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血清中胎盘来源外泌体的分离与鉴定 被引量：22
1
作者 李玉静 刁振宇 +4 位作者 薛平平 沈莉 龚萍 颜桂军 胡娅莉 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2015年第6期632-636,共5页
目的妊娠期间,胎盘可释放外泌体到母体循环,在正常妊娠或胎盘相关妊娠并发症中发挥重要作用。文中旨在建立简便、高效、低耗的母血清胎盘来源外泌体的分离纯化方法,为妊娠疾病研究奠定基础。方法蔗糖梯度离心联合2次8%PEG6000沉淀,分离... 目的妊娠期间,胎盘可释放外泌体到母体循环,在正常妊娠或胎盘相关妊娠并发症中发挥重要作用。文中旨在建立简便、高效、低耗的母血清胎盘来源外泌体的分离纯化方法,为妊娠疾病研究奠定基础。方法蔗糖梯度离心联合2次8%PEG6000沉淀,分离纯化正常孕妇血清中胎盘来源外泌体,Western blot检测胎盘来源外泌体标记蛋白分子（CD63、CD81、PLAP）,银染法分析各密度层中所有蛋白质条带,透射电镜鉴定胎盘来源外泌体形态,动态光散射测定外泌体粒径及分布。结果通过蔗糖密度梯度离心后得到的各分层液经蛋白质SDS-PAGE胶电泳,银染后可见各蛋白分子条带清晰可见,Western blot结果显示CD63、CD81和PLAP同时表达于21%～34%蔗糖密度层,证明血清胎盘外泌体主要存在于1.09～1.16g/m L蔗糖密度层。透射电镜鉴定获得的胎盘来源外泌体形态符合一般外泌体特征,且特异表达PLAP。动态光散射测定获得的胎盘外泌体直径分布于28～91 nm,且大小均一。结论成功建立了一种简便、快捷、高效分离血清中胎盘来源外泌体的改良方法,为研究胎盘外泌体在正常妊娠及胎盘相关并发症中的作用奠定实验基础。 展开更多
关键词 外泌体 胎盘 分离 胎盘碱性磷酸酶
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miR-181a促进人子宫内膜间质细胞蜕膜化催乳素的表达 被引量：10
2
作者 张群 刘红玉 +4 位作者 蒋玥 王玢 颜桂军 孙海翔 胡娅莉 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2012年第2期129-134,共6页
目的目前虽已发现一些在胚胎着床过程中起重要作用的分子,但微小RNA(microRNA,miRNA)在蜕膜化过程中作用的研究报道较少,文中调查孕鼠围着床期子宫组织中miR-181a的表达规律,并探讨miR-181a对人子宫内膜间质细胞(human endometrial stro... 目的目前虽已发现一些在胚胎着床过程中起重要作用的分子,但微小RNA(microRNA,miRNA)在蜕膜化过程中作用的研究报道较少,文中调查孕鼠围着床期子宫组织中miR-181a的表达规律,并探讨miR-181a对人子宫内膜间质细胞(human endometrial stromal cell,hESC)体外诱导蜕膜化过程中蜕膜化标志基因蜕膜化催乳素(decidual prolactin,dPRL)表达的调控作用。方法收集怀孕0～6.5 d孕鼠子宫组织,采用TRIZOL法提取总RNA,通过实时定量PCR检测子宫组织中miR-181a的表达。制备Ad-miR-181a重组腺病毒,并感染hESC,24 h后采用0.5 mmol/L 8-Br-cAMP和1μmol/L Medroxyproges-terone(MPA)联合进行体外蜕膜化诱导培养;通过化学发光免疫法和实时定量PCR分别检测细胞培养液上清中dPRL的浓度与间质细胞中催乳素(prolactin,PRL)mRNA的表达;同时采用荧光素酶报告基因检测miR-181a对hESC中dPRL(-332/+65)启动子的调控作用。结果早孕小鼠子宫组织中miR-181a的表达高于非妊娠小鼠子宫,且随着妊娠天数的增加呈逐渐上升的趋势,在小鼠着床"窗口期"即孕4.5 d达到高峰(2.60±0.15倍,P<0.01,n=5),孕5.5 d子宫miR-181a的表达开始平稳下降;成功获得滴度为5.19×1010ifu/ml的miR-181a腺病毒,该腺病毒介导的miR-181a过表达显著增加hESC蜕膜化标志基因dPRL mRNA表达水平,增高超过8倍(P<0.01);在8-Br-cAMP和MPA联合诱导hESC体外蜕膜化时,高表达miR-181a可明显增加8-Br-cAMP联合MPA诱导的PRL mRNA表达水平与PRL蛋白分泌(P<0.01)。荧光素酶报告基因进一步证实miR-181a可以激活dPRL(-332/+65)启动子的活性达到2倍(P<0.05)。结论 miR-181a参与8-Br-cAMP和MPA诱导子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中PRL的表达调控。 展开更多
关键词 miR-181a 催乳素 蜕膜化 人子宫内膜间质细胞
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CYP19A1基因多态性与多囊卵巢综合征的相关性研究 被引量：10
3
作者 甄鑫 颜桂军 +2 位作者 孙海翔 乔迪 王勇 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2014年第6期596-599,共4页
目的 CYP19基因编码产物芳香化酶在雄激素代谢中发挥重要作用。文中探讨CYP19A1基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点与多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)发病及性激素的相关性。方法采用病例-对... 目的 CYP19基因编码产物芳香化酶在雄激素代谢中发挥重要作用。文中探讨CYP19A1基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点与多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)发病及性激素的相关性。方法采用病例-对照的研究方法,以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法对373例PCOS者(PCOS组)和313例正常对照者(对照组)中CYP19A1基因多态性位点rs2899470进行基因分型,分析2组基因型频率及等位基因频率,并比较不同基因型与年龄、初潮年龄、体重指数(body mass index,BMI)及血清多种性激素水平的关系。结果对照组与PCOS组在年龄、BMI、激素水平差异有统计学意义(P<0.01),在AAM方面差异无统计学意义(P>0.01)。rs2899470基因型频率在PCOS组(GG:44.5%;TG:49.6%;TT:5.9%)和对照组(GG:39.3%;TG:48.6%;TT:12.1%)的分布差异有统计学意义(P=0.013),PCOS组等位基因G的频率明显高于对照组(69.3%vs 63.6%,P=0.025)。PCOS组雌激素/睾酮值与rs2899470基因型有关,PCOS组GG、TG、TT基因型差异有统计学意义(P<0.01)。结论 CYP19A1基因多态位点rs2899470与PCOS发病有相关性。PCOS患者的rs2899470基因型与血清雌激素/睾酮水平有关。 展开更多
关键词 多囊卵巢综合征 CYP19 单核苷酸多态性
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HOXA10与连续TTAT基序结合抑制p/CAF表达 被引量：5
4
作者 华美娟 赵静 +4 位作者 陈林君 颜桂军 刁振宇 胡娅莉 孙海翔 《医学研究生学报》 CAS 2009年第11期1143-1146,1149,I0003,共6页
目的:转录因子HOXA10在胚胎着床和子宫内膜蜕膜化过程中发挥重要作用。p/CAF是HOXA10新的靶基因,文章旨在筛选并鉴定p/CAF启动子区与HOXA10功能性结合的序列。方法:制备重组腺病毒HOXA10(ad-HOXA10),用于感染人子宫内膜间质细胞(hESC);... 目的:转录因子HOXA10在胚胎着床和子宫内膜蜕膜化过程中发挥重要作用。p/CAF是HOXA10新的靶基因,文章旨在筛选并鉴定p/CAF启动子区与HOXA10功能性结合的序列。方法:制备重组腺病毒HOXA10(ad-HOXA10),用于感染人子宫内膜间质细胞(hESC);构建p/CAF启动子区多种突变报告基因质粒;采用萤光素酶报告基因实验检测结合腺病毒介导的HOXA10基因过表达,分析hESC中HOXA10对p/CAF启动子转录活性的调控。结果:获得滴度为2.4×1011ifu/mL的重组ad-HOXA10,对hESC的感染率达到80%以上。HOXA10通过结合连续的3个TTAT(-710^-674 nt)基序抑制p/CAF启动子活性,连续的3个TTAT基序的一级结构影响HOXA10的功能性结合。结论:p/CAF启动子区连续的3个TTAT基序是HOXA10功能性结合所必须的,HOXA10可能通过调控p/CAF的表达来控制hESC的增殖与分化。 展开更多
关键词 HOXA10 p/CAF 人子宫内膜间质细胞
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Nur77促进人子宫内膜蜕膜化间质细胞中催乳素的表达 被引量：4
5
作者 蒋玥 赵静 +4 位作者 华美娟 甄鑫 胡娅莉 颜桂军 孙海翔 《医学研究生学报》 CAS 2011年第1期5-10,共6页
目的蜕膜化催乳素在妊娠的建立与维持中具有重要作用,但目前对参与蜕膜化催乳素表达调节因子的研究较少。文章旨在探讨孤儿核受体Nur77在人子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中对蜕膜化标志基因(Prolactin,PRL)的作用。方法制备Ad-Flag-Nur77... 目的蜕膜化催乳素在妊娠的建立与维持中具有重要作用,但目前对参与蜕膜化催乳素表达调节因子的研究较少。文章旨在探讨孤儿核受体Nur77在人子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中对蜕膜化标志基因(Prolactin,PRL)的作用。方法制备Ad-Flag-Nur77重组腺病毒,通过荧光素酶报告基因和荧光定量PCR结合重组腺病毒介导的Nur77过表达及小干扰RNA沉默Nur77基因的实验,阐述Nur77对蜕膜催乳素的调控作用。结果成功获得滴度为8×1010ifu/ml的重组Nur77腺病毒,该腺病毒可在子宫内膜间质细胞中高表达Flag-Nur77融合蛋白;体外培养的人子宫内膜间质细胞经8-Br-cAMP和甲羟孕酮(medroxy progesterone,MPA)刺激后,Nur77的表达明显增加,并在体外诱导蜕膜化培养的第3天达到高峰;过表达Nur77可明显上调人子宫内膜间质细胞中dPRL(-332/+65)启动子活性>4倍,并以浓度依赖的方式明显增加人子宫内膜间质细胞中PRL mRNA的表达,P<0.01;功能缺失实验进一步表明基因沉默内源性Nur77蛋白表达明显抑制dPRL启动子活性达60%,同时显著抑制8-Br-cAMP和MPA诱导的人子宫内膜间质细胞中PRLmRNA的表达,P<0.01。结论孤儿核受体Nur77参与8-Br-cAMP和MPA诱导子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中PRL的表达调控。 展开更多
关键词 Nur77 催乳素 蜕膜化 人子宫内膜间质细胞
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产前贮存式自体备血的可行性及对母儿安全影响的研究 被引量：17
6
作者 李曼榕 戴毅敏 +6 位作者 王志群 顾宁 李洁 蒋红 翁侨 胡娅莉 颜桂军 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2014年第10期1060-1064,共5页
目的术前自体备血(preoperative autologous blood donation,PABD)可减少对异体血源的需求,但备血时可引起孕妇短时间大量失血,对胎儿及孕妇的安全性尚未充分评估。文章探讨PABD的可行性及对母儿安全性的影响。方法设置符合PABD的纳入标... 目的术前自体备血(preoperative autologous blood donation,PABD)可减少对异体血源的需求,但备血时可引起孕妇短时间大量失血,对胎儿及孕妇的安全性尚未充分评估。文章探讨PABD的可行性及对母儿安全性的影响。方法设置符合PABD的纳入标准,募集2013年1月至2013年12月间在南京大学医学院附属鼓楼医院定期产检并拟在本院住院分娩的孕妇,在知情同意基础上行PABD。参照2013年美国加州围产期出血高危分类临床标准,将PABD孕妇分为低危组、中危组及高危组。观察孕妇采血前后血常规、血压、心率、末梢血氧饱和度及其他不良反应变化情况,电子胎心监护观察胎心变化,分析孕妇行PABD的安全性,并评估各组产时出血量、自体血回输情况及分娩结局。结果 92例接受PABD的孕妇共采血115例次。低危组、中危组和高危组产前备血量中位数分别为300、300及400 m L。115例次孕妇采血后5 min舒张压较采血开始时平均下降3.4 mm Hg,差异有统计学意义(P<0.05);采血结束时反映监测生命征变化的参数差异无统计学意义(P>0.05);胎心监护全部为反应型。PABD孕妇单次采血后血红蛋白和红细胞压积(hematocrit,HCT)较采血前平均降低5.4%和2.1%,差异均有统计学意义(P<0.05),分娩前均恢复至采血前水平。2次行PABD的孕妇血红蛋白和HCT变化与单次采血类似,但第2次采血后血红蛋白、HCT与采血前相比差异无统计学意义(P>0.05)。所有孕妇分娩后无新生儿窒息和围产儿死亡。结论 PABD可为产妇及时提供自体全血。在严格管理下,有指征地使用PABD技术具有合理性和安全性。 展开更多
关键词 贮存式自体备血 产后出血 前置胎盘 稀有血型 贫血
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分子遗传标记的应用现状和展望
7
作者 常国斌 李慧芳 +1 位作者 颜桂军 刘华雷 《动物科学与动物医学》 1999年第2期17-18,共2页
遗传标记的提出已有近半个世纪，其定义及其包含的种类许多学者提出了见解。秦志锐（１９８４）认为是受基因控制，并可用于间接选择的各个性状，也就是所谓的附加性状或标记性状，主要包括生物化学的、生理的、免疫学和细胞学方面等等... 遗传标记的提出已有近半个世纪，其定义及其包含的种类许多学者提出了见解。秦志锐（１９８４）认为是受基因控制，并可用于间接选择的各个性状，也就是所谓的附加性状或标记性状，主要包括生物化学的、生理的、免疫学和细胞学方面等等［１］。目前较完整的表述：指易于识... 展开更多
关键词 分子遗传标记 动物 育种 遗传图谱
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DNAJB11促进卵巢颗粒细胞中FOXL2诱导的雌激素合成 被引量：1
8
作者 毛岩 闫蔷 +3 位作者 张春雪 甄鑫 曹瑞兵 颜桂军 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2017年第10期1013-1021,共9页
目的转录因子FOXL2是颗粒细胞雌激素合成与颗粒细胞功能维持的关键调控分子,但目前尚不清楚FOXL2蛋白的表达及功能调控机制。文章旨在鉴定调控FOXL2蛋白功能的新分子。方法通过分离小鼠卵巢组织进行免疫组化染色检测DNAJB11的表达定位情... 目的转录因子FOXL2是颗粒细胞雌激素合成与颗粒细胞功能维持的关键调控分子,但目前尚不清楚FOXL2蛋白的表达及功能调控机制。文章旨在鉴定调控FOXL2蛋白功能的新分子。方法通过分离小鼠卵巢组织进行免疫组化染色检测DNAJB11的表达定位情况,含有全长DNAJB11基因c DNA序列(Ad-DNAJB11-Flag和Ad-Flag-DNAJB11)的腺病毒载体按Ad Max系统(Microbix)方法进行病毒颗粒的包装。按NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic抽提试剂盒所述方法进行细胞核质蛋白的分离。KGN细胞感染不同浓度腺病毒(Ad-DNAJB11和Ad-Lac Z),测量波长450 nm的吸光度值,进行细胞增殖检测。采用Access Immunoassay System 2化学发光自动检测系统(Beckman Coulter)检测细胞培养上清中雌二醇的浓度。采用PCR方法扩增含有人FOXL2和人DNAJB 11基因的全长c DNA序列,并分别亚克隆至p CS2-6XMT载体(Myc-FOXL2)和p FLAG-CMV2载体(Flag-DNAJB11)中。采用Lipofectamine 2000转染试剂将Myc-FOXL2和Flag-DNAJB11表达质粒瞬时转染至细胞HEK-293细胞中。收集HEK-293细胞或FSH处理的KGN细胞的裂解液,进行FOXL2和DNAJB11的免疫共沉淀实验。通过细胞免疫荧光染色和荧光素酶报告基因等实验检测内质网Hsp40/Dna J家族成员DNAJB11调控颗粒细胞的雌激素水平。结果 Western blot表明DNAJB11蛋白在人卵癌颗粒细胞KGN、小鼠原代卵巢颗粒细胞m GC以及小鼠卵巢中高表达,免疫组化染色结果亦证实DNAJB11蛋白表达于小鼠卵巢的卵母细胞质中,并在窦前卵泡、排卵前卵泡的颗粒细胞中持续表达。免疫荧光染色和Western blot分析亦表明外源性激素FSH可以诱导KGN细胞中内源性DNAJB11蛋白从内质网转移到细胞核中。腺病毒介导的DNAJB11-Flag过表达定位于细胞内质网中,但当Flag标签阻断DNAJB11信号肽功能时,外源FlagDNAJB11过表达则定位于颗粒细胞的细胞核,内质网中DNAJB11-Flag蛋白高表达以浓度依赖的方式减少KGN细胞中雌二醇的合成,与Ad-Lac Z(MOI=50)比较,Ad-DNAJB11-Flag(MOI=50)减少,KGN细胞中雌二醇的合成[(10 749.0±801.7)pg/m L vs(7 903.0±409.5)pg/m L,P<0.01],而细胞核中高表达Flag-DNAJB11后则刺激KGN细胞中雌二醇的生成,与Ad-Lac Z(MOI=50)比较,Ad-DNAJB11-Flag(MOI=50)刺激雌二醇的生成[(10 749.0±801.7)pg/m L vs(14 217.0±1218.0)pg/m L,P<0.01]。免疫共沉淀实验表明当Myc-tagged FOXL2与Flag-tagged DNAJB11分别共转染HEK293细胞,FOXL2与DNAJB11可以相互免疫共沉淀对方,荧光素酶报告基因实验进一步表明细胞核中表达的DNAJB11显著增强FOXL2介导的Cyp19A1启动子活性和Cyp19A1蛋白表达。结论 DNAJB11是转录因子FOXL2新的结合分子并调控FOXL2蛋白的稳定性与转录活性。 展开更多
关键词 DNAJB11 转录因子FOXL2 卵巢颗粒细胞 雌激素合成
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