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共表达分子伴侣PDI和转录因子Aft1对毕赤酵母表达人溶菌酶的影响 被引量：4
1
作者 王儒昕 韩琴 +4 位作者 陈园园 吴菁 闫达中 刘军 李鑫 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第10期124-130,共7页
通过共表达分子伴侣二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)和毕赤酵母转录因子Aft1,提高重组人溶菌酶(human lysozyme,HLY)在毕赤酵母中的分泌表达水平。将构建的分子伴侣表达载体pG418-PDI和毕赤酵母转录因子Aft1表达载体pG41... 通过共表达分子伴侣二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)和毕赤酵母转录因子Aft1,提高重组人溶菌酶(human lysozyme,HLY)在毕赤酵母中的分泌表达水平。将构建的分子伴侣表达载体pG418-PDI和毕赤酵母转录因子Aft1表达载体pG418-Aft1线性化后,电击转化重组毕赤酵母KM71-HLY细胞,用含G418的平板筛选阳性转化子,得到共表达分子伴侣PDI和HLY,及共表达毕赤酵母转录因子Aft1和HLY的工程菌株KM71-HLYpG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1。摇瓶发酵分析共表达PDI和Aft1对HLY表达水平的影响。结果表明,工程菌KM71-HLY、KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1经甲醇诱导均产生14.7 kDa HLY,发酵上清液在含溶壁微球菌平板上出现抑菌圈。在诱导表达前期,KM71-HLY-pG418-PDI、KM71-HLY-pG418-Aft1和KM71-HLY生长量无明显差别;70 h后,KM71-HLY-pG418-PDI菌株和KM71-HLY-pG418-Aft1菌株生物量少于KM71-HLY,发酵最终生长量分别为KM71-HLY的92.8%与84.1%。KM71-HLY、KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1经168 h甲醇诱导,胞外分泌总蛋白量分别为324.02、350.87 mg/L和474.8 mg/L,发酵液酶活力分别为34880、45600 U/mL和50180 U/mL。与KM71-HLY相比,KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1发酵产胞外总蛋白分别增加了8.3%和46.5%;KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1所产胞外溶菌酶总酶活力较KM71-HLY分别增加了30.7%和43.9%。 展开更多
关键词 人溶菌酶 分子伴侣 转录因子 共表达 毕赤酵母
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敲除ptsG基因及共表达透明颤菌血红蛋白提高大肠杆菌SHMT产量 被引量：1
2
作者 韩琴 徐新星 +4 位作者 王儒昕 李鑫 闫达中 吴菁 刘军 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第2期119-125,共7页
利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的ptsG基因,得到ptsG基因缺失菌株BL21(DE3)ΔptsG。构建重组质粒,得到表达大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)工程菌株BL21(DE3)/pET-glyA、BL21(DE3)ΔptsG/... 利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的ptsG基因,得到ptsG基因缺失菌株BL21(DE3)ΔptsG。构建重组质粒,得到表达大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)工程菌株BL21(DE3)/pET-glyA、BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA,及共表达SHMT和透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)工程菌株BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV。在LB培养基中,BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株与BL21(DE3)/pET-glyA菌株生长情况没有明显差异,BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV菌株稳定期的OD 600 nm值比BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.3%,在LBG培养基中,稳定期BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株OD600 nm值比BL21(DE3)/pET-glyA菌株提高了19.4%,BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV菌株OD600 nm值比BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.5%。在LBG培养基中,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,与对照菌株BL21(DE3)/pET-28a相比较,两种单表达工程菌株产SHMT活力分别是其6.4倍和7.7倍,共表达工程菌株产SHMT活力是其9.6倍。实验结果表明,敲除ptsG基因能够增加大肠杆菌在含葡萄糖培养基中的生长量及SHMT表达量,共表达VHb能进一步提高菌株生长量和SHMT产量。 展开更多
关键词 RED同源重组 丝氨酸羟甲基转移酶 透明颤菌血红蛋白 ptsG基因 共表达
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葡萄糖亚适量补加胁迫裂殖壶菌胞内类胡萝卜素积累 被引量：1
3
作者 程启坤 王儒昕 +2 位作者 王攀攀 李鑫 刘军 《中国油脂》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期102-107,134,共7页
为探究裂殖壶菌积累类胡萝卜素的营养胁迫调控手段,考察了发酵中期(72 h起),不同葡萄糖补加质量浓度、酵母提取物补加质量浓度对裂殖壶菌生长、油脂合成和类胡萝卜素合成的影响。结果表明:仅补加较低质量浓度葡萄糖时,裂殖壶菌生物量和... 为探究裂殖壶菌积累类胡萝卜素的营养胁迫调控手段,考察了发酵中期(72 h起),不同葡萄糖补加质量浓度、酵母提取物补加质量浓度对裂殖壶菌生长、油脂合成和类胡萝卜素合成的影响。结果表明:仅补加较低质量浓度葡萄糖时,裂殖壶菌生物量和油脂产量虽较低,但胞内类胡萝卜素含量较高;在5 L发酵罐中、发酵中期,采用溶氧反馈控制葡萄糖流加策略,人为制造葡萄糖亚适量补加条件,在发酵98 h时胞内类胡萝卜素含量达到最大,为151.0μg/g,相比葡萄糖充足供应条件下的水平提高了4倍以上。综合发酵实验结果和裂殖壶菌代谢途径分析,可推测:油脂合成期葡萄糖亚适量补加可限制细胞生长、弱化裂殖壶菌胞内油脂合成途径,胁迫碳源流向类胡萝卜素合成途径,促进类胡萝卜素的大量积累。 展开更多
关键词 裂殖壶菌 类胡萝卜素 碳源 油脂
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