猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APX Ⅱ基因特异片段的克隆和表达 被引量：3

1

作者 袁秀芳 王一成 +2 位作者 徐丽华 张存 叶伟成 《浙江农业学报》 CSCD 2007年第1期6-10,共5页

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APXⅡ的一段毒素基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET-APXⅡ,并将其转化到受体菌BL21中,诱导剂IPTG进行诱导表达,4 h后达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融... 将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APXⅡ的一段毒素基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET-APXⅡ,并将其转化到受体菌BL21中,诱导剂IPTG进行诱导表达,4 h后达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白大小约为31 kD。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应,说明该表达蛋白具有免疫原性,这为下一步用此表达蛋白作为抗原,对APP进行诊断试剂的研制和基因工程疫苗的研究提供科学依据。 展开更多

关键词 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 克隆 表达 Westemblotting

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一步法CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR诊断方法的建立与初步应用 被引量：3

2

作者 袁秀芳 路斌 +2 位作者 徐丽华 李军星 王一成 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第4期537-543,共7页

根据猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,分别设计了1对特异性引物和1条Taq Man探针,建立了一步法检测CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法特异性高,与PCV2,PRV,PPV,PEDV,JEV,BVDV无交叉反应... 根据猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,分别设计了1对特异性引物和1条Taq Man探针,建立了一步法检测CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法特异性高,与PCV2,PRV,PPV,PEDV,JEV,BVDV无交叉反应;可以检出20个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)低于4%,方法重复性好。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对50份疑似病例组织进行检测,结果荧光定量RT-PCR检出30份PRRSV阳性,13份CSFV阳性,均高于常规RT-PCR方法的检出数(24份PRRSV阳性,10份CSFV阳性)。本研究建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高的特点,可用于PRRSV和CSFV的实验室快速诊断和流行病学调查。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 双重实时荧光定量RT-PCR

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猪源ETEC/STEC杂合大肠埃希菌菌株的分离、毒力基因鉴定及耐药性分析

3

作者 蒋利明 陈怡洁 +1 位作者 袁秀芳 李军星 《浙江农业科学》 2024年第8期1939-1943,共5页

仔猪断奶后腹泻(PWD)通常是由产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)感染导致的疾病,该菌通常携带LT、STa及STb等肠毒素中的一种或多种。猪水肿病又被称为胃肠道水肿病,是由产志贺氏毒素大肠埃希菌(STEC)感染引发的一种急性致死性传染病,具有较高的... 仔猪断奶后腹泻(PWD)通常是由产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)感染导致的疾病,该菌通常携带LT、STa及STb等肠毒素中的一种或多种。猪水肿病又被称为胃肠道水肿病,是由产志贺氏毒素大肠埃希菌(STEC)感染引发的一种急性致死性传染病,具有较高的死亡率,该菌通常携带Stx1及Stx2等毒素。文章诊断了一例仔猪腹泻与水肿病并发引起高死亡率的病例,分离鉴定了一株同时携带产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)及产志贺氏毒素大肠埃希菌(STEC)毒力基因的杂合菌株。经鉴定,杂合菌株携带黏附素F18基因、肠毒素基因(STa、STb、LT)以及水肿病致病毒素基因(Stx2e)。药敏试验结果表明,该大肠埃希菌分离株对头孢噻肟、阿米卡星等5种药物敏感,对壮观霉素、环丙沙星等2种药物中度敏感,对恩诺沙星、链霉素等14种药物耐药。该分离菌株为产肠毒素型与产志贺氏毒素杂合型大肠埃希菌(ETEC/ESTEC),对多种抗菌药具有较强的耐药性。 展开更多

关键词 仔猪断奶后腹泻 猪水肿病 分离鉴定 毒力基因

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猪胸膜肺炎放线杆菌apx Ⅳ表达蛋白单克隆抗体的制备 被引量：1

4

作者 袁秀芳 徐丽华 +2 位作者 王一成 张存 叶伟成 《浙江农业科学》 2008年第6期771-773,共3页

将APP apx Ⅳ N端基因克隆于pET-28a载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。收获融合表达的apx Ⅳ蛋白,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/C小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用apxⅣ表达蛋白作... 将APP apx Ⅳ N端基因克隆于pET-28a载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。收获融合表达的apx Ⅳ蛋白,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/C小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用apxⅣ表达蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选阳性克隆,获得了3株能稳定分泌抗apx Ⅳ蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为4H3,1D11和4C1。亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG1型。经Western blot分析证实,3株杂交瘤细胞上清液能与apxⅣ表达蛋白特异反应。本研究获得的融合蛋白单克隆抗体为今后建立该菌的免疫胶体金诊断技术,分析apxⅣ蛋白的抗原表位等提供有益价值。 展开更多

关键词 猪胸膜肺炎放线杆菌 单克隆抗体 杂交瘤株 apxⅣ

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胶体金作为免疫佐剂的初探 被引量：1

5

作者 袁秀芳 王一成 +2 位作者 徐丽华 张存 叶伟成 《浙江农业科学》 2008年第2期228-231,共4页

利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，经扫描电镜观察，粒径大小为15～20nm。以牛血清白蛋白为指示抗原，以小白鼠为模式动物，设立弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂作对比，探索胶体金作为免疫佐剂的可能性。试验结果显示，胶体金能够显著提... 利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，经扫描电镜观察，粒径大小为15～20nm。以牛血清白蛋白为指示抗原，以小白鼠为模式动物，设立弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂作对比，探索胶体金作为免疫佐剂的可能性。试验结果显示，胶体金能够显著提高鼠体内抗牛血清白蛋白抗体的水平，其抗体水平高于弗氏不完全佐剂试验组，而略低于弗氏完全佐剂试验组。因此，胶体金有可能开发成为新一代免疫佐剂。 展开更多

关键词 胶体金 免疫佐剂 弗氏佐剂

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2010—2013年浙江省猪流行性腹泻病毒临床检测及PEDV-S基因型分析 被引量：26

6

作者 杜晓莉 王一成 +4 位作者 吴润 徐丽华 袁秀芳 李军星 周晓丽 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第3期581-587,共7页

2010年以来,全国大部分地区暴发新生仔猪严重流行性腹泻,给养猪业造成巨大经济损失。为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)在浙江省的流行和遗传变异情况,对2010—2013年收集的临床腹泻样品,以针对PEDV-S基因N端序列的RT-PCR检测病原,并测序其... 2010年以来,全国大部分地区暴发新生仔猪严重流行性腹泻,给养猪业造成巨大经济损失。为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)在浙江省的流行和遗传变异情况,对2010—2013年收集的临床腹泻样品,以针对PEDV-S基因N端序列的RT-PCR检测病原,并测序其中的41份样品的扩增序列,分析PEDV-S1基因型变异情况。临床检测结果表明:PEDV临床检出率由2010年的42.86%提高到2013年的70%以上,并且浙江省各地的检出率都在50%以上;一年中7至8月份检出率明显降低。PEDV-S1基因N端序列分析结果表明,临床检测株的S1基因与传统毒株PEDV CV777的S基因序列及中国最早检测到的基因序列亲缘关系较远,可能浙江省PEDV的流行株可能属于一个新的基因型。同时研究结果提示PEDV-S基因的变异可能是现有CV777毒株疫苗免疫保护力不佳的原因。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻 S1基因 遗传变异

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浙江地区猪圆环病毒2型检测及遗传变异分析 被引量：8

7

作者 徐丽华 蓝胜芝 +5 位作者 余斌 李军星 张鹏超 李宝臣 苏菲 袁秀芳 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第11期1970-1977,共8页

为了掌握浙江地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法,对2018年浙江地区猪场采集的临床疑似病料进行PCV2检测,并对部分阳性病料进行全基因扩增、克隆、序列测定和ORF 2遗传进化... 为了掌握浙江地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法,对2018年浙江地区猪场采集的临床疑似病料进行PCV2检测,并对部分阳性病料进行全基因扩增、克隆、序列测定和ORF 2遗传进化树分析。结果显示:329份临床疑似样品中,PCV2阳性率27.4%(90/329),其中宁波地区阳性率最高,为52%;保育猪和肥育猪阳性率最高,分别为38.8%(64/165)和68.8%(11/16)。选取7份病料进行全基因组扩增,每个毒株随机挑选3个或4个阳性克隆进行序列测定,共得到22个毒株进行遗传变异分析。22株病株同源性为93.3%~99.8%,与16个参考毒株同源性为93.5%~99.8%。根据遗传进化树分析,22个毒株分别处于3个分支,其中6株PCV2a,6株PCV2b,10株PCV2d,说明目前浙江地区PCV2d是优势毒株。ORF 2遗传进化树分析显示,ORF 2核苷酸同源性较全基因组核苷酸同源性低,3个分支分别处于PCV2b、PCV2d和PCV2e,预示浙江地区流行毒株可能在向PCV2e转变。本研究掌握了PCV2在浙江地区的流行动态,为浙江省PCV2疫苗株的选择和疫苗研发提供了理论依据。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型(PCV2) 全基因组 ORF 2基因 流行病学调查 遗传变异分析

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猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重RT-PCR鉴别方法的建立 被引量：11

8

作者 刘邓 袁秀芳 +3 位作者 徐丽华 牛登元 王朝文 王一成 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第10期1-5,共5页

根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA... 根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA聚合酶和Mg2+浓度、退火温度(Tm)等PCR反应条件的优化,最终确定该双重RT-PCR的最佳条件为TaqDNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,Mg2+浓度为0.05 mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Tm为51℃。特异性和敏感性检测结果显示,所建立的检测方法具有很好的特异性以及较高的敏感性。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 双重RT—PCR

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2008—2011年浙江省猪主要病毒性疫病病原流行病学调查 被引量：6

9

作者 徐丽华 王一成 +4 位作者 袁秀芳 李军星 路斌 申世川 方维焕 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第3期383-387,共5页

为了解浙江省猪主要病毒性疫病的流行动态,采集近4年来临床病猪病料1 118头份,采用PCR和RT-PCR方法进行猪主要病毒性疫病的病原检测。结果显示,PRRSV,CSFV,JEV,PCV2,PRV,PPV,PEDV和TGEV病原的平均感染率分别为51.71%,15.71%,27.16%,50.8... 为了解浙江省猪主要病毒性疫病的流行动态,采集近4年来临床病猪病料1 118头份,采用PCR和RT-PCR方法进行猪主要病毒性疫病的病原检测。结果显示,PRRSV,CSFV,JEV,PCV2,PRV,PPV,PEDV和TGEV病原的平均感染率分别为51.71%,15.71%,27.16%,50.8%,1.99%,84.4%和9.0%。其中PRRSV,CSFV和PCV2每年都有较高的检出率,仍是浙江省猪场的主要病原;PRV和PPV近年来流行有所下降,该病已得到较好控制;2011年初发现流产病例中JEV的检出比例有明显升高,检出率高达39.29%;2011年2月在刚出生仔猪腹泻病例中PEDV检出率大大提高,造成严重损失。总之,浙江省猪场中PRRSV,CSFV和PCV2仍是防控的重点,但多病原感染或新变异株的出现也是近年来浙江省猪疫病复杂化的主要原因之一。 展开更多

关键词 猪主要病毒性疫病 流行病学调查 PCR RT-PCR

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猪α干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化 被引量：6

10

作者 张存 叶伟成 +3 位作者 王一成 袁秀芳 刘蔓雯 张燕 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第1期6-9,共4页

为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素(PoIFNα)在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/P... 为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素(PoIFNα)在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/PoIFNα以限制性内切酶SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115菌株,经抗性筛选获得4拷贝PoIFNα基因的重组菌株GS115/PoIFNα;重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白,表达量达136mg/L。表达产物经过SP-Sepharose阳离子交换层析,可以得到纯度较高的rPoIFNα,纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108U/mg。 展开更多

关键词 猪Α干扰素 毕赤酵母 分泌表达

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猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立 被引量：5

11

作者 申世川 王一成 +2 位作者 袁秀芳 徐丽华 李军星 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第1期21-26,共6页

基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DN... 基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DNA聚合酶的作用下对PCV-2靶序列进行等温核酸扩增。经过对LAMP反应体系和反应条件的优化,所建立方法在61℃反应1 h能够成功的检测出PCV-2基因组DNA,且操作简单,不需要PCR仪等复杂仪器,结果可经电泳检测及肉眼观察;敏感性和特异性试验表明,所建立的方法能特异地检测PCV-2并且其敏感度可以达到0.5 pg的DNA分子;所建立LAMP方法的阳性检出率与国标PCR的阳性检出率符合度为100%。该研究为PCV-2的现场快速检测提供更加简便、快捷的方法,可以满足基层检疫的需要。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 环介导等温扩增 可视化 快速检测

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双抗体夹心ELISA法测定猪α-干扰素的浓度 被引量：6

12

作者 蒋佳颖 王一成 +3 位作者 杨孝朴 袁秀芳 李军星 徐丽华 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第5期740-745,共6页

为了能够准确测定猪血清中猪α-干扰素（Po IFN-α）含量及猪α-干扰素制品的浓度,本研究以制备并经过亲和层析提纯的兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆抗体为包被抗体,以制备的鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作为二抗,建立了测定猪α-干扰素... 为了能够准确测定猪血清中猪α-干扰素（Po IFN-α）含量及猪α-干扰素制品的浓度,本研究以制备并经过亲和层析提纯的兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆抗体为包被抗体,以制备的鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作为二抗,建立了测定猪α-干扰素浓度的双抗体夹心ELISA法（DAS-ELISA）。通过条件优化,最佳兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆纯化抗体包被浓度为12.5μg·m L^-1,最佳鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作用浓度为6.25μg·m L^-1,利用本实验室制备的已知浓度猪α-干扰素标准蛋白建立标准曲线,确定该方法检测猪α-干扰素浓度范围为0.0781-2.50μg·m L^-1。与Lowry法、冻干称量法测定猪α-干扰素浓度相比较,3种方法检测结果无显著差异,但所建立的双抗体夹心ELISA法能够检测血清中猪α-干扰素浓度,且方法简便。 展开更多

关键词 猪α-干扰素 双抗体夹心ELISA 定量检测

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猪传染性胃肠炎诊断技术研究进展 被引量：4

13

作者 刘邓 袁秀芳 +4 位作者 徐丽华 张存 叶伟成 牛登元 王一成 《动物医学进展》 CSCD 2008年第12期64-68,共5页

猪传染性胃肠炎是一种由冠状病毒引起的以仔猪呕吐、腹泻和脱水为特征的传染病,对养猪业造成了巨大的损失。为此,众多学者对该病的诊断与检测方法进行了大量的研究,建立了临床诊断、病原分离等传统诊断方法,以及大量的免疫学、分子生物... 猪传染性胃肠炎是一种由冠状病毒引起的以仔猪呕吐、腹泻和脱水为特征的传染病,对养猪业造成了巨大的损失。为此,众多学者对该病的诊断与检测方法进行了大量的研究,建立了临床诊断、病原分离等传统诊断方法,以及大量的免疫学、分子生物学诊断方法等。研究猪传染性胃肠炎的诊断与检测方法对防控该病的暴发和传播有重要意义。 展开更多

关键词 猪 传染性胃肠炎 免疫学 分子生物学 诊断

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猪流感诊断方法研究进展 被引量：12

14

作者 王方昆 王一成 +1 位作者 袁秀芳 徐丽华 《动物医学进展》 CSCD 2006年第4期17-21,共5页

猪流感即猪流行性感冒,是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病。其特征为突发,高热,精神沉郁,食欲废绝,呼吸困难,阵发性咳嗽。猪流感的病死率不高,病猪可康复。近年来,随着集约化养猪规模的不断扩大,猪流感对养猪业构成... 猪流感即猪流行性感冒,是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病。其特征为突发,高热,精神沉郁,食欲废绝,呼吸困难,阵发性咳嗽。猪流感的病死率不高,病猪可康复。近年来,随着集约化养猪规模的不断扩大,猪流感对养猪业构成了较大的威胁。此外,猪流感在人流感和禽流感之间发挥着关键性作用,具有重要的公共卫生意义。自1918年首次报道以来,猪流感一直受到人们的广泛关注。研究快速、科学、准确的诊断方法,对于本病的检测和控制具有重要的意义。除常规的临床症状及病理变化诊断外,流感的确诊依赖于实验室诊断方法。文章从病原学、血清学和分子生物学等几个方面对该病的诊断研究进展做了综述。 展开更多

关键词 猪流感 诊断

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一步法TaqMan~探针实时荧光定量RT-PCR快速检测PRRSV的建立及初步应用 被引量：4

15

作者 路斌 袁秀芳 +3 位作者 徐丽华 李军星 郭勇 王一成 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第3期396-403,共8页

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV,JEV,SFV,PRV,PPV无交叉反应;可以检测到10个拷贝数的模板RNA... 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV,JEV,SFV,PRV,PPV无交叉反应;可以检测到10个拷贝数的模板RNA或1个TCID50的PRRSV,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<1%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对72份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出40份阳性,高于常规RT-PCR方法(28份阳性)。建立的荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于PRRSV的实验室快速诊断和流行病学调查。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 实时荧光定量RT-PCR 一步法

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2016—2020年浙江地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析 被引量：2

16

作者 徐丽华 苏菲 +6 位作者 李军星 余斌 叶十一 杨富文 邓利荣 毛慧敏 袁秀芳 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期644-652,共9页

为了解猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)在浙江地区的流行病学特点和遗传变异规律,本研究采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对2016—2020年采自浙江省不同地区猪场的1725份疑似猪圆环病毒2型感染的临床病... 为了解猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)在浙江地区的流行病学特点和遗传变异规律,本研究采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对2016—2020年采自浙江省不同地区猪场的1725份疑似猪圆环病毒2型感染的临床病料进行PCV2的病原学检测,同时对部分阳性样品进行全基因组扩增、克隆和测序,并与GenBank中收录的16株参考株序列进行比对和遗传进化分析。结果表明:PCV2检测阳性的样品有359份,平均阳性率为20.8%,2016—2020年PCV2阳性率分别为38.1%、23.2%、24.1%、12.5%和10.7%;测序所得PCV236个全基因序列的核苷酸同源性为94.0%~99.9%,与国产疫苗株核苷酸同源性为94.7%~98.5%,与参考株核苷酸同源性为92.9%~99.8%;遗传进化分析显示PCV236个全基因序列可分为3个基因型,其中11株为PCV2a型,8株为PCV2b型,17株为PCV2d型,PCV2d为优势基因型;ORF2基因全长分别为705 bp(16株)和702 bp(20株),相互间核苷酸同源性为88.7%~100.0%,与国产疫苗株核苷酸同源性为90.2%~99.6%,与参考株核苷酸同源性为85.0%~100.0%。Cap蛋白的氨基酸序列分析表明,36株序列除了唯一糖基化位点呈高度保守外,存在较多的点突变,且不同基因型具有其代表性突变位点,优势基因型PCV2d的特异性突变位点主要集中在I^(53)、N^(68)、L^(89)、T^(121)、R^(168)、I^(215)。本研究为浙江地区PCV2的免疫预防提供了参考,为新型疫苗的研制积累了有效材料。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 全基因组 CAP蛋白 分子流行病学 遗传变异

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绍兴鸭α-干扰素基因克隆、表达及活性测定 被引量：3

17

作者 叶伟成 张存 +4 位作者 王一成 刘蔓雯 徐丽华 袁秀芳 张燕 《浙江农业学报》 CSCD 2005年第3期115-119,共5页

采用PCR法从绍兴鸭的肝组织基因组DNA中扩增出α干扰素基因,插入pUC18载体,进行序列测定及分析;将成熟α干扰素基因亚克隆到表达载体pET 28α(+)中,并转化入大肠杆菌BL21进行表达;表达产物经复性后,进行抗病毒活性的测定。测序结果表明... 采用PCR法从绍兴鸭的肝组织基因组DNA中扩增出α干扰素基因,插入pUC18载体,进行序列测定及分析;将成熟α干扰素基因亚克隆到表达载体pET 28α(+)中,并转化入大肠杆菌BL21进行表达;表达产物经复性后,进行抗病毒活性的测定。测序结果表明,该基因(sxDuIFN α)由576个核苷酸组成,共编码191个氨基酸。该基因与GenBank公布的鸭α干扰素基因(X84764,AB128861)的核苷酸序列同源性分别为99.3%和99.1%,氨基酸序列同源性均为97.9%。表达载体经IPTG诱导表达出相对分子量为20.7kD的DuIFN α。该产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒(VSV)及鸭瘟弱毒疫苗毒的活性。 展开更多

关键词 绍兴鸭 Α-干扰素 基因克隆 原核表达

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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白研究进展 被引量：6

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作者 刘焕 王一成 +1 位作者 袁秀芳 徐丽华 《动物医学进展》 CSCD 2007年第11期66-70,共5页

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的传染病,对养猪业危害很大。GP5蛋白是PRRSV ORF5基因编码的一个糖基化的囊膜蛋白,具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体。因此,GP5蛋白在PRRSV的致病性、诊断... 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的传染病,对养猪业危害很大。GP5蛋白是PRRSV ORF5基因编码的一个糖基化的囊膜蛋白,具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体。因此,GP5蛋白在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制等方面研究中具有重要意义,是研制基因工程疫苗的最佳候选基因。近年来对GP5蛋白的研究取得了重要的进展,现就GP5蛋白的特征、免疫作用及疫苗等方面做一综述。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白 中和抗体

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大肠杆菌LTB增强PRRSV-GP5蛋白免疫反应的研究 被引量：2

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作者 王朝文 吴润 +4 位作者 王一成 袁秀芳 徐丽华 李军星 路斌 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期12-17,共6页

以猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)主要中和表位所在的糖蛋白GP5为模式抗原,采用肌肉注射、皮下注射和滴鼻免疫方式免疫6～8周龄ICR小鼠,利用间接ELISA检测血清抗体,MTT法检测淋巴细胞增殖.结果表明:三免后GP5弗氏佐剂乳化组小鼠血清抗... 以猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)主要中和表位所在的糖蛋白GP5为模式抗原,采用肌肉注射、皮下注射和滴鼻免疫方式免疫6～8周龄ICR小鼠,利用间接ELISA检测血清抗体,MTT法检测淋巴细胞增殖.结果表明:三免后GP5弗氏佐剂乳化组小鼠血清抗体的水平最高,LTB+GP5免疫组的抗体水平显著高于单独GP5免疫组,肌肉注射免疫组的抗体水平明显高于皮下注射组,滴鼻免疫组没有检测到特异性血清抗体;各GP5免疫组均能不同程度地诱导脾脏B淋巴细胞增殖,其中GP5弗氏佐剂乳化组、LTB+GP5肌肉注射和LTB+GP5皮下注射组B淋巴细胞增殖显著,除了GP5弗氏佐剂乳化免疫组外,其他各免疫组均无明显的脾脏T淋巴细胞增殖反应. 展开更多

关键词 LTB PRRSV GP5蛋白 免疫佐剂

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鸭瘟病毒转移质粒的构建 被引量：2

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作者 张馨月 冉多良 +4 位作者 叶伟成 袁秀芳 王一成 刘蔓雯 张存 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第3期25-29,共5页

为了建立重组鸭瘟病毒技术,构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株TK基因进行测序分析后,将鸭瘟病毒TK-UL24DNA片段克隆于pUC18载体中,构建了质粒pTK;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GF... 为了建立重组鸭瘟病毒技术,构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株TK基因进行测序分析后,将鸭瘟病毒TK-UL24DNA片段克隆于pUC18载体中,构建了质粒pTK;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GFP。鸭瘟病毒TK-UL24测序分析表明鸭瘟强、弱毒株TK基因序列完全相同;转移载体携带Pcmv-GFP-SV40pA表达盒,测序验证其序列与源序列一致。pTK-GFP在脂质体介导下,转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。质粒转染细胞后,绿色荧光蛋白得到了有效的表达,为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 鸭瘟病毒 TK基因 转移载体

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