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小鼠BTLA胞外段腺相关病毒载体的构建和表达 被引量:1
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作者 韩凌斐 王玲 +6 位作者 邱伟民 姚红霞 胡程 卞政 马衣努尔.买提托合提 方勇 马丁 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期232-235,共4页
目的构建小鼠B/T淋巴细胞弱化因子(BTLA)胞外段的腺相关病毒载体,并感染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)进行真核表达。方法从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增BTLA胞外段,然后将其克隆到腺相关病毒载体的骨架质粒中,构建重组骨架质... 目的构建小鼠B/T淋巴细胞弱化因子(BTLA)胞外段的腺相关病毒载体,并感染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)进行真核表达。方法从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增BTLA胞外段,然后将其克隆到腺相关病毒载体的骨架质粒中,构建重组骨架质粒psBTLA。重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,与pHELP质粒以及pRC质粒3质粒共转染293T细胞,收获含病毒的上清后用氯仿-PEG8000的方法进行纯化浓缩,再用浓缩后的病毒液感染CHO细胞,并用SDS-PAGE和Western blot检测BTLA胞外段的表达。结果获得长度为502 bp的小鼠BT-LA胞外段基因,经测序证实其序列正确。含有BTLA胞外段基因的腺相关病毒载体感染CHO细胞后,SDS-PAGE和Western blot分析证实感染的CHO细胞可表达出约21 kD的BTLA胞外段蛋白。结论成功构建小鼠BTLA胞外段基因的腺相关病毒载体,并感染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究BTLA胞外段的功能效应奠定实验基础。 展开更多
关键词 B/T淋巴细胞弱化因子 腺相关病毒 基因克隆 真核表达
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携带小鼠HVEM的重组腺相关病毒载体的构建及鉴定 被引量:1
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作者 马衣努尔.买提托合提 韩凌斐 +4 位作者 廖术杰 周志刚 董红 马丁 王世宣 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期179-183,共5页
目的克隆小鼠疱疹病毒侵入介体(HVEM)基因,构建其重组腺相关病毒载体,鉴定目的基因在真核细胞中表达。方法用RT-PCR法从小鼠脾脏淋巴细胞克隆出全长HVEM基因,构建携带HVEM基因的穿梭质粒pAAV-IRES-HVEM-hrGFP和辅助质粒pAAV-RC及pAAV-He... 目的克隆小鼠疱疹病毒侵入介体(HVEM)基因,构建其重组腺相关病毒载体,鉴定目的基因在真核细胞中表达。方法用RT-PCR法从小鼠脾脏淋巴细胞克隆出全长HVEM基因,构建携带HVEM基因的穿梭质粒pAAV-IRES-HVEM-hrGFP和辅助质粒pAAV-RC及pAAV-Helper,利用磷酸钙共沉淀法将穿梭质粒共转染入AAV-293细胞中,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒rAAV-HVEM。用氯仿-PEG8000法纯化病毒,实时荧光定量PCR测病毒滴度。RT-PCR检测rAAV-HVEM在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达情况。结果成功构建组装重组小鼠HVEM腺相关病毒,纯化后病毒滴度为5×1010v.g/mL,且在CHO转导细胞中能有效表达目的基因。结论构建的重组腺相关病毒载体rAAV-HVEM为组织工程相关细胞转基因构建及临床应用提供先进的载体系统,为今后进一步研究HVEM的功能及其在部分疾病基因免疫治疗中的应用奠定基础。 展开更多
关键词 疱疹病毒侵入介体 腺相关病毒 基因治疗
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小鼠CD160胞外段真核表达载体的构建和表达
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作者 韩凌斐 王薇 +6 位作者 廖书杰 李春晓 马衣努尔.买提托合提 刘佳 夏曦 刘荣华 马丁 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期748-751,共4页
目的构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达。方法从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160。... 目的构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达。方法从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160。重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染CHO细胞,并用RT-PCR和Western blot检测CD160胞外段的表达,流式细胞术检测重组psCD160与其配体的结合能力。结果获得长度约为520 bp的小鼠CD160胞外段基因,经测序证实其序列正确。用脂质体将含有CD160胞外段基因的重组质粒载体转染CHO细胞后,RT-PCR和Western blot分析证实转染的CHO细胞可表达重组的psCD160基因,并且表达的可溶性CD160可与其配体结合。结论成功构建小鼠CD160胞外段基因的真核表达载体,并转染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究CD160胞外段的功能效应奠定实验基础。 展开更多
关键词 CD160 基因克隆 真核表达
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