目的研究细胞程序性死亡配体-1(programmed cell death protein ligand-1,PD-L1)功能抑制调控免疫活化影响ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化发生发展的机制。方法将24只ApoE^(-/-)小鼠随机分为正常组,高脂组和高脂^(+)抗PD-L1单抗组,通过高...目的研究细胞程序性死亡配体-1(programmed cell death protein ligand-1,PD-L1)功能抑制调控免疫活化影响ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化发生发展的机制。方法将24只ApoE^(-/-)小鼠随机分为正常组,高脂组和高脂^(+)抗PD-L1单抗组,通过高胆固醇饲料喂养建立动脉粥样硬化(atherosclerosis)模型。实验动物饲养70 d后,分离各组实验动物血管(主动脉根部至腹主动脉)及肝脏组织,进行油红O染色;HE染色检测肝组织病理改变;ELISA检测血清中总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)和炎症因子(IFN-γ、TNF-α、IL-1β)含量。流式细胞计数检测肝脏淋巴细胞(CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)IFN-γ^(+)和CD8^(+)IFN-γ^(+)T细胞)。RT-PCR检测肝脏组织IFN-γ、TNF-α、IL-1β、CD4和CD8表达。结果与高脂组比较,给予抗PD-L1单抗后促血管壁及肝脏脂质累积并上调血清及肝组织CHO、TG、LDL-c和HDL-c含量。高脂饲养条件下给予抗PD-L1单抗促血清和肝组织谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)含量升高,但是对碱性磷酸酶(AKP)含量没有影响。高脂饲养条件下给予抗PD-L1单抗促血清和肝脏组织IFN-γ、TNF-α和IL-1β含量升高。高脂饲养条件下给予抗PD-L1单抗抑制CD4表达及促CD8表达。高脂饲养条件下给予抗PD-L1单抗促肝脏CD8^(+)T和CD8^(+)IFN-γ^(+)T细胞活化,但是对CD4^(+)IFN-γ^(+)T细胞活化没有影响。结论高脂饲养条件下给予抗PD-L1单抗通过活化肝脏CD8^(+)IFN-γ^(+)T细胞损伤肝脏功能加重动脉粥样硬化。展开更多
目的建立5-羟色胺2C受体(5-HT_(2C)receptor,5-HT_(2C)R)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的活化T细胞核因子2(nuclear factor of activated T cells 2,NFAT2)共表达细胞株。方法人源5-HT_(2C)R质粒...目的建立5-羟色胺2C受体(5-HT_(2C)receptor,5-HT_(2C)R)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的活化T细胞核因子2(nuclear factor of activated T cells 2,NFAT2)共表达细胞株。方法人源5-HT_(2C)R质粒转染至U2OS-EGFP-NFAT2细胞,经潮霉素(Hygro)压力筛选到稳定表达5-HT_(2C)R的U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞。使用RT-qPCR和Western blot法检测该细胞株中5-HT_(2C)R的mRNA和蛋白表达水平;用核转位功能实验验证U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞受体功能的特异性;验证5-HT、LSD、DOM、DOI、赛洛西宾(PSI)和利舒脲(LIS)对5-HT_(2C)R的激活能力。结果筛选得到58号细胞为最强激活的U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R单克隆细胞株。RT-qPCR和Western blot结果显示,1~15代内,U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞株稳定表达5-HT_(2C)R mRNA和蛋白。1~15代内,Vabicaserin对U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞株的激活能力稳定,5-HT_(2C)R特异性拮抗剂SB242084能够拮抗Vabicaserin的作用。5-HT、LIS、PSI能诱导U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞部分核转位,而LSD、DOM、DOI没有作用。结论成功构建了共表达5-HT_(2C)R和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞,可用于靶向5-HT_(2C)R的高活性小分子化合物筛选。展开更多
文摘目的研究细胞程序性死亡配体-1(programmed cell death protein ligand-1,PD-L1)功能抑制调控免疫活化影响ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化发生发展的机制。方法将24只ApoE^(-/-)小鼠随机分为正常组,高脂组和高脂^(+)抗PD-L1单抗组,通过高胆固醇饲料喂养建立动脉粥样硬化(atherosclerosis)模型。实验动物饲养70 d后,分离各组实验动物血管(主动脉根部至腹主动脉)及肝脏组织,进行油红O染色;HE染色检测肝组织病理改变;ELISA检测血清中总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)和炎症因子(IFN-γ、TNF-α、IL-1β)含量。流式细胞计数检测肝脏淋巴细胞(CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)IFN-γ^(+)和CD8^(+)IFN-γ^(+)T细胞)。RT-PCR检测肝脏组织IFN-γ、TNF-α、IL-1β、CD4和CD8表达。结果与高脂组比较,给予抗PD-L1单抗后促血管壁及肝脏脂质累积并上调血清及肝组织CHO、TG、LDL-c和HDL-c含量。高脂饲养条件下给予抗PD-L1单抗促血清和肝组织谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)含量升高,但是对碱性磷酸酶(AKP)含量没有影响。高脂饲养条件下给予抗PD-L1单抗促血清和肝脏组织IFN-γ、TNF-α和IL-1β含量升高。高脂饲养条件下给予抗PD-L1单抗抑制CD4表达及促CD8表达。高脂饲养条件下给予抗PD-L1单抗促肝脏CD8^(+)T和CD8^(+)IFN-γ^(+)T细胞活化,但是对CD4^(+)IFN-γ^(+)T细胞活化没有影响。结论高脂饲养条件下给予抗PD-L1单抗通过活化肝脏CD8^(+)IFN-γ^(+)T细胞损伤肝脏功能加重动脉粥样硬化。
文摘目的建立5-羟色胺2C受体(5-HT_(2C)receptor,5-HT_(2C)R)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的活化T细胞核因子2(nuclear factor of activated T cells 2,NFAT2)共表达细胞株。方法人源5-HT_(2C)R质粒转染至U2OS-EGFP-NFAT2细胞,经潮霉素(Hygro)压力筛选到稳定表达5-HT_(2C)R的U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞。使用RT-qPCR和Western blot法检测该细胞株中5-HT_(2C)R的mRNA和蛋白表达水平;用核转位功能实验验证U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞受体功能的特异性;验证5-HT、LSD、DOM、DOI、赛洛西宾(PSI)和利舒脲(LIS)对5-HT_(2C)R的激活能力。结果筛选得到58号细胞为最强激活的U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R单克隆细胞株。RT-qPCR和Western blot结果显示,1~15代内,U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞株稳定表达5-HT_(2C)R mRNA和蛋白。1~15代内,Vabicaserin对U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞株的激活能力稳定,5-HT_(2C)R特异性拮抗剂SB242084能够拮抗Vabicaserin的作用。5-HT、LIS、PSI能诱导U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞部分核转位,而LSD、DOM、DOI没有作用。结论成功构建了共表达5-HT_(2C)R和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞,可用于靶向5-HT_(2C)R的高活性小分子化合物筛选。
文摘目的研究柴胡皂苷A(saikosaponin A,SSA)对小鼠骨髓源性巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)M1/M2型巨噬细胞分化、凋亡和功能的影响,并探究其分子机制。方法体外诱导BMDM分别向M1/M2型巨噬细胞分化,并同时加入SSA处理后:CCK-8检测BMDM、M1/M2型巨噬细胞的活性;倒置荧光显微镜观察M1/M2型巨噬细胞形态;流式细胞术(flow cytometry,FCM)和ELISA法检测M1/M2型巨噬细胞表面标志物和细胞因子水平;实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR)检测IL-6、TNF-α、精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)的mRNA水平;FCM检测腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球颗粒的能力;免疫组织荧光染色(immunofluorescence,IF)和Western blot检测SSA调控M1/M2型巨噬细胞的分子机制。结果SSA浓度在10.0 mg/L范围内对细胞活性无明显影响,SSA浓度15.0 mg/L时,M1/M2型巨噬细胞活性均受到明显抑制(P<0.01);10.0 mg/L SSA处理后的M1/M2型巨噬细胞形态发生变化,M1型巨噬细胞出现纺锤状或不规则形,少数细胞具有伪足,部分细胞边界不清;M2型巨噬细胞部分变为类圆形或者不规则形(P<0.001),边界不清楚。SSA处理后BMDM分化为M1/M2型巨噬细胞的比例均显著降低(P<0.05),且M1型巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α的水平和其mRNA水平均显著降低(P<0.05),但M2型巨噬细胞分泌Arg-1和其mRNA水平均显著升高(P<0.05)。SSA可降低腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球颗粒的能力(P<0.01),且具有浓度依赖性。SSA可降低M1型巨噬细胞磷酸化核转录因子-κB(phosphorylation of NF-kappaB,p-NF-κB)(P<0.01),提高M2型巨噬细胞磷酸化信号转导和转录激活因子6(phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 6,p-STAT6)(P<0.05)。结论SSA可能通过调控NF-κB和STAT6信号通路来影响M1/M2型巨噬细胞的分化和功能。
