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人去泛素化酶圆柱瘤蛋白截短体质粒的构建及其对胃癌细胞表型的调控研究
1
作者
那迪娜·帕尔哈提
张鹏善
+2 位作者
徐亦天
陈赟琪
黄陈
《上海交通大学学报(医学版)》
2025年第9期1149-1160,共12页
目的·构建去泛素化酶圆柱瘤蛋白(cylindromatosis,CYLD)截短体质粒,初步分析CYLD对胃癌细胞增殖的影响。方法·收集癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)、基因型-组织表达数据库(Genotype-Tissue Expression,G...
目的·构建去泛素化酶圆柱瘤蛋白(cylindromatosis,CYLD)截短体质粒,初步分析CYLD对胃癌细胞增殖的影响。方法·收集癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)、基因型-组织表达数据库(Genotype-Tissue Expression,GTEx)及Kaplan-Meier Plotter数据库中CYLD在胃癌组织与正常组织中表达数据,以及与胃癌患者总生存期的相关性数据;免疫组织化学和Western blotting法检测胃癌组织与癌旁组织中CYLD的表达情况;Western blotting法和荧光实时定量PCR检测正常胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞系中CYLD蛋白和mRNA表达情况。根据CYLD基因序列及结构特点,设计引物,构建其截短体真核表达质粒,琼脂糖凝胶电泳和Western blotting法检测及鉴定其表达情况,免疫荧光(immunofluorescence,IF)观察定位。在AGS细胞中敲低CYLD并且在敲低后分别回补CYLD野生型、酶失活突变型及截短体,细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)和平板克隆实验检测CYLD野生型、酶失活突变型及截短体对细胞增殖的影响。免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)、去泛素化实验、Western blotting法检测CYLD野生型、酶失活突变型及截短体与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα亚基(calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡα,CAMK2A)的相互结合能力、CAMK2A去泛素化修饰水平及STAT3、p-STAT3蛋白表达情况。结果·胃正常组织中CYLD含量显著高于胃癌组织,正常胃黏膜上皮细胞中CYLD含量显著高于胃癌细胞系,高表达CYLD的胃癌患者预后较好。人CYLD截短体质粒构建成功,CYLD野生型、酶失活突变型以及3个截短体主要定位在细胞质的细胞中。敲低CYLD,AGS细胞增殖能力得到显著增强。而在敲低后分别回补CYLD野生型、酶失活突变型及截短体的细胞中,敲低CYLD后过表达CYLD野生型以及CAP3和USP区段能够显著抑制胃癌细胞的增殖。此外,CYLD能够与蛋白激酶CAMK2A相互结合并介导CAMK2A的K63去泛素化修饰,并且抑制CAMK2A对STAT3蛋白的磷酸化修饰。结论·成功构建人CYLD截短体真核表达质粒,CYLD野生型以及CAP3和USP区段显著抑制胃癌细胞增殖能力。
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关键词
去泛素化酶
胃癌
圆柱瘤蛋白(CYLD)
截短体
增殖
CAMK2A
STAT3
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职称材料
题名
人去泛素化酶圆柱瘤蛋白截短体质粒的构建及其对胃癌细胞表型的调控研究
1
作者
那迪娜·帕尔哈提
张鹏善
徐亦天
陈赟琪
黄陈
机构
上海交通大学医学院附属第一人民医院胃肠外科
出处
《上海交通大学学报(医学版)》
2025年第9期1149-1160,共12页
基金
国家自然科学基金(82072662,82203751)
上海交通大学“交大之星”计划医工交叉研究基金
+2 种基金
2023东方英才计划青年拔尖项目
上海市第一人民医院特色国家领军人才培养计划
上海交通大学医学院“双百人”项目(20191425)。
文摘
目的·构建去泛素化酶圆柱瘤蛋白(cylindromatosis,CYLD)截短体质粒,初步分析CYLD对胃癌细胞增殖的影响。方法·收集癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)、基因型-组织表达数据库(Genotype-Tissue Expression,GTEx)及Kaplan-Meier Plotter数据库中CYLD在胃癌组织与正常组织中表达数据,以及与胃癌患者总生存期的相关性数据;免疫组织化学和Western blotting法检测胃癌组织与癌旁组织中CYLD的表达情况;Western blotting法和荧光实时定量PCR检测正常胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞系中CYLD蛋白和mRNA表达情况。根据CYLD基因序列及结构特点,设计引物,构建其截短体真核表达质粒,琼脂糖凝胶电泳和Western blotting法检测及鉴定其表达情况,免疫荧光(immunofluorescence,IF)观察定位。在AGS细胞中敲低CYLD并且在敲低后分别回补CYLD野生型、酶失活突变型及截短体,细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)和平板克隆实验检测CYLD野生型、酶失活突变型及截短体对细胞增殖的影响。免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)、去泛素化实验、Western blotting法检测CYLD野生型、酶失活突变型及截短体与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα亚基(calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡα,CAMK2A)的相互结合能力、CAMK2A去泛素化修饰水平及STAT3、p-STAT3蛋白表达情况。结果·胃正常组织中CYLD含量显著高于胃癌组织,正常胃黏膜上皮细胞中CYLD含量显著高于胃癌细胞系,高表达CYLD的胃癌患者预后较好。人CYLD截短体质粒构建成功,CYLD野生型、酶失活突变型以及3个截短体主要定位在细胞质的细胞中。敲低CYLD,AGS细胞增殖能力得到显著增强。而在敲低后分别回补CYLD野生型、酶失活突变型及截短体的细胞中,敲低CYLD后过表达CYLD野生型以及CAP3和USP区段能够显著抑制胃癌细胞的增殖。此外,CYLD能够与蛋白激酶CAMK2A相互结合并介导CAMK2A的K63去泛素化修饰,并且抑制CAMK2A对STAT3蛋白的磷酸化修饰。结论·成功构建人CYLD截短体真核表达质粒,CYLD野生型以及CAP3和USP区段显著抑制胃癌细胞增殖能力。
关键词
去泛素化酶
胃癌
圆柱瘤蛋白(CYLD)
截短体
增殖
CAMK2A
STAT3
Keywords
deubiquitinase
gastric cancer
cylindromatosis(CYLD)
truncation
poliferation
CAMK2A
STAT3
分类号
R735.2 [医药卫生]
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作者
出处
发文年
被引量
操作
1
人去泛素化酶圆柱瘤蛋白截短体质粒的构建及其对胃癌细胞表型的调控研究
那迪娜·帕尔哈提
张鹏善
徐亦天
陈赟琪
黄陈
《上海交通大学学报(医学版)》
2025
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