利用CRISPR/Cas9技术敲除BnERF019降低甘蓝型油菜对黑胫病的抗性

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作者 赵丽丽 郭晨 +7 位作者 牟春雨 李子钦 潘勇 燕孟娇 魏玉龙 史志丹 王胜国 皇甫海燕 《中国油料作物学报》 北大核心 2025年第2期319-327,共9页

为辅助抗病育种,研究被油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)诱导96 h后上调表达的转录因子BnERF019的功能。采用Golden Gate载体构建系统,改造基因编辑载体pHS-BnERF019,构建油菜转录因子BnERF019基因的CRISPR/Cas9多拷贝靶标基因编... 为辅助抗病育种,研究被油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)诱导96 h后上调表达的转录因子BnERF019的功能。采用Golden Gate载体构建系统,改造基因编辑载体pHS-BnERF019,构建油菜转录因子BnERF019基因的CRISPR/Cas9多拷贝靶标基因编辑体系,使用农杆菌介导的遗传转化,通过侵染油菜下胚轴,将基因编辑载体pHS-BnERF019导入甘蓝型油菜Westar,共获得28株基因编辑阳性再生苗,阳性率为32.18%,其中靶标BnaC07g13470D序列编辑苗15株,靶标BnaA07g10270D序列编辑苗19株,靶标BnaA09g30360D序列编辑苗18株,靶标BnaC05g18050D序列编辑苗23株,3株再生苗发生单拷贝靶标基因编辑,11株再生苗发生双拷贝靶标位点基因编辑,6株再生苗发生三拷贝靶标位点基因编辑,8株再生苗发生了四拷贝靶标位点基因编辑。对突变苗和WT进行黑胫病抗性鉴定结果显示,四拷贝基因编辑再生苗抗病性显著弱于野生型苗。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 甘蓝型油菜 转录因子 BnERF019 遗传转化

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蛋白质组学及植物蛋白质组学研究进展 被引量：26

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作者 皇甫海燕 官春云 +1 位作者 郭宝顺 张秀英 《作物研究》 2006年第5期577-581,共5页

随着功能基因组学研究的深入进入了蛋白质组学的研究。阐述了蛋白质组学和植物蛋白质组学的概念及研究的技术手段、应用,同时综述了蛋白质组学和植物蛋白质组学研究的策略和趋势。

关键词 蛋白质 基因 蛋白质组学 植物蛋白质组学

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ISSR标记分析油菜黑胫病原菌遗传多样性 被引量：6

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作者 郝丽芬 宋培玲 +2 位作者 李子钦 皇甫海燕 李强生 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期98-105,共8页

利用ISSR分子标记技术分析了油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）的遗传多样性。分离获得国内菌株84株，并以15株国外（英国、加拿大、波兰）油菜黑胫病菌菌株作为参照，利用筛选出的24条引物对这99株病原菌进行ISSR—PCR扩增。共... 利用ISSR分子标记技术分析了油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）的遗传多样性。分离获得国内菌株84株，并以15株国外（英国、加拿大、波兰）油菜黑胫病菌菌株作为参照，利用筛选出的24条引物对这99株病原菌进行ISSR—PCR扩增。共扩增出245条带，遗传相似性系数为0．65～1．00，国内和国外油菜黑胫病菌菌株很明显被分为两个菌群，中国84株菌基本按地理来源分为5个类群，只有江苏省菌株分布于各个类群。各省的Nei’s基因多样性指数范围是0．1081～0．2527，而香农（Shannon’S）信息指数的范围是0．1575～0．3726，顺序为江苏〉湖北〉安徽〉内蒙古〉上海〉四川。中国与英国和加拿大菌株的遗传一致度分别为0．8343和0．7839。 展开更多

关键词 油菜黑胫病 LEPTOSPHAERIA biglobosa ISSR 遗传多样性 地理来源

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甘蓝型油菜BnNAC61基因的克隆及表达特征分析 被引量：2

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作者 郝丽芬 燕孟娇 +5 位作者 皇甫海燕 宋培玲 房永雨 贾晓清 李子钦 韩冰 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期452-461,共10页

NAC(即NAM、ATAF和CUC)转录因子参与植物生长、发育、衰老和多种逆境胁迫反应的调控。为阐释甘蓝型油菜BnNAC61的表达特征,本研究采用RT-PCR方法,从甘蓝型油菜总cDNA中克隆BnNAC61基因。生物信息学分析表明,其CDS全长846 bp,编码281个... NAC(即NAM、ATAF和CUC)转录因子参与植物生长、发育、衰老和多种逆境胁迫反应的调控。为阐释甘蓝型油菜BnNAC61的表达特征,本研究采用RT-PCR方法,从甘蓝型油菜总cDNA中克隆BnNAC61基因。生物信息学分析表明,其CDS全长846 bp,编码281个氨基酸,N端含有NAM保守结构域;其启动子区存在W-box、响应抗性和胁迫、ABA、MeJA的顺式作用元件。利用烟草瞬时表达系统进行亚细胞定位,结果发现BnNAC61定位在细胞核。酵母试验表明,BnNAC61属于转录激活子,转录激活区位于136~208 aa区段。利用qRT-PCR研究BnNAC61的表达模式,结果表明,黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)接种处理后,BnNAC61被显著诱导上调表达;逆境胁迫PEG、NaCl、4℃处理后BnNAC61被不同程度地诱导表达,表现先升高后降低的趋势;激素SA、MeJA和ACC处理后Bn⁃NAC61表达量显著高于对照(P<0.05),而激素ABA处理后,BnNAC61表达被抑制。上述结果表明BnNAC61是参与多种逆境胁迫的转录因子,尤其可能在茉莉酸和乙烯信号途径中发挥重要作用。 展开更多

关键词 甘蓝型油菜 BnNAC61基因 亚细胞定位 转录激活 表达分析

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甘蓝型油菜早熟品种比较试验 被引量：7

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作者 靳芙蓉 刘睿洋 +1 位作者 皇甫海燕 官春云 《作物研究》 2012年第3期219-223,共5页

为筛选适合湖南双季稻区冬季种植的双低早熟油菜品种,2010～2011年在长沙引进12个油菜品种进行比较试验。结果表明:青杂3号和青杂7号生育期最短,为195 d,比对照(杂1613)早4 d,但产量较低,而G-11产量最高,达3 122.55 kg/hm2,比对照增产18... 为筛选适合湖南双季稻区冬季种植的双低早熟油菜品种,2010～2011年在长沙引进12个油菜品种进行比较试验。结果表明:青杂3号和青杂7号生育期最短,为195 d,比对照(杂1613)早4 d,但产量较低,而G-11产量最高,达3 122.55 kg/hm2,比对照增产18.76%,生育期比对照短2 d。通过对12个参试品种的综合考察,2010-14、早0902、G-7和G-11产量优势明显,早熟性强,适宜在湖南地区种植。 展开更多

关键词 油菜 早熟 品种 比较

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高油酸油菜的研究进展及前景 被引量：9

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作者 张秀英 皇甫海燕 +1 位作者 陈菁菁 官春云 《作物研究》 2007年第B12期654-656,661,共4页

阐述了油菜高油酸研究的意义;高油酸油菜育种的国内外研究进展及现状;油菜脂肪酸合成过程中油酸形成的机理,其主要是受脂肪酸减饱和酶基因(f ad 2)的控制;油酸性状与环境条件的关系;着重介绍了目前从育种方面提高油酸含量的三条主要途... 阐述了油菜高油酸研究的意义;高油酸油菜育种的国内外研究进展及现状;油菜脂肪酸合成过程中油酸形成的机理,其主要是受脂肪酸减饱和酶基因(f ad 2)的控制;油酸性状与环境条件的关系;着重介绍了目前从育种方面提高油酸含量的三条主要途径和控制油酸性状的遗传基础,以及油菜高油酸在最近一段时间的良好发展前景。 展开更多

关键词 油菜 高油酸 育种

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油菜黑胫病抗性相关基因BnWRKY70的功能研究 被引量：5

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作者 燕孟娇 石嵘 +5 位作者 郝丽芬 皇甫海燕 宋培玲 贾晓清 皇甫九茹 李子钦 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期127-133,共7页

WRKY转录因子是植物信号传导过程中的重要成员,在植物抗病过程中发挥着重要作用。为了解BnWRKY70在油菜黑胫病抗性反应中的作用机理,本研究对油菜响应黑胫病菌侵染产生的特异基因BnWRKY70进行序列分析;将克隆得到BnWRKY70基因CDS 308bp... WRKY转录因子是植物信号传导过程中的重要成员,在植物抗病过程中发挥着重要作用。为了解BnWRKY70在油菜黑胫病抗性反应中的作用机理,本研究对油菜响应黑胫病菌侵染产生的特异基因BnWRKY70进行序列分析;将克隆得到BnWRKY70基因CDS 308bp特异区段,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)载体构建了基于病毒诱导的油菜基因沉默体系;利用qRT-PCR验证目的基因的表达水平;最后进一步通过表型观察和病情指数统计分析评价BnWRKY70基因沉默植株在接种黑胫病菌之后油菜的抗病性。结果表明,BnWRKY70基因最长ORF为858bp,编码285个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域,属于Ⅲ类WRKY转录因子。BnWRKY70基因沉默后的表达量显著下降,说明在油菜中成功构建了VIGS体系。表型观察发现基因沉默油菜株系叶片比未沉默株系更易感病,病斑面积更大,且病情指数显著高于对照,说明BnWRKY70基因沉默减弱了油菜的抗病性。本研究为揭示BnWRKY70在油菜病原菌分子互作机制中的作用奠定基础。 展开更多

关键词 油菜 黑胫病 病毒诱导的基因沉默(VIGS) BnWRKY70基因

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油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)对戊唑醇的抗药性风险评估

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作者 赵丽丽 李子钦 +7 位作者 史志丹 牟春雨 皇甫海燕 齐桂强 宋培玲 燕孟娇 皇甫九茹 杨永青 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期182-190,共9页

为明确油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)对杀菌剂戊唑醇的抗药性风险,通过生长速率法测定了119株核盘菌对戊唑醇的敏感性基线,通过紫外诱导结合药剂筛选获得2株抗药性菌株,开展了抗药性遗传稳定性、菌丝生长速率、产菌核能力、致... 为明确油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)对杀菌剂戊唑醇的抗药性风险,通过生长速率法测定了119株核盘菌对戊唑醇的敏感性基线,通过紫外诱导结合药剂筛选获得2株抗药性菌株,开展了抗药性遗传稳定性、菌丝生长速率、产菌核能力、致病力、靶基因序列分析及表达量测定等研究。结果显示:119株油菜核盘菌对戊唑醇的EC50值范围为0.0121~0.8907μg/mL,平均值为0.2403±0.1365μg/mL,呈单峰曲线分布,未发现田间抗药性菌株;经室内诱导获得2株抗药性菌株19AH-5A、19AH-5C,对戊唑醇的EC50值分别是野生型敏感菌株的5.857和12.903倍;此外,抗药性菌株19AH-5C的生物学特性与敏感菌株无显著差异,而19AH-5A的致病力下降严重;2株抗药性菌株中戊唑醇靶标蛋白的编码基因CYP51的碱基序列与敏感菌株完全一致,未发现可引起氨基酸改变的碱基突变,但在戊唑醇培养条件下,抗药性菌株19AH-5C中靶基因CYP51的表达量显著上调3.72倍。油菜核盘菌在戊唑醇选择压力下可产生抗药性菌株,根据119株核盘菌的敏感性基线以及抗性菌株的环境适合度研究结果判断,油菜核盘菌对戊唑醇存在中等抗药性风险,因此使用戊唑醇防治油菜菌核病时应持续开展病原菌抗药性水平监测,同时可将不同作用类型杀菌剂交替使用以延缓田间抗药性的发生。 展开更多

关键词 油菜 核盘菌 戊唑醇 抗药性

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湘油15 PGIP9蛋白基因的克隆和蛋白序列结构分析及原核表达 被引量：2

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作者 刘睿洋 皇甫海燕 +1 位作者 靳芙蓉 官春云 《作物研究》 2012年第2期134-138,共5页

运用生物信息学软件对湘油15 PGIP9基因的核苷酸、蛋白氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。结果表明:湘油15 PGIP9编码区CDS长1 011 bp,编码336个氨基酸的开放阅读框,分子量为37.5kDa,等电点为7.9。N端1～22个氨基酸是信号肽,... 运用生物信息学软件对湘油15 PGIP9基因的核苷酸、蛋白氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。结果表明:湘油15 PGIP9编码区CDS长1 011 bp,编码336个氨基酸的开放阅读框,分子量为37.5kDa,等电点为7.9。N端1～22个氨基酸是信号肽,且这一区域疏水性较强,具有5个潜在的N-糖基化位点。N端和C端还各具有4个参与二硫键形成的半胱氨酸残基。二级结构显示有11个α-螺旋,14个β-延伸和25个无规则卷曲。中心LRR结构域由6个串联的LRR基序组成。随后将PGIP9的CDS序列亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建pET-32a-PGIP9重组表达质粒,并转化E.coil BL21(DE3),25℃,终浓度为0.2 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导2 h,都成功的表达了融合蛋白pET-32a-PGIP9,其分子量约为52kDa,发现主要以包涵体形式存在,没有可溶形式的蛋白表达。 展开更多

关键词 甘蓝型油菜 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 原核表达 序列分析 结构预测

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农杆菌介导油菜黑胫病菌遗传转化 被引量：3

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作者 宋培玲 皇甫海燕 +7 位作者 史志丹 燕孟娇 郝丽芬 皇甫九茹 贾晓清 郭晨 杨永青 李子钦 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期293-299,共7页

为优化建立农杆菌介导的油菜黑胫病菌遗传转化技术体系,以携带潮霉素磷酸转移酶基因的pCH-sGFP为载体,农杆菌LBA4404为介体,对油菜黑胫病菌的分生孢子进行转化。油菜黑胫病菌的最佳转化体系为:分生孢子浓度10^(6)个/mL,农杆菌OD600值0.6... 为优化建立农杆菌介导的油菜黑胫病菌遗传转化技术体系,以携带潮霉素磷酸转移酶基因的pCH-sGFP为载体,农杆菌LBA4404为介体,对油菜黑胫病菌的分生孢子进行转化。油菜黑胫病菌的最佳转化体系为:分生孢子浓度10^(6)个/mL,农杆菌OD600值0.6,乙酰丁香酮浓度200μmol/mL,pH 5.8,25℃,共培养4 d,获得120~161个转化子。随机选取26个转化子连续培养5代能够稳定遗传,绿色荧光蛋白基因gfp表达的菌丝和孢子可见绿色荧光。PCR鉴定发现T-DNA已整合进油菜黑胫病菌基因组中,Southern blot鉴定发现T-DNA以单拷贝的形式插入黑胫病菌中,转化子均能够稳定遗传。建立油菜黑胫病菌遗传转化体系为该病菌的致病机制研究和功能基因分析奠定了基础。 展开更多

关键词 油菜黑胫病菌 遗传转化 转化子

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黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)在油菜叶片和茎中的侵染过程观察

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作者 史志丹 宋培玲 +6 位作者 郝丽芬 皇甫海燕 燕孟娇 杨永青 吴晶 赵丽丽 李子钦 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期286-292,共7页

为明确黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)在甘蓝型油菜叶片和茎中的侵染及扩展过程,利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的黑胫病菌株接菌油菜叶片,利用激光共聚焦显微镜观察菌株在油菜叶片和茎中的侵染过程。结果表明,接种油菜叶片7 h后,分生... 为明确黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)在甘蓝型油菜叶片和茎中的侵染及扩展过程,利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的黑胫病菌株接菌油菜叶片,利用激光共聚焦显微镜观察菌株在油菜叶片和茎中的侵染过程。结果表明,接种油菜叶片7 h后,分生孢子萌发并长出芽管;17 h后,芽管侵入气孔;24 h后,分生孢子全部萌发;36 h后萌发的芽管形成菌丝;120 h后,菌丝在叶片表皮细胞间隙蔓延,并侵入叶肉细胞。13 d后,菌丝侵入茎部皮层组织;15 d后,菌丝在皮层细胞间隙蔓延,并侵染至茎表皮;21 d后,菌丝侵染至维管组织;23 d后,菌丝侵染至茎韧皮部;25 d后,茎导管被侵染,并向木质部扩展。本研究发现的L. biglobosa在油菜叶片和茎中的侵染过程,可为油菜与黑胫病菌互作的研究、黑胫病致病机理及防治提供参考。 展开更多

关键词 甘蓝型油菜 黑胫病菌 侵染过程 绿色荧光蛋白

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