[目的]研究‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.‘Nantongxiaofangshi’)乙醇脱氢酶基因DkADH1的功能,阐明其在柿果脱涩过程中的作用。[方法]构建了DkADH1基因植物双元表达载体,通过农杆菌介导法将该基因转入番茄中。以转基因和非转基...[目的]研究‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.‘Nantongxiaofangshi’)乙醇脱氢酶基因DkADH1的功能,阐明其在柿果脱涩过程中的作用。[方法]构建了DkADH1基因植物双元表达载体,通过农杆菌介导法将该基因转入番茄中。以转基因和非转基因番茄株系的不同组织为材料,钨酸钠-钼酸钠比色法测定可溶性单宁含量,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测原花青素(PA)合成途径相关基因的表达情况。[结果]经PCR和RT-PCR检测,获得了3个转DkADH1基因番茄株系。过量表达DkADH1基因的转基因番茄植株的叶片、花、果实中可溶性单宁含量均显著低于非转基因番茄植株。qRTPCR显示:转基因植株不同组织中PA合成途径相关基因F3'5'H、LAR、MYB4和PAL的表达量与非转基因植株相比均显著下调。[结论]DkADH1能降低植物可溶性单宁的含量并抑制其生物合成途径相关基因的表达,与柿果脱涩密切相关。展开更多
文摘本研究旨在获得重组腐败梭菌α毒素,并评价其毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,通过人工合成获得基因片段Gcsa。将Gcsa克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白rCSA。利用Western blot方法检测纯化的rCSA与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用犬肾细胞系(MDCK)和小鼠来检测rCSA的毒力。以甲醛脱毒后的rCSA与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSA为可溶性表达,比例可达50%,且能与腐败梭菌抗血清反应。MDCK细胞毒性试验显示,0.15ng·mL^(-1)的rCSA即可引起明显的细胞病变;小鼠安全性试验显示,rCSA对ICR小鼠的最小致死量是1.5×10~6 ng·kg^(-1);每毫升的一免抗血清可中和100~130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免抗血清可中和360~480个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了4/4的保护。以上结果表明,rCSA具有良好的免疫原性,可作为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的候选抗原。
文摘[目的]研究‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.‘Nantongxiaofangshi’)乙醇脱氢酶基因DkADH1的功能,阐明其在柿果脱涩过程中的作用。[方法]构建了DkADH1基因植物双元表达载体,通过农杆菌介导法将该基因转入番茄中。以转基因和非转基因番茄株系的不同组织为材料,钨酸钠-钼酸钠比色法测定可溶性单宁含量,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测原花青素(PA)合成途径相关基因的表达情况。[结果]经PCR和RT-PCR检测,获得了3个转DkADH1基因番茄株系。过量表达DkADH1基因的转基因番茄植株的叶片、花、果实中可溶性单宁含量均显著低于非转基因番茄植株。qRTPCR显示:转基因植株不同组织中PA合成途径相关基因F3'5'H、LAR、MYB4和PAL的表达量与非转基因植株相比均显著下调。[结论]DkADH1能降低植物可溶性单宁的含量并抑制其生物合成途径相关基因的表达,与柿果脱涩密切相关。
