旨在构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系,本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统,在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变,W38进行缺失,同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞分...旨在构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系,本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统,在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变,W38进行缺失,同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞分选获得48株单克隆细胞系,PCR及测序分析结果显示,其中有14株单克隆细胞系的chNHE1成功发生V33突变、W38缺失以及34-37位氨基酸的密码子同义替换,基因编辑效率为29%。为了验证chNHE1基因编辑DF-1细胞系的遗传稳定性及增殖水平,对传至第25代的细胞系进行测序分析,结果显示,chNHE1基因未发生回复性突变;进一步细胞计数分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系增殖水平未受到影响;为了评价chNHE1基因编辑细胞系抗ALV-J感染的能力,分别利用ALV-J荧光报告病毒(ALV-J-GFP)及ALV-J原型毒株(HPRS-103)对其进行病毒感染试验,荧光观察结果及流式细胞分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI ALV-J-GFP的感染;进一步间接免疫荧光试验、PCR扩增试验以及病毒滴度测定试验结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI HPRS-103毒株及0.1 MOI JL08CH3-1毒株的感染。本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统结合流式细胞分选,成功构建了chNHE1基因编辑细胞系,其可完全抵抗ALV-J的感染,且该细胞系遗传稳定性及增殖活性良好,为建立抗ALV-J感染的新技术提供了理论支持及基因编辑靶点。展开更多
近年来 ,猪伪狂犬病不断传播蔓延 ,给世界养猪业带来了巨大危害 ,因此开发特异性强、敏感性高、简便、快速、能区别疫苗毒和野毒、能检出潜伏感染的诊断方法是防制该病的关键之一。EL ISA方法具有特异、敏感、快速、稳定等特点 ,为广大...近年来 ,猪伪狂犬病不断传播蔓延 ,给世界养猪业带来了巨大危害 ,因此开发特异性强、敏感性高、简便、快速、能区别疫苗毒和野毒、能检出潜伏感染的诊断方法是防制该病的关键之一。EL ISA方法具有特异、敏感、快速、稳定等特点 ,为广大兽医工作者所关注。目前 ,国内外关于 EL ISA在猪伪狂犬病诊断中的应用方面的研究已有不少 ,已有试剂盒出售。笔者综述了应用于猪伪狂犬病诊断的多种 EL ISA方法 ,如直接 EL ISA、间接 EL ISA、竞争 EL ISA、斑点EL ISA、SPA-EL ISA、双抗体夹心 EL ISA、单抗夹心 L AB-EL ISA、血清学鉴别 EL ISA等。这些方法中 ,有测病毒的 ,有测抗体的 ;有单抗介导的 ,有多抗介导的 ;有的还引入了 SPA和 L AB;有的以分子生物学为基础并能够鉴别疫苗毒和野毒。此外 ,还总结了目前所用 EL ISA诊断方法的优点和缺点 。展开更多
文摘旨在构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系,本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统,在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变,W38进行缺失,同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞分选获得48株单克隆细胞系,PCR及测序分析结果显示,其中有14株单克隆细胞系的chNHE1成功发生V33突变、W38缺失以及34-37位氨基酸的密码子同义替换,基因编辑效率为29%。为了验证chNHE1基因编辑DF-1细胞系的遗传稳定性及增殖水平,对传至第25代的细胞系进行测序分析,结果显示,chNHE1基因未发生回复性突变;进一步细胞计数分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系增殖水平未受到影响;为了评价chNHE1基因编辑细胞系抗ALV-J感染的能力,分别利用ALV-J荧光报告病毒(ALV-J-GFP)及ALV-J原型毒株(HPRS-103)对其进行病毒感染试验,荧光观察结果及流式细胞分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI ALV-J-GFP的感染;进一步间接免疫荧光试验、PCR扩增试验以及病毒滴度测定试验结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI HPRS-103毒株及0.1 MOI JL08CH3-1毒株的感染。本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统结合流式细胞分选,成功构建了chNHE1基因编辑细胞系,其可完全抵抗ALV-J的感染,且该细胞系遗传稳定性及增殖活性良好,为建立抗ALV-J感染的新技术提供了理论支持及基因编辑靶点。
文摘近年来 ,猪伪狂犬病不断传播蔓延 ,给世界养猪业带来了巨大危害 ,因此开发特异性强、敏感性高、简便、快速、能区别疫苗毒和野毒、能检出潜伏感染的诊断方法是防制该病的关键之一。EL ISA方法具有特异、敏感、快速、稳定等特点 ,为广大兽医工作者所关注。目前 ,国内外关于 EL ISA在猪伪狂犬病诊断中的应用方面的研究已有不少 ,已有试剂盒出售。笔者综述了应用于猪伪狂犬病诊断的多种 EL ISA方法 ,如直接 EL ISA、间接 EL ISA、竞争 EL ISA、斑点EL ISA、SPA-EL ISA、双抗体夹心 EL ISA、单抗夹心 L AB-EL ISA、血清学鉴别 EL ISA等。这些方法中 ,有测病毒的 ,有测抗体的 ;有单抗介导的 ,有多抗介导的 ;有的还引入了 SPA和 L AB;有的以分子生物学为基础并能够鉴别疫苗毒和野毒。此外 ,还总结了目前所用 EL ISA诊断方法的优点和缺点 。
