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TRiC/CCT复合体对mTORC1完整性及其活性的调控作用研究
1
作者
闫先航
钱正韬
+1 位作者
姚春芳
周小明
《华中科技大学学报(医学版)》
北大核心
2025年第1期73-79,共7页
目的探讨TRiC/CCT复合体(TCP-1 ring complex/chaperonin containing TCP-1)与mTOR复合体1(mTORC1)之间可能的相互调控机制。方法采用免疫共沉淀技术和Western blot技术探究TRiC/CCT复合体与mTORC1之间的相互作用;使用雷帕霉素抑制mTORC...
目的探讨TRiC/CCT复合体(TCP-1 ring complex/chaperonin containing TCP-1)与mTOR复合体1(mTORC1)之间可能的相互调控机制。方法采用免疫共沉淀技术和Western blot技术探究TRiC/CCT复合体与mTORC1之间的相互作用;使用雷帕霉素抑制mTORC1活性后,制备可溶性及不溶性细胞蛋白样本,比较受CCT辅助折叠的蛋白表达水平变化;通过非变性凝胶电泳技术观察TRiC/CCT复合体的变化,探究mTORC1对TRiC/CCT复合体完整性的影响;利用慢病毒介导的shRNA静默HEK-293T细胞中的CCT2或CCT5基因,研究TRiC/CCT复合体对mTORC1关键组分表达及下游底物磷酸化水平的影响。结果免疫共沉淀实验证实TRiC/CCT复合体各亚基与mTORC1均存在相互作用;雷帕霉素抑制mTORC1活性后,β-actin、β-Tubulin及STAT3不溶性蛋白表达量无明显增加,且在非变性电泳凝胶中复合体分子大小无明显改变,证明mTORC1对TRiC/CCT复合体的形成不存在调控作用;在HEK-293T中静默CCT2或CCT5后,mTOR、Raptor、mLST8蛋白表达水平降低,且磷酸化的p70S6K及Akt水平降低,证实TRiC/CCT复合体对mTORC1及下游分子具有调控作用。结论TRiC/CCT复合体通过调控mTORC1各组分的蛋白表达水平,进而影响其下游底物的磷酸化水平及活性状态。
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关键词
mTORC1
TRiC/CCT复合体
蛋白质折叠
分子伴侣
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职称材料
CRISPR-Cas9基因编辑报道系统应用于AAVS1安全港的定点整合
被引量：
1
2
作者
曹淳
陈耀
+3 位作者
何佳佳
张毛雪
钱正韬
周小明
《华中科技大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第6期825-829,共5页
目的利用ZFN与TALEN基因编辑以及同源重组技术将Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真核细胞筛选标记的DNA超长片段定点插入HEK-293T细胞基因组AAVS1安全港,建立可用于衡量CRISPR-Cas9基因编辑的稳定细胞株。方法利用分子克隆技...
目的利用ZFN与TALEN基因编辑以及同源重组技术将Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真核细胞筛选标记的DNA超长片段定点插入HEK-293T细胞基因组AAVS1安全港,建立可用于衡量CRISPR-Cas9基因编辑的稳定细胞株。方法利用分子克隆技术构建AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒。利用脂质体将识别并切割AAVS1基因组序列的ZFN和TALEN质粒以及AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒共转染入HEK-293T细胞。使用嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞后,利用杀稻瘟菌素S筛选、红色荧光检测、Cas9 Western blot以及基因组PCR鉴定等方法获得CRISPR-Cas9基因编辑报道系统完整整合入AAVS1安全港的稳定细胞株。继而,将EGFP修复模板单链DNA及EGFP sgRNA瞬时转染入这些稳定细胞株,对失去荧光的EGFP进行基因编辑,恢复其发光功能,并通过荧光检测技术验证基因编辑结果。结果成功获得3株同时具有嘌呤霉素和杀稻瘟菌素S抗性以及表达红色荧光蛋白的单克隆细胞,Western blot证实其成功表达Cas9蛋白,基因组PCR鉴定目的基因成功整合入基因组AAVS1位点。经EGFP基因编辑后,细胞恢复绿色荧光。结论利用ZFN与TALEN将完整的CRISPR-Cas9基因编辑报道系统成功整合入HEK-293T细胞基因组的AAVS1安全港,整合DNA片段长度达11.5 kb,并利用Cas9成功编辑EGFP报道基因。
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关键词
AAVS1
CRISPR
ZFN
TALEN
基因编辑
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职称材料
题名
TRiC/CCT复合体对mTORC1完整性及其活性的调控作用研究
1
作者
闫先航
钱正韬
姚春芳
周小明
机构
江苏大学医学院
江苏省常熟市第一人民医院中心实验室
苏州大学附属儿童医院病理科
出处
《华中科技大学学报(医学版)》
北大核心
2025年第1期73-79,共7页
基金
国家自然科学基金资助项目(No.81571546)。
文摘
目的探讨TRiC/CCT复合体(TCP-1 ring complex/chaperonin containing TCP-1)与mTOR复合体1(mTORC1)之间可能的相互调控机制。方法采用免疫共沉淀技术和Western blot技术探究TRiC/CCT复合体与mTORC1之间的相互作用;使用雷帕霉素抑制mTORC1活性后,制备可溶性及不溶性细胞蛋白样本,比较受CCT辅助折叠的蛋白表达水平变化;通过非变性凝胶电泳技术观察TRiC/CCT复合体的变化,探究mTORC1对TRiC/CCT复合体完整性的影响;利用慢病毒介导的shRNA静默HEK-293T细胞中的CCT2或CCT5基因,研究TRiC/CCT复合体对mTORC1关键组分表达及下游底物磷酸化水平的影响。结果免疫共沉淀实验证实TRiC/CCT复合体各亚基与mTORC1均存在相互作用;雷帕霉素抑制mTORC1活性后,β-actin、β-Tubulin及STAT3不溶性蛋白表达量无明显增加,且在非变性电泳凝胶中复合体分子大小无明显改变,证明mTORC1对TRiC/CCT复合体的形成不存在调控作用;在HEK-293T中静默CCT2或CCT5后,mTOR、Raptor、mLST8蛋白表达水平降低,且磷酸化的p70S6K及Akt水平降低,证实TRiC/CCT复合体对mTORC1及下游分子具有调控作用。结论TRiC/CCT复合体通过调控mTORC1各组分的蛋白表达水平,进而影响其下游底物的磷酸化水平及活性状态。
关键词
mTORC1
TRiC/CCT复合体
蛋白质折叠
分子伴侣
Keywords
mTORCi
TRiC/CCT complex
protein folding
molecular chaperone
分类号
R341.9 [医药卫生—基础医学]
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职称材料
题名
CRISPR-Cas9基因编辑报道系统应用于AAVS1安全港的定点整合
被引量：
1
2
作者
曹淳
陈耀
何佳佳
张毛雪
钱正韬
周小明
机构
江苏大学医学院基础医学与医学技术学院
出处
《华中科技大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第6期825-829,共5页
基金
国家自然科学基金资助项目(No.81571546)。
文摘
目的利用ZFN与TALEN基因编辑以及同源重组技术将Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真核细胞筛选标记的DNA超长片段定点插入HEK-293T细胞基因组AAVS1安全港,建立可用于衡量CRISPR-Cas9基因编辑的稳定细胞株。方法利用分子克隆技术构建AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒。利用脂质体将识别并切割AAVS1基因组序列的ZFN和TALEN质粒以及AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒共转染入HEK-293T细胞。使用嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞后,利用杀稻瘟菌素S筛选、红色荧光检测、Cas9 Western blot以及基因组PCR鉴定等方法获得CRISPR-Cas9基因编辑报道系统完整整合入AAVS1安全港的稳定细胞株。继而,将EGFP修复模板单链DNA及EGFP sgRNA瞬时转染入这些稳定细胞株,对失去荧光的EGFP进行基因编辑,恢复其发光功能,并通过荧光检测技术验证基因编辑结果。结果成功获得3株同时具有嘌呤霉素和杀稻瘟菌素S抗性以及表达红色荧光蛋白的单克隆细胞,Western blot证实其成功表达Cas9蛋白,基因组PCR鉴定目的基因成功整合入基因组AAVS1位点。经EGFP基因编辑后,细胞恢复绿色荧光。结论利用ZFN与TALEN将完整的CRISPR-Cas9基因编辑报道系统成功整合入HEK-293T细胞基因组的AAVS1安全港,整合DNA片段长度达11.5 kb,并利用Cas9成功编辑EGFP报道基因。
关键词
AAVS1
CRISPR
ZFN
TALEN
基因编辑
Keywords
AAVS1
CRISPR
ZFN
TALEN
gene-editing
分类号
Q812 [生物学—生物工程]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
TRiC/CCT复合体对mTORC1完整性及其活性的调控作用研究
闫先航
钱正韬
姚春芳
周小明
《华中科技大学学报(医学版)》
北大核心
2025
0
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
CRISPR-Cas9基因编辑报道系统应用于AAVS1安全港的定点整合
曹淳
陈耀
何佳佳
张毛雪
钱正韬
周小明
《华中科技大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022
1
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