猪繁殖与呼吸综合征检测与监测技术要点 被引量：3

1

作者 张宝真 刘明杰 +4 位作者 陈盛楠 颜广智 涂常松 黄良宗 白挨泉 《猪业科学》 2024年第4期36-39,共4页

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的一种严重危害全球养猪生产的传染病,其主要危害是引起母猪繁... 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的一种严重危害全球养猪生产的传染病,其主要危害是引起母猪繁殖障碍和生长猪呼吸道疾病以及发病猪群的继发感染。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征 母猪繁殖障碍 猪呼吸道疾病 继发感染 PRRSV 技术要点

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多重PCR检测猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒 被引量：13

2

作者 黄良宗 顾万军 +1 位作者 王淑敏 冼琼珍 《动物医学进展》 CSCD 2006年第7期62-65,共4页

应用Primer3.0和Omega2.0,根据猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪流感病毒(SIV)保守基因设计了3对多重PCR引物,建立PRRSV,SIV和PRV单项PCR检测方法,并在优化单项PCR反应条件(引物浓度、Mg2+浓度、退火温度等)基础上... 应用Primer3.0和Omega2.0,根据猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪流感病毒(SIV)保守基因设计了3对多重PCR引物,建立PRRSV,SIV和PRV单项PCR检测方法,并在优化单项PCR反应条件(引物浓度、Mg2+浓度、退火温度等)基础上,初步建立了PRRSV-PRV-SIV多重PCR检测方法,并分别用多重PCR和单项PCR/RT-PCR检测10份临床病料,两者符合率为96.6%,表明该多重PCR检测方法有较高的敏感度,可以用于临床病料的检测。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪流感病毒 多重PCR

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H3亚型猪流感病毒分离与鉴定 被引量：9

3

作者 黄良宗 顾万军 +1 位作者 王淑敏 冼琼珍 《动物医学进展》 CSCD 2006年第6期61-63,共3页

从东莞和鹤山等地不同猪场采集的40份鼻拭子或病死猪的肺、气管病料中分离到4株有血凝活性的病毒,其中3株病毒与新城疫病毒阳性血清的HI试验为阳性,另外1株病毒与抗猪流感H3亚型猪流感病毒阳性血清的HI试验为阳性;根据猪流感病毒M基因... 从东莞和鹤山等地不同猪场采集的40份鼻拭子或病死猪的肺、气管病料中分离到4株有血凝活性的病毒,其中3株病毒与新城疫病毒阳性血清的HI试验为阳性,另外1株病毒与抗猪流感H3亚型猪流感病毒阳性血清的HI试验为阳性;根据猪流感病毒M基因设计引物,扩增出预期的约315 bp片段,表明该病毒为H3亚型猪流感病毒。 展开更多

关键词 猪流感病毒 分离 鉴定 血凝抑制试验 逆转录-聚合酶链反应

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RNA干扰抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒N基因表达及病毒复制 被引量：4

4

作者 黄良宗 钟科阳 +3 位作者 王淑敏 司兴奎 马春全 顾万军 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期148-150,F0003,共4页

根据siRNA设计原则,选取了PRRSV N基因上的保守序列作为可能的干扰位点,设计、合成了3个siRNAs,分别将其克隆到pSIREN-Shuttle中,获得3个siRNA重组表达质粒:pShuttle-N1,pShuttle-N2和pShuttle-N3。将siRNA重组表达质粒与融合表达质粒pE... 根据siRNA设计原则,选取了PRRSV N基因上的保守序列作为可能的干扰位点,设计、合成了3个siRNAs,分别将其克隆到pSIREN-Shuttle中,获得3个siRNA重组表达质粒:pShuttle-N1,pShuttle-N2和pShuttle-N3。将siRNA重组表达质粒与融合表达质粒pEGFP-ORF7共转染Marc145细胞,并通过荧光显微镜观察。结果显示,siRNA重组表达质粒能显著抑制PRRSV N基因的表达。在转染总剂量(0.7μg/孔)固定的条件下,分别将不同组合的siRNA表达质粒共转染Marc145细胞,各组合转染孔对PRRSV复制的抑制作用没有明显差异,其中3种siRNA表达质粒共转染对PRRSV复制的抑制最好,证实siRNA对病毒复制作用具有相加性。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) RNA干扰 病毒复制

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Ⅰ型鸭肝炎病毒SN株和弱毒疫苗株全基因组克隆及序列分析

5

作者 黄良宗 刘鳗仪 +2 位作者 王淑敏 司兴奎 顾万军 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期140-141,159,共3页

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法对鸭肝炎病毒SN株和弱毒疫苗株全基因分段扩增并克隆测序。比较分析SN株、弱毒疫苗株和参考毒株多聚蛋白基因和VP1基因核苷酸序列构建系统进化树。结果表明,所测定的... 根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法对鸭肝炎病毒SN株和弱毒疫苗株全基因分段扩增并克隆测序。比较分析SN株、弱毒疫苗株和参考毒株多聚蛋白基因和VP1基因核苷酸序列构建系统进化树。结果表明,所测定的2个毒株多聚蛋白基因核苷酸序列与DHV-Ⅰ型GFS99广东株相似性最高(99.5%)。DHV-ⅠVP1基因核苷酸序列系统进化树分为3个群:SN株在以韩国强毒株R85952为代表的强毒株群中,弱毒疫苗株在以A66为代表的弱毒株群中,另外一群是以SY1为代表的从浙江分离的强毒株。 展开更多

关键词 Ⅰ型鸭肝炎病毒 DHVSN株 分子克隆 序列分析

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鸭肝炎病毒GD-B株生物学特性测定及多聚蛋白基因序列分析

6

作者 黄良宗 刘鳗仪 +2 位作者 王淑敏 司兴奎 顾万军 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第11期58-60,共3页

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法分段扩增鸭肝炎病毒GD-B株多聚蛋白基因并克隆测序,构建多聚蛋白核苷酸系统进化树,并测定GD-B株部分生物学特性。结果表明,GD-B株多聚蛋白基因核苷酸序列与DHV-Ⅰ型G... 根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法分段扩增鸭肝炎病毒GD-B株多聚蛋白基因并克隆测序,构建多聚蛋白核苷酸系统进化树,并测定GD-B株部分生物学特性。结果表明,GD-B株多聚蛋白基因核苷酸序列与DHV-Ⅰ型GFS99广东株同源性最高(99.5%),属Ⅰ型鸭肝炎病毒,其EID50为10-4.62/0.2mL,LD50为10-4.13/0.3mL,与标准DHV-Ⅰ中和指数为23,提示GD-B株发生了抗原变异。 展开更多

关键词 鸭肝炎病毒 生物学特性 多聚蛋白基因 序列分析

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NDV地方分离株与La Sota株抗原交叉性研究

7

作者 黄良宗 麦根沛 +3 位作者 王淑敏 冼琼珍 顾万军 陈建红 《动物医学进展》 CSCD 2006年第3期96-98,共3页

用新城疫弱毒疫苗株La Sota阳性血清测定NDVMM，NDVLD，NDV-NH3株新城疫病毒地方分离株和标准株La Sota，F48E9的HI效价，以La Sota阳性血清对La Sota疫苗株的HI效价为参照，分析NDV地方分离株与疫苗株抗原交叉性。结果表明，NDV-MM，ND... 用新城疫弱毒疫苗株La Sota阳性血清测定NDVMM，NDVLD，NDV-NH3株新城疫病毒地方分离株和标准株La Sota，F48E9的HI效价，以La Sota阳性血清对La Sota疫苗株的HI效价为参照，分析NDV地方分离株与疫苗株抗原交叉性。结果表明，NDV-MM，NDV-LD 2个野毒株HI效价与NDV-LD HI效价相近，但比La Sota HI效价低2．3个～2．7个滴度；NDV-NH与F48E9 HI效价相近，比La SotaHI效价低4．2个～4．3个滴度，提示以上3个野毒株与疫苗株之间的抗原相关性差异较大。动物免疫保护试验结果表明，经La Sota免疫（HI效价〉2^5）后攻毒保护率为80％-100％。 展开更多

关键词 新城疫病毒 抗原交叉性

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不同动物源大肠杆菌的耐药性调查 被引量：54

8

作者 贺丹丹 黄良宗 +6 位作者 陈孝杰 杨铜 饶丽丽 罗东妹 陈佩玲 彭辉 刘健华 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第10期211-215,共5页

为了解畜禽源大肠杆菌的耐药状况,2011—2012年从患病和健康食品动物中分离鉴定大肠杆菌935株,包括健康猪源606株、患病猪源114株、患病鸡源51株、患病水禽源(鸭和鹅)164株。试验采用琼脂稀释法测定了不同动物来源的大肠杆菌对15种抗菌... 为了解畜禽源大肠杆菌的耐药状况,2011—2012年从患病和健康食品动物中分离鉴定大肠杆菌935株,包括健康猪源606株、患病猪源114株、患病鸡源51株、患病水禽源(鸭和鹅)164株。试验采用琼脂稀释法测定了不同动物来源的大肠杆菌对15种抗菌药物的敏感性。结果发现,大肠杆菌耐药严重,对大部分药物的耐药率超过70.0%,其中氨苄西林、复方新诺明和四环素的耐药率均达到了80.0%以上;仅对头孢西丁、黏菌素和阿米卡星较敏感,但患病水禽源大肠杆菌对阿米卡星的耐药率达到了52.4%,明显高于其他动物。健康畜禽源大肠杆菌对多数抗菌药的耐药率低于患病畜禽源大肠杆菌,表明抗菌药物的使用增加了病原菌对第3代头孢类药物和氟喹诺酮类药物的耐药率,势必增加临床治疗难度。 展开更多

关键词 大肠杆菌 耐药性 多重耐药性

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3种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用 被引量：13

9

作者 曾强 黄良宗 +3 位作者 李丹 朱燕秋 谢海燕 顾万军 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期459-463,共5页

为研究板蓝根、甘草和鱼腥草3种中药粗提物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的作用,采用体外细胞培养法,在Marc-145单层细胞上,对3种中药粗提物进行直接抗PRRSV活性试验.结果... 为研究板蓝根、甘草和鱼腥草3种中药粗提物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的作用,采用体外细胞培养法,在Marc-145单层细胞上,对3种中药粗提物进行直接抗PRRSV活性试验.结果表明,板蓝根和甘草粗提物阻断PRRSV的最佳质量浓度分别为3.125、0.391mg/mL,抑制PRRSV感染的最佳质量浓度分别为3.125、0.782mg/mL,直接灭活PRRSV的最佳质量浓度分别为1.563、0.782mg/mL;鱼腥草粗提物质量浓度为0.782mg/mL时,阻断和抑制PRRSV感染的效果最好,但对PRRSV没有直接灭活作用.3种中药粗提物均有不同程度的体外抗PRRSV活性作用,其中板蓝根的效果最好. 展开更多

关键词 板蓝根 甘草 鱼腥草 猪繁殖与呼吸综合征病毒

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利用gE-ELISA技术对广东部分猪场猪伪狂犬病野毒感染的检测 被引量：6

10

作者 曾强 陈响坤 +2 位作者 白挨泉 黄良宗 顾万军 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期199-200,206,共3页

利用gE-ELISA技术对广东部分猪场共1627份血清进行猪伪狂犬病野毒感染进行检测。研究结果表明,不同猪场PR野毒感染存在差异;种猪PR野毒感染率较仔猪高;新、旧猪场伪狂犬病野毒感染差异不显著。并对猪场伪狂犬病野毒感染免疫防治提出了... 利用gE-ELISA技术对广东部分猪场共1627份血清进行猪伪狂犬病野毒感染进行检测。研究结果表明,不同猪场PR野毒感染存在差异;种猪PR野毒感染率较仔猪高;新、旧猪场伪狂犬病野毒感染差异不显著。并对猪场伪狂犬病野毒感染免疫防治提出了建议和对策。 展开更多

关键词 gE-ELISA技术 广东部分猪场 猪伪狂犬病 野毒感染

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广东部分地区中小型猪场猪伪狂犬病野毒感染的血清学调查 被引量：12

11

作者 冼琼珍 蔡明福 +2 位作者 王淑敏 黄良宗 顾万军 《动物医学进展》 CSCD 2006年第10期81-83,共3页

采用阻断ELISA法,对广东省9个地区经猪伪狂犬基因缺失苗免疫的中小型猪场2005年-2006上半年送检的375份血清进行猪伪狂犬病野毒感染的血清学检测。结果表明,有9个地区猪场血清呈阳性,其中阳性血清174份,平均阳性率为46.4%,最高阳性率达6... 采用阻断ELISA法,对广东省9个地区经猪伪狂犬基因缺失苗免疫的中小型猪场2005年-2006上半年送检的375份血清进行猪伪狂犬病野毒感染的血清学检测。结果表明,有9个地区猪场血清呈阳性,其中阳性血清174份,平均阳性率为46.4%,最高阳性率达65.0%,提示该地区中小型猪场有猪伪狂犬病野毒感染。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病 野毒 阳性率 酶联免疫吸附试验

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中药体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒的影响 被引量：4

12

作者 李丹 向华 +3 位作者 黄良宗 娄华 柴家前 顾万军 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期140-144,共5页

采用细胞培养的方法测定了黄芪、板蓝根等6种中药在细胞安全浓度范围内抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞的作用。试验结果表明,药物的最大无毒作用浓度为黄芪12.5 mg/mL、板蓝根3.125 mg/mL、甘草3.125 mg/mL、山楂3.125 mg/mL、鱼腥... 采用细胞培养的方法测定了黄芪、板蓝根等6种中药在细胞安全浓度范围内抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞的作用。试验结果表明,药物的最大无毒作用浓度为黄芪12.5 mg/mL、板蓝根3.125 mg/mL、甘草3.125 mg/mL、山楂3.125 mg/mL、鱼腥草1.526 mg/mL、青蒿1.526 mg/mL。先加药物后加病毒时,6种中药的保护作用均显著;先加病毒后加药物时,鱼腥草的作用比较稳定,而板蓝根在3.125 mg/mL、1.562 mg/mL保护率较高;药物与病毒孵育后加药,板蓝根在3.125 mg/mL、1.562 mg/mL的作用比较明显。 展开更多

关键词 中药 猪繁殖与呼吸综合征病毒 抗病毒

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广东省部分猪场猪流感抗体监测与分析 被引量：3

13

作者 林文 黄良宗 +5 位作者 刘远佳 吕艳丽 唐志玲 余绍华 罗满林 顾万军 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第24期126-128,共3页

从广东省9个地级市采集42个规模猪场种公猪、肉猪和母猪血清共1 371份,用酶联免疫吸附试验和微量血球凝集抑制试验检测H1、H3、H9亚型猪流感抗体。结果表明:所监测猪场大部分猪群存在H1、H3、H9亚型猪流感抗体,H1、H3和H9亚型流感抗体... 从广东省9个地级市采集42个规模猪场种公猪、肉猪和母猪血清共1 371份,用酶联免疫吸附试验和微量血球凝集抑制试验检测H1、H3、H9亚型猪流感抗体。结果表明:所监测猪场大部分猪群存在H1、H3、H9亚型猪流感抗体,H1、H3和H9亚型流感抗体阳性率分别在3.5%～44.0%、1.6%～20.0%和4.5%～15.6%之间,总阳性率分别为27.9%、6.1%和9.5%;另外,H1、H3和H9亚型猪流感抗体均以珠三角地区感染最为普遍;H1和H3抗体具有明显的季节性特点,秋冬季节的阳性率明显高于春夏季节。 展开更多

关键词 猪流感 抗体 检测

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H1N1亚型猪流感病毒的生物学特性测定及其HA基因序列分析 被引量：3

14

作者 马祥 顾万军 +2 位作者 刘镇明 黄良宗 彭启明 《动物医学进展》 CSCD 2006年第9期59-62,共4页

测定了A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）猪流感病毒的部分生物学特性；运用RT—PCR方法扩增其HA基因，并对其进行了克隆和序列分析。结果表明，该株病毒的EID50／0．2mL及TCID50／0．1mL分别为10^-2.3和10^-2.1，小鼠感染试验亦说明... 测定了A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）猪流感病毒的部分生物学特性；运用RT—PCR方法扩增其HA基因，并对其进行了克隆和序列分析。结果表明，该株病毒的EID50／0．2mL及TCID50／0．1mL分别为10^-2.3和10^-2.1，小鼠感染试验亦说明该病毒具有致病性。序列分析表明，HA基因全长为1701bp，与国内外流行株同源性达90．8％～99．0％。 展开更多

关键词 猪流感 逆转录-聚合酶链反应 鸡胚半数感染量 半数的胞感染量

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猪流感病毒A/swine/Guangdong/2/2012(H1N1)毒株攻毒BALB/c小鼠细胞因子动态变化的研究 被引量：1

15

作者 林文 吕艳丽 +6 位作者 黄良宗 刘远佳 唐志玲 余绍华 刘明杰 罗满林 顾万军 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第10期11-16,共6页

为了测定H1N1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)对小鼠的致病性,本试验对A/swine/Guangdong/2/2012(H1N1)株SIV HA基因进行克隆及遗传分析,并将SIV尿囊液经鼻腔感染6周龄BALB/c小鼠,观察感染后小鼠的一般状况、器官系数和组织... 为了测定H1N1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)对小鼠的致病性,本试验对A/swine/Guangdong/2/2012(H1N1)株SIV HA基因进行克隆及遗传分析,并将SIV尿囊液经鼻腔感染6周龄BALB/c小鼠,观察感染后小鼠的一般状况、器官系数和组织病理学变化,在病毒感染后第1、3和7天使用荧光定量PCR测定小鼠肺脏、脾脏、脑组织中7种细胞因子mRNA的表达量,研究其对小鼠的致病特性。结果显示,该病毒属于经典SIV,病毒经鼻腔感染后可引起小鼠活动减少、采食量降低,但无咳嗽和死亡;病理组织学变化为肺间隔较正常组织明显增厚,毛细血管明显扩张充血,周围肺泡腔呈代偿性肺气肿;小鼠肺脏、脾脏组织样本中IFN-α、IFN-β、IP-10、IL-1β、TNF-α、IRF-3和IL-10mRNA含量在感染后第3天均显著升高(P<0.05),而脑组织样本中IL-1β和IL-10在小鼠攻毒后第3和7天均显著上调(P<0.05)。 展开更多

关键词 H1N1亚型猪流感病毒 BALB C小鼠 细胞因子

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猪TRIM3基因克隆、生物信息学及组织表达分析 被引量：2

16

作者 张航 沙惠阳 +2 位作者 李华玮 黄良宗 赵孟孟 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第7期2474-2483,共10页

【目的】克隆大白猪三基序结合蛋白3(tripartite motif-containing 3,TRIM3)基因,并对其进行生物信息学和组织表达分析。【方法】采用PCR技术扩增并克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过... 【目的】克隆大白猪三基序结合蛋白3(tripartite motif-containing 3,TRIM3)基因,并对其进行生物信息学和组织表达分析。【方法】采用PCR技术扩增并克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选阳性克隆,菌液PCR鉴定后测序,与不同物种TRIM3基因序列比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对其编码蛋白进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR方法检测TRIM3基因在大白猪不同组织中的相对表达量。【结果】大白猪TRIM3基因CDS序列全长2235 bp,编码744个氨基酸。相似性和遗传进化分析结果显示,大白猪与野猪的相似性最高,达99.7%,与鸭的相似性最低,为75.1%;大白猪TRIM3基因与野猪先聚为一类,与牛和山羊亲缘关系较近。生物信息学分析显示,大白猪TRIM3蛋白分子质量为80.58 ku,理论等电点(pI)为8.32,不稳定系数为40.85,为亲水性蛋白,但不是分泌蛋白,无糖基化位点,预测其有60个磷酸化位点,主要存在于细胞质内;在TRIM3蛋白二级结构中以无规则卷曲为主,占41.67%,三级结构模型预测结果与二级结构一致。组织表达分析表明,大白猪TRIM3基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、气管、结肠中均有分布,肺脏中表达量最多且显著高于其他组织(P<0.05)。【结论】本研究成功克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,并进行了生物信息学和组织表达分析,为进一步研究大白猪TRIM3蛋白的免疫学功能提供理论依据,对探究大白猪TRIM3基因参与先天性免疫和抗病毒感染分子机制具有重要意义。 展开更多

关键词 大白猪 TRIM3基因 克隆 表达分析

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H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因的克隆与表达

17

作者 马祥 顾万军 +2 位作者 刘镇明 黄良宗 彭启明 《动物医学进展》 CSCD 2006年第8期73-76,共4页

应用RT-PCR方法扩增了1株H1N1亚型猪流感病毒的血凝素基因,并克隆到pMD 18-T Simple载体中,经PCR、酶切和测序验证克隆正确后,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-HA。在脂质体作用下重组质粒pcDNA-HA转染Vero细胞... 应用RT-PCR方法扩增了1株H1N1亚型猪流感病毒的血凝素基因,并克隆到pMD 18-T Simple载体中,经PCR、酶切和测序验证克隆正确后,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-HA。在脂质体作用下重组质粒pcDNA-HA转染Vero细胞。间接免疫荧光试验结果表明,血凝素基因在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,这为猪流感病毒DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪流感病毒 血凝素基因 克隆 表 达 VERO细胞

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1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

18

作者 韩慧 郭亚晶 +4 位作者 颜广智 陈盛楠 刘明杰 莫美连 黄良宗 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1642-1650,共9页

【目的】了解广东地区猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的流行情况并探究其分子生物学特征。【方法】采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定、遗传进化和关键氨基酸位点分析。【结果】样品... 【目的】了解广东地区猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的流行情况并探究其分子生物学特征。【方法】采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定、遗传进化和关键氨基酸位点分析。【结果】样品经实时荧光定量RT-PCR检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1∶128;8个基因片段序列结果经BLAST比对和进化树分析显示,HA、NA基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H1N1)分支,PA、PB 1、PB 2、NP和M基因属pdm/09分支,NS基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/CJM2/2022(H1N1)。关键氨基酸位点分析显示,分离株HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR/GL,具有典型低致病性流感病毒的分子特征。HA基因在受体结合位点处的190、225、226位氨基酸分别为D、E、Q,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能。NA基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂的敏感性较高,而M基因3处氨基酸位点突变为V27A、A30T、D44A,提示对金刚烷胺类药物耐药性增加。【结论】本研究分离鉴定的毒株为G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,关键氨基酸位点分析提示该毒株具有适应在哺乳动物中复制和毒力增强的特征。本研究结果为广东地区猪流感的防控提供了参考数据。 展开更多

关键词 欧亚类禽猪流感病毒 分离鉴定 序列分析 H1N1亚型

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巴泰病毒G1_(189aa-239aa)肽段的原核表达、纯化及间接ELISA方法的建立

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作者 员晓庆 李丽霞 +9 位作者 唐甜 陈盛楠 梁晓彤 黄良宗 司兴奎 张浩吉 孙秀涛 段文学 金宁一 刘昊 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第10期3770-3778,共9页

本研究旨在获得高纯度巴泰病毒(Batai virus,BATV)G1蛋白强抗原性肽段,并建立一种用于检测BATV羊血清抗体的间接ELISA方法。首先对G1蛋白51个氨基酸编码的189-239位氨基酸强抗原肽段进行密码子优化,基因合成后构建重组表达质粒pET-32a-G... 本研究旨在获得高纯度巴泰病毒(Batai virus,BATV)G1蛋白强抗原性肽段,并建立一种用于检测BATV羊血清抗体的间接ELISA方法。首先对G1蛋白51个氨基酸编码的189-239位氨基酸强抗原肽段进行密码子优化,基因合成后构建重组表达质粒pET-32a-G1_(189aa-239aa),转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达。优化表达条件获得大量rHis-G1_(189aa-239aa)肽段,利用镍柱亲和层析方法进行纯化,并用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。通过Western blotting对rHis-G1_(189aa-239aa)肽段进行抗原特异性分析,以rHis-G1_(189aa-239aa)肽段为抗原,羊BATV阳性血清作为抗体,通过方阵滴定优化反应条件,建立BATV间接ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,rHis-G1_(189aa-239aa)肽段在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,分子质量为24.5 ku,在0.1 mmol/L的IPTG诱导5 h后rHis-G1_(189aa-239aa)肽段表达量达到峰值。通过镍柱亲和层析纯化后,测得蛋白浓度为0.296 mg/mL。Western blotting结果显示,rHis-G1_(189aa-239aa)肽段特异性较好。以rHis-G1_(189aa-239aa)肽段为抗原建立的间接ELISA方法,通过条件优化确定最佳抗原包被浓度为2.5μg/mL,血清和二抗稀释度为1∶60和1∶10000。样品D450 nm值≥0.367为阳性,D450 nm值≤0.319为阴性。该方法与山羊痘病毒和布鲁氏杆菌的阳性血清均无交叉反应,批内和批间的变异系数均<10%,阳性血清最高可稀释至1600倍,该方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的特点。利用本方法对云南地区的120份羊血清样本进行检测,血清阳性率为21.67%。本研究获得了特异性强和纯度较高的rHis-G1_(189aa-239aa)肽段,建立了间接ELISA方法,可应用于羊BATV血清流行病学调查,为疫病防控及致病机制研究奠定基础。 展开更多

关键词 巴泰病毒(BATV) G1蛋白 重组肽段 原核表达 蛋白纯化 ELISA

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猪流感病毒广东株分离鉴定及遗传进化分析 被引量：5

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作者 黄良宗 颜广智 +3 位作者 邓汝森 陈盛楠 张海龙 顾万军 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第8期2625-2633,共9页

本研究从广东省某猪场采集37份疑似猪流感症状的猪鼻拭子样品,接种于9日龄SPF鸡胚并收集尿囊液,通过血凝试验、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定,分离得到一株猪流感病毒,经RT-PCR分别扩增8个基因片段,进行基因测序及序列分析,与GenBank收录的... 本研究从广东省某猪场采集37份疑似猪流感症状的猪鼻拭子样品,接种于9日龄SPF鸡胚并收集尿囊液,通过血凝试验、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定,分离得到一株猪流感病毒,经RT-PCR分别扩增8个基因片段,进行基因测序及序列分析,与GenBank收录的参考毒株比对并构建进化树。结果显示,分离毒株为H1N1亚型猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/2/2018(H1N1)。遗传进化分析显示,分离株8个片段的核酸序列与A/swine/Guangdong/L3/2009(H1N1)对应序列的同源性均达99%以上,与经典型H1N1亚型猪流感病毒处于同一分支。分离毒株HA的裂解位点为PSIQSR↓GL,符合低致病性流感病毒分子特征。HA基因受体位点为190D、225G和226Q,表明本毒株既可以结合SAα-2,6-Gal型人类流感病毒SA受体,也有结合SAα-2,3-Gal型禽类流感病毒SA受体的可能,在28、40、104、304、498、557位氨基酸处有6个潜在糖基化位点;NA蛋白在50、58、63、68、98、146、235位氨基酸处有6个潜在糖基化位点,NA蛋白氨基酸序列活性中心位点为119E、199D、223I、275H、293R、295N,氨基酸分析位点未出现突变,表明本分离株对神经氨酸酶抑制剂类药物的敏感性较高,但在M2蛋白中,31位氨基酸由敏感型的(S)突变为抗药的(N),提示可能对金刚烷胺类药物产生耐药性。开展猪流感病毒分离鉴定与遗传进化分析将为广东地区的猪流感流行和变异情况提供重要信息。 展开更多

关键词 猪流感 H1N1亚型 分离鉴定 遗传进化

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