 基因表达

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短发夹RNA干扰黏着斑激酶对结肠癌多细胞球氟尿嘧啶敏感性的影响 被引量：2

6

作者 陈玉英 潘凤 +4 位作者 杨黎 向浏欣 蒋金妍 陈克力 梁后杰 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期286-289,共4页

目的探讨抑制黏着斑激酶(FAK)在结肠癌HT29细胞中的表达能否提高HT29多细胞球对氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性。方法构建带有短发夹RNA(shRNA)靶向干扰FAK的重组体pGenesil-l-FAK,抑制FAK在HT29中的表达,采用实时定量PCR和Western blotting检... 目的探讨抑制黏着斑激酶(FAK)在结肠癌HT29细胞中的表达能否提高HT29多细胞球对氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性。方法构建带有短发夹RNA(shRNA)靶向干扰FAK的重组体pGenesil-l-FAK,抑制FAK在HT29中的表达,采用实时定量PCR和Western blotting检测其在单层细胞和多细胞球中的干扰效率。采用血球计数板计数法检测多细胞球在各时间点的增殖速度,流式细胞术检测干扰对5-FU诱导的多细胞球凋亡的影响,CCK-8法检测单层细胞和多细胞球对5-FU的敏感性的变化。结果用重组体pGenesil-l-FAK靶向干扰FAK能显著抑制单层细胞FAKmRNA,并能抑制单层细胞和多细胞球FAK蛋白的表达。多细胞球的增殖速度并不受FAKshRNA干扰的影响,各组间在各时间点均无显著性差异(P>0·05)。流式细胞术结果显示,FAKshR-NA干扰能够使多细胞球的自发凋亡率(16·48%±1·18%)和5-FU诱导的凋亡率(21·50%±2·62%)显著增加(P=0·000、P=0·001),且两者之间差异显著(P=0·003)。CCK-8法检测结果显示,FAKshRNA干扰提高了单层细胞和多细胞球对5-FU的敏感性,且两者无显著差异(P>0·05),从而逆转了因三维球体结构产生的多细胞耐药性。结论FAK靶向RNA干扰虽不影响多细胞球的增殖,但能促进多细胞球凋亡,并增加多细胞球对5-FU的敏感性;FAK可能介导了结肠癌的多细胞耐药。 展开更多

关键词 球形体 细胞 黏着斑激酶 RNA干扰 结肠肿瘤 基因表达 药物筛选试验 抗肿瘤

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乙型肝炎病毒DNA多聚酶RNase H对细胞凋亡易感基因表达的上调作用 被引量：2

7

作者 纪冬 臧红 +3 位作者 陈国凤 刘妍 徐东平 张健 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期45-47,共3页

目的探讨乙型肝炎病毒DNA多聚酶(HBV DNA P)结构域蛋白RNase H对细胞凋亡易感基因(CAS)的转录激活作用。方法以HBV DNA P结构域蛋白RNase H的反式调节因子的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定CAS的启动子区域(CASp),扩增... 目的探讨乙型肝炎病毒DNA多聚酶(HBV DNA P)结构域蛋白RNase H对细胞凋亡易感基因(CAS)的转录激活作用。方法以HBV DNA P结构域蛋白RNase H的反式调节因子的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定CAS的启动子区域(CASp),扩增CASp并克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-CASp报告载体。分别以该质粒单独或与pcDNA3.1(-)-RH共转染肝癌细胞系HepG2细胞,ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,并以pCAT3-Basic空载体、pCAT3-TXNRD1p分别转染HepG2细胞作为阴性和阳性对照。结果pCAT3-CASp和pcDNA3.1(-)-RH瞬时共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-CASp的1.5倍,是pCAT3-Basic空载体的2.7倍。结论本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究RNase H蛋白反式激活作用的结果。我室克隆的CAS启动子具有顺式激活下游基因的活性;HBV的RNase H蛋白具有对CAS的反式激活作用。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 启动区 反式激活 细胞凋亡易感基因

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胃癌细胞株hTERT基因启动子区甲基化分析 被引量：3

8

作者 程永波 房殿春 +1 位作者 杨海捷 罗元辉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期187-189,共3页

目的检测人端粒酶反转录酶(hTERT)基因启动子区甲基化状态。方法采用TRAP法检测细胞端粒酶活性,免疫荧光法观察hTERT表达;选择hTERT启动子中-692～-403bp共290bp为靶序列,采取亚硫酸氢钠修饰和测序法(BSP)检测2种胃癌细胞株中靶序列甲... 目的检测人端粒酶反转录酶(hTERT)基因启动子区甲基化状态。方法采用TRAP法检测细胞端粒酶活性,免疫荧光法观察hTERT表达;选择hTERT启动子中-692～-403bp共290bp为靶序列,采取亚硫酸氢钠修饰和测序法(BSP)检测2种胃癌细胞株中靶序列甲基化状态并作分析。结果端粒酶和hTERT在SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株中都有表达;PCR扩增产物测序测出-634～-403bp共232bp,经比对与亚硫酸氢钠转化前源序列对应良好,此序列段26个CpG胞嘧啶中,BGC-823细胞株有25个发生甲基化,SGC-7901细胞株全部发生甲基化,经检索此序列段含2个MZF-2结合域即2个锌指基序,但仅可结合MZF-2一个转录调节因子。结论高甲基化改变了DNA的空间结构可能是hTERT启动子高甲基化上调hTERT表达的原因之一,从而阻断了MZF-2与锌指基序的结合。 展开更多

关键词 人端粒酶反转录酶 甲基化 MZF-2

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ox-LDL刺激对冠心病患者单核细胞ATP结合盒转运体A1反应性的影响 被引量：2

9

作者 周珊珊 郭志刚 +2 位作者 吴佳易 赖文岩 冯岚 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期587-589,共3页

目的研究在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激下冠心病患者单核细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达水平及ABCA1在动脉粥样硬化(AS)中的作用机制。方法分别取冠心病患者(42例)及正常对照者(40例)新鲜血液中的单核细胞,利用密度(1.0... 目的研究在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激下冠心病患者单核细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达水平及ABCA1在动脉粥样硬化(AS)中的作用机制。方法分别取冠心病患者(42例)及正常对照者(40例)新鲜血液中的单核细胞,利用密度(1.077)梯度离心法分离,PE荧光标记ABCA1,采用流式细胞仪检测其在单核细胞中的表达量。ox-LDL(30mg/L)刺激单核细胞24h后,观察两组ABCA1表达量的变化情况,分析ABCA1表达量与血脂的相关性。结果冠心病组高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A1(apoA1)表达量分别为1.15±1.40,1.19±0.17,与正常对照组(分别为1.36±0.40,1.34±0.22)相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。ox-LDL刺激后两组ABCA1表达量均增加,冠心病组单核细胞ABCA1表达量与刺激后表达量增加幅度(ΔABCA1)(分别为9.80±4.62,4.36±2.34)均较正常对照组(分别为29.35±5.17,7.43±1.51)低,差异有统计学意义(P<0.05)。ABCA1表达量与血脂无明显相关性(P>0.05)。结论冠心病患者体内高浓度ox-LDL对ABCA1表达有抑制作用,ABCA1的损伤和异常血脂谱均使患者逆胆固醇转运(RCT)降低,在AS及冠心病的发生、发展中起着重要作用。 展开更多

关键词 ATP结合匣式转运子 动脉硬化 脂蛋白类 HDL胆固醇 氧化低密度脂蛋白

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单细胞逆转录PCR研究方法及其应用 被引量：4

10

作者 熊杰 夏照帆 韩玲 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期332-334,共3页

高等动物的基因表达分析往往受制于大量纯化同质细胞的取材困难,由于细胞异质性的影响,常规研究方法也无法识别细胞间表达特性的差异。单细胞水平是切实表明综合性基因表达最行之有效的研究途径,而单细胞逆转录PCR又是该水平上基因表达... 高等动物的基因表达分析往往受制于大量纯化同质细胞的取材困难,由于细胞异质性的影响,常规研究方法也无法识别细胞间表达特性的差异。单细胞水平是切实表明综合性基因表达最行之有效的研究途径,而单细胞逆转录PCR又是该水平上基因表达研究最有力的工具。与常规RT-PCR相比,该技术在各个环节上都有着显著差异。为此,详尽论述了单细胞逆转录PCR技术在各个环节上的要点包括显微操作、扩增和分析方法、基本注意事项等内容以及该技术在实际科研中的应用情况。 展开更多

关键词 单细胞 逆转录聚合酶链反应

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人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性对启动子活性的影响 被引量：1

11

作者 黄伟 邓亮生 +5 位作者 高钟镐 王玉丽 宋影文 郭凯琪 陈晓旋 冯来武 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1113-1116,共4页

目的探讨人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因P1启动子区域CA微卫星多态性对启动子活性的影响。方法收集131名健康中国人的血液样品,提取基因组DNA并进行基因扫描分析,测定人IGF-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性并计算其频率分布。通过... 目的探讨人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因P1启动子区域CA微卫星多态性对启动子活性的影响。方法收集131名健康中国人的血液样品,提取基因组DNA并进行基因扫描分析,测定人IGF-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性并计算其频率分布。通过PCR方法扩增含有不同长度CA微卫星的P1启动子单体型片段,插入至缺少启动子的pGL4.10质粒载体上的荧光素酶报告基因的上游。通过双荧光素酶报告基因分析法测定含不同长度CA微卫星的P1启动子单体型的活力,比较CA微卫星多态性对P1启动子活性的影响。结果共发现9种CA微卫星多态性,分别为13CA、16CA、17CA、18CA、19CA、20CA、21CA、22CA和23CA,其中分布频率大于5%的有17CA、18CA、19CA、20CA和21CA多态性,分布频率最高的为19CA多态性。双荧光素酶报告基因分析结果表明,P1启动子单体型之间存在活力差异,其中16CA启动子单体型的活力最高,21CA启动子单体型的活力最低。结论人IGF-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性能够影响P1启动子的活性。 展开更多

关键词 生长调节素类 启动区 微卫星重复 多态性 单核苷酸 荧光素酶类 细菌

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通过两步离子交换层析建立保留HLA-A2二聚体构象的纯化方法 被引量：1

12

作者 杨敬 翁秀芳 +1 位作者 梁智辉 吴雄文 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期301-306,311,共7页

目的建立两步离子交换层析纯化方法以获得浓缩的高纯度HLA-A2二聚体。方法收集转染有HLA-A2-IgG1 Fc重组基因的7A2D细胞上清,并进行ELISA和Western blot鉴定7A2D细胞表达的HLA-A2二聚体,检测其浓度;应用SPA亲和层析和两步法离子交换层... 目的建立两步离子交换层析纯化方法以获得浓缩的高纯度HLA-A2二聚体。方法收集转染有HLA-A2-IgG1 Fc重组基因的7A2D细胞上清,并进行ELISA和Western blot鉴定7A2D细胞表达的HLA-A2二聚体,检测其浓度;应用SPA亲和层析和两步法离子交换层析技术分别纯化HLA-A2二聚体,并比较2种方法纯化HLA-A2二聚体的效率。结果7A2D细胞可表达正确构象的HLA-A2二聚体,Western blot检测显示融合蛋白的分子量与预期大小一致,7A2D细胞上清中HLA-A2二聚体的浓度为4.4μg/mL。SPA亲和层析法中pH3.0的洗脱条件使大部分的HLA-A2二聚体发生了变性反应,纯化后构象正确的HLA-A2二聚体纯度为(10.4±1.3)%,回收率仅为(7.3±1.1)%;两步离子交换层析后HLA-A2二聚体纯度为(72.9±4.6)%、回收率为(51.9±6.5)%,均显著高于SPA亲和层析法。结论建立了一种纯化条件相对温和的两步法离子交换层析纯化方法,经过该方法制备获得的高纯度与较高浓度的HLA-A2二聚体可保持正确的空间构象,达到纯化与浓缩的目的。 展开更多

关键词 两步离子交换层析 HLA-A2二聚体 纯化方法 空间构象

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NF-κB在肝细胞生长因子介导的肝脏干细胞增殖效应中的作用 被引量：2

13

作者 姚鹏 胡大荣 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期271-273,共3页

目的研究NF-κB途径在肝细胞生长因子(HGF)介导的肝脏WBF-344细胞增殖信号转导调控中的作用。方法用不同浓度的HGF(0,20,40,80,100ng/ml)刺激WBF-344细胞,24h后用3H-TdR掺入法检测细胞的增殖效应。采用脂质体转染方法用位点阴性的IκB... 目的研究NF-κB途径在肝细胞生长因子(HGF)介导的肝脏WBF-344细胞增殖信号转导调控中的作用。方法用不同浓度的HGF(0,20,40,80,100ng/ml)刺激WBF-344细胞,24h后用3H-TdR掺入法检测细胞的增殖效应。采用脂质体转染方法用位点阴性的IκBα蛋白突变体质粒转染WBF-344细胞,阻断NF-κB活性。用HGF(40ng/ml)刺激0、15、30、60、120min后提取核蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)检测NF-κB的结合活性。采用脂质体转染法将NF-κB报告基因质粒BDGreatEscAPeTMSEAPvector瞬时转染WBF-344细胞后用不同浓度的HGF(0、10、20、40ng/ml)刺激8h,通过BDGreatEscAPeTMSEAP荧光检测系统检测NF-κB的转录活性。用NF-κB抑制剂如BAY-11-7082和ASA预处理WBF-344细胞,再用HGF(40ng/ml)刺激24h,通过3H掺入法检测细胞增殖效应。结果HGF具有促进WB-F344细胞增殖的作用,且呈剂量效应正相关趋势。HGF能够明显提高NF-κBDNA的结合活性,NF-κB复合物在HGF作用15min后即出现,并在30～60min时达到高峰,以后逐渐减退。HGF能够显著促进NF-κB的转录活性,呈剂量效应相关趋势。用NF-κB抑制剂BAY-11-7082或ASA阻断NF-κB后,HGF诱导的WBF-344细胞增殖能够被明显抑制;在转染NF-κB抑制质粒的细胞,HGF介导的WBF-344细胞增殖效应被完全阻断。结论HGF可促进WBF-344细胞增殖,且呈剂量效应正相关趋势。HGF介导的WBF-344细胞增殖效应依赖NF-κB的活化,NF-κB的激活对于HGF介导的WBF-344细胞增殖效应是必须的。 展开更多

关键词 干细胞 肝 细胞增殖

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犬线粒体DNA高变区Ⅰ(HVRⅠ)的遗传多态性研究 被引量：1

14

作者 凌凤俊 李彩霞 +4 位作者 商亮 郑秀芬 叶健 涂政 靳大庆 《中国比较医学杂志》 CAS 2005年第6期350-354,共5页

目的为犬线粒体DNA应用于系统进化和法医学物证鉴定提供基础。方法对106只无亲缘关系的犬线粒体DNA高变区Ⅰ(1041-1318)进行测序。结果测序得到了23个单倍型,它们的差异由24个突变点产生,其中包括碱基转换、颠换及插入。大多数突变点是... 目的为犬线粒体DNA应用于系统进化和法医学物证鉴定提供基础。方法对106只无亲缘关系的犬线粒体DNA高变区Ⅰ(1041-1318)进行测序。结果测序得到了23个单倍型,它们的差异由24个突变点产生,其中包括碱基转换、颠换及插入。大多数突变点是碱基替代,转换为79.2%,颠换为16.7%,碱基插入为4.1%。结论犬线粒体DNA高变区Ⅰ序列,遗传差异度(相当于杂合度)为0.89,两个无关个体的偶合概率为0.1213,具有高度序列多态性。 展开更多

关键词 犬科 DNA 线粒体 多态性 序列分析

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转化生长因子-β_1对人绒癌JEG-3细胞增殖及基质金属蛋白酶抑制剂-1的作用研究

15

作者 李玉红 李晓茹 +2 位作者 许倩 史长华 张卓 《中国全科医学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第27期3048-3050,共3页

目的观察转化生长因子(TGF)-β1不同作用时间对绒癌JEG-3细胞增殖及基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1的影响。方法以100μg/LTGF-β1处理JEG-3细胞,分别于不同时间收获细胞,采用MTT法于0、12、24、48h检测细胞的增殖活力,采用Western Blott... 目的观察转化生长因子(TGF)-β1不同作用时间对绒癌JEG-3细胞增殖及基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1的影响。方法以100μg/LTGF-β1处理JEG-3细胞,分别于不同时间收获细胞,采用MTT法于0、12、24、48h检测细胞的增殖活力,采用Western Blotting及RT-PCR技术于0、12、24、48、72h分析TIMP-1在蛋白和转录水平的表达情况。结果随着100μg/LTGF-β1作用时间的延长,各实验组的细胞增殖率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);TIMP-1蛋白和TIMP-1 mRNA的表达随着100μg/LTGF-β1作用时间的延长均呈明显的增加趋势(P<0.05)。结论绒癌JEG-3细胞对外源性的TGF-β1有良好的反应性并呈时间依赖性,100μg/LTGF-β1可促进JEG-3细胞增殖及TIMP-1蛋白及其mRNA的表达。 展开更多

关键词 转化生长因子-Β1 JEG-3细胞 细胞增殖 基质金属蛋白酶-1

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人PD-L1胞外区基因的克隆、原核表达及抗体制备

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作者 李斌 刘朝奇 +5 位作者 王见之 史继静 覃晓琳 吕佰瑞 王梦瑶 韩琴 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期997-999,共3页

目的克隆人PD-L1胞外区基因并进行原核表达及相应蛋白的抗体制备,为进一步研究PD-1/PD-L1通路及针对该通路进行疾病治疗和药物筛选奠定基础。方法用PCR方法扩增编码人PD-L1胞外区的基因序列,克隆到原核表达载体pET28a(+)中并进行表达,用... 目的克隆人PD-L1胞外区基因并进行原核表达及相应蛋白的抗体制备,为进一步研究PD-1/PD-L1通路及针对该通路进行疾病治疗和药物筛选奠定基础。方法用PCR方法扩增编码人PD-L1胞外区的基因序列,克隆到原核表达载体pET28a(+)中并进行表达,用His抗体为一抗进行Western blotting鉴定并验证结合活性。用纯化的hPD-L1胞外区蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达质粒pET28a(+)-hPD-L1成功构建,并可在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导高效表达,得到的hPD-L1胞外区蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确。用纯化蛋白免疫日本大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度可达105。结论鉴定和纯化了原核表达的hPD-L1蛋白,制备的相应多克隆抗体能够检测真核细胞表达的hPD-L1蛋白,为进一步研究PD-1/PD-L1生物学活性奠定了实验基础。 展开更多

关键词 基因 PD-L1 基因表达 抗体

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共价连接β2m的HLA-A2/IgG1二聚体的构建、表达与纯化

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作者 郝娟 段红霞 +4 位作者 李庆 孙伟 钟茂华 翁秀芳 吴雄文 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期1-5,共5页

目的HLA-A2/IgG1二聚体经蛋白A(SPA)亲合层析柱浓缩纯化时容易发生β2 m解离,为了解决这个问题,研究构建与表达β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白。方法利用基因重组技术构建β2 m-HLA-A2/IgG1融合基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-[β2 m-HLA-A2/I... 目的HLA-A2/IgG1二聚体经蛋白A(SPA)亲合层析柱浓缩纯化时容易发生β2 m解离,为了解决这个问题,研究构建与表达β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白。方法利用基因重组技术构建β2 m-HLA-A2/IgG1融合基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-[β2 m-HLA-A2/IgG1],将其转染721.221细胞系,筛选高表达β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的细胞株;收集细胞培养上清,SPA亲合层析柱浓缩纯化,检测该蛋白的纯化效率。结果β2 m-HLA-A2/IgG1融合基因转染721.221细胞后可表达正确构象的β2 m-HLA-A2/IgG1二聚体,Western blot显示β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的分子量与预期大小一致;经SPA亲合层析柱纯化后,β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白较HLA-A2/IgG1融合蛋白的纯化效率约高5倍。结论共价连接β2 m的HLA-A2二聚体有助于HLA-A2二聚体在低pH值的环境下保持构象完整。 展开更多

关键词 β2m-HLA—A2/IgG1融合蛋白 真核表达 亲合层析 构象完整

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黏蛋白3羧基末端蛋白酶切的阻断及N-糖基化的抑制对其细胞膜定位的影响

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作者 何勇虹 李宜成 +1 位作者 彭志红 汪荣泉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期823-825,共3页

目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端蛋白酶切反应和羧基端内N-糖苷型糖链与细胞膜定位的关系。方法利用脂质体将包含rMuc3羧基端的3个真核表达载体p20、p20t和p20s/a导入COS-1细胞,并采用N-糖苷型糖链合成抑制剂衣霉素处理转染后的COS-1... 目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端蛋白酶切反应和羧基端内N-糖苷型糖链与细胞膜定位的关系。方法利用脂质体将包含rMuc3羧基端的3个真核表达载体p20、p20t和p20s/a导入COS-1细胞,并采用N-糖苷型糖链合成抑制剂衣霉素处理转染后的COS-1细胞,抑制其表达蛋白质的N型糖链合成。采用免疫荧光定位法,用抗V5抗体和抗Myc抗体检测Muc3蛋白的表达。结果在甲醇固定的COS-1细胞,细胞核周和细胞表面均能检测到完整的Muc3羧基端p20表达产物;在未经甲醇固定的COS-1细胞,免疫荧光仅限于细胞表面。缺失的rMuc3羧基端的p20t表达产物仅能在细胞核周检测到。Muc3羧基端建立的蛋白酶切阴性突变体p20s/a与p20转染细胞的荧光分布相近。衣霉素抑制糖链合成后不影响膜定位。结论Muc3羧基末端蛋白酶切的阻断及N-糖基化的抑制不能影响Muc3的细胞膜定位,影响其定位的因素主要是SEA组件靠近羧基端的区域,包括该分子的跨膜区和胞质内区域。 展开更多

关键词 黏蛋白类 蛋白酶切 糖基化

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携带凋亡素基因的重组腺病毒载体对小鼠Hepa1-6肝细胞癌模型的生长抑制作用研究

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作者 刘清 罗永胜 +2 位作者 赖卓胜 张振书 黄丽婷 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1315-1317,共3页

目的探讨携带凋亡素基因(vp3gene)的重组腺病毒载体(AdAFPvp3)治疗C57BL/6小鼠肝细胞癌模型的可行性。方法检测腺病毒AdAFPvp3、腺病毒AdCMV-eGFP滴度。建立c57BL/6小鼠皮下荷肝细胞癌模型(n=24),计算成瘤率。待小鼠皮下肿瘤长至5mm左右... 目的探讨携带凋亡素基因(vp3gene)的重组腺病毒载体(AdAFPvp3)治疗C57BL/6小鼠肝细胞癌模型的可行性。方法检测腺病毒AdAFPvp3、腺病毒AdCMV-eGFP滴度。建立c57BL/6小鼠皮下荷肝细胞癌模型(n=24),计算成瘤率。待小鼠皮下肿瘤长至5mm左右时,随机分为治疗组、AdCMV-eGFP对照组、PBS对照组,每组8只,分别于瘤内注射AdAFPvp3(5×108pfu/100μl)、AdCMV-eGFP(5×108pfu/100μl)和PBS(100μl),隔日1次,共2次。每日测量肿瘤体积并观察有无不良反应,注射后7d处死小鼠,计算抑瘤率。肿瘤、肝脏和脾脏均行病理检查,用TUNEL法鉴定vp3在体内诱导肝癌细胞死亡的方式。结果腺病毒AdAF-Pvp3、AdCMV-eGFP滴度均为5×109pfu/ml。皮下肝癌成瘤率100%。瘤内注射AdAFPvp3后,小鼠肿瘤体积较病毒AdCMV-eGFP对照组、PBS对照组明显缩小(P<0.05)。治疗组抑瘤率78.87%,明显高于AdCMV-eGFP对照组(5.01%,P<0.05),治疗未见明显不良反应。凋亡素在体内以凋亡方式诱导肝癌细胞死亡。结论重组腺病毒载体AdAFPvp3基因治疗能抑制小鼠实验性肝细胞癌生长。 展开更多

关键词 腺病毒载体 基因治疗 癌 肝细胞

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基于L-NAME诱导的高血压小鼠血清代谢组学研究 被引量：6

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作者 杜梦繁 张光远 +2 位作者 王志玮 周婷婷 马鑫 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1775-1776,共2页

高血压是心脑血管的主要危险因素,是导致我国居民死亡的主要原因之一[1-2]。高血压的发生和发展受遗传因素和环境因素的共同影响[3],而在近年来的研究中,造成高血压的主要因素60%与代谢异常有关,约80%的高血压患者存在各种形式的代谢紊... 高血压是心脑血管的主要危险因素,是导致我国居民死亡的主要原因之一[1-2]。高血压的发生和发展受遗传因素和环境因素的共同影响[3],而在近年来的研究中,造成高血压的主要因素60%与代谢异常有关,约80%的高血压患者存在各种形式的代谢紊乱[4]。 展开更多

关键词 高血压 代谢组学 UPLC-QTOF/MS L-NAME 血清 差异分子

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