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少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-483基因的克隆及生物学活性 被引量：4
1
作者 贡莎莎 孟庆玲 +5 位作者 乔军 钟文强 黄运福 张国武 陈英 才学鹏 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第2期222-228,共7页
为弄清少孢节丛孢菌几丁质酶的生物学功能,对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-483基因进行克隆及分子特征分析,并在大肠埃希菌中进行诱导表达;采用DNS还原糖法检测经镍柱纯化的重组几丁质酶活性,将其作用于秀丽隐杆线虫幼虫,分析其生物活... 为弄清少孢节丛孢菌几丁质酶的生物学功能,对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-483基因进行克隆及分子特征分析,并在大肠埃希菌中进行诱导表达;采用DNS还原糖法检测经镍柱纯化的重组几丁质酶活性,将其作用于秀丽隐杆线虫幼虫,分析其生物活性。结果显示,AO-483基因编码309个氨基酸,与少孢节丛孢菌标准株(ATCC 24927)的几丁质酶AO-483基因序列的同源性为96. 88%,氨基酸序列同源性为97. 73%;AO-483含有1个Glyco-hydro-18结构域,位于20～297位氨基酸,属于糖苷水解酶18家族,还含有特征序列GMLGG和LDGLDLDVE;三级结构为典型的三磷酸异构酶桶形结构。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白AO-483分子质量约为52 ku,与预测大小一致; Western blot分析证实,该重组蛋白能与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆血清抗体发生特异性反应。经DNS还原糖法检测,该重组几丁质酶活性为223. 31 U·m L^(-1);重组几丁质酶对秀丽隐杆线虫Ⅰ期和Ⅳ期幼虫有较强的降解活性。 展开更多
关键词 少孢节丛孢菌 几丁质酶 克隆 生物学活性
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根癌农杆菌介导的少孢节丛孢菌遗传转化体系研究 被引量：1
2
作者 黄运福 贡莎莎 +4 位作者 孟庆玲 乔军 张国武 王熙凤 才学鹏 《动物医学进展》 北大核心 2021年第2期60-65,共6页
根癌农杆菌介导的遗传转化法(ATMT)是一种丝状真菌常用的遗传转化手段,但目前还不能有效地应用于少孢节丛孢菌的转化。构建由PgpdA启动子调控mgfp-gus基因的真菌表达载体pCAMBIA1304'-PgpdA并转入农杆菌中,利用ATMT技术对少孢节丛... 根癌农杆菌介导的遗传转化法(ATMT)是一种丝状真菌常用的遗传转化手段,但目前还不能有效地应用于少孢节丛孢菌的转化。构建由PgpdA启动子调控mgfp-gus基因的真菌表达载体pCAMBIA1304'-PgpdA并转入农杆菌中,利用ATMT技术对少孢节丛孢菌进行转化。结果显示,农杆菌AGL-1介导的转化在共培养时间为60 h,温度为23℃的条件下获得了1株转化子,以其基因组为模板可以扩增出hph和gus基因片段,进行GUS组织染色能观察到蓝色,表明目的基因成功转入少孢节丛孢菌基因组中并能正常表达。初步建立了农杆菌介导的少孢节丛孢菌遗传转化方法,为少孢节丛孢菌功能新基因的研究、菌株改良等研究奠定了基础。 展开更多
关键词 少孢节丛孢菌 根癌农杆菌 遗传转化 mgfp-gus基因
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基于Me-MLiverpool重组蛋白的新孢子虫胶体金免疫层析检测方法的建立
3
作者 任宏琪 乔军 +5 位作者 孟庆玲 张国武 张艳玲 贡莎莎 王熙凤 才学鹏 《动物医学进展》 北大核心 2020年第11期1-6,共6页
根据GenBank公布的Nc-livepoor的基因序列,分析Nc-livepoor免疫蛋白的优势线性抗原表位,依据分析结果选取Nc-Liverpool的优势抗原表位集中片段进行串联,构建合成Me-Nc-MLiverpool基因。将该基因克隆至pET-30a(+)质粒中构建重组蛋白质粒p... 根据GenBank公布的Nc-livepoor的基因序列,分析Nc-livepoor免疫蛋白的优势线性抗原表位,依据分析结果选取Nc-Liverpool的优势抗原表位集中片段进行串联,构建合成Me-Nc-MLiverpool基因。将该基因克隆至pET-30a(+)质粒中构建重组蛋白质粒pET-30a-Me-Nc-MLiverpool原核表达载体,再进行IPTG诱导表达、分析和纯化及SDS-PAGE和Western blot验证。以0.75 mg/mL的SPA做金标抗原,用纯化后浓度为1 mg/mL的重组蛋白和牛IgG分别做检测线和质控线,建立了检测新孢子虫抗体的胶体金免疫层析检测方法(CGIA)。重组质粒pET-30a-Me-Nc-MLiverpool双酶切验证结果显示,在636 bp的位置有条带,说明重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白大小为39.32 ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可与新孢子虫阳性血清特异性识别,表明重组蛋白有较强的反应原性;特异性试验结果显示,新孢子虫CGIA与弓形虫、肝片吸虫、包虫阳性血清不发生交叉反应;敏感性分析显示,GICA可检测出的Nc阳性血清最大稀释倍数为1∶512;对92份牛血清样品进行检测,与商品化的新孢子虫ELISA检测试剂盒检测结果一致,表明建立的GICA准确性较高。综上所述,研究建立的基于新孢子虫Nc-livepoor基因胶体金免疫层析检测试纸条具有较高的灵敏性和特异性,可为新孢子虫病的诊断提供技术支撑。 展开更多
关键词 新孢子虫 Nc-livepoor 原核表达 胶体金免疫层析检测方法
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