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基于纳米孔Cas9靶向测序的金黄色葡萄球菌快速检测与分型
1
作者
潘抒凡
杨栋磊
王鹏飞
《上海交通大学学报(医学版)》
北大核心
2025年第6期774-783,共10页
目的·利用纳米孔Cas9靶向测序(nanopore Cas9-targeted sequencing,nCATS)技术实现金黄色葡萄球菌的快速检测,并同时进行葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,spa)分型和葡萄球菌盒式染色体mec(staphylococcal cassette chromo...
目的·利用纳米孔Cas9靶向测序(nanopore Cas9-targeted sequencing,nCATS)技术实现金黄色葡萄球菌的快速检测,并同时进行葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,spa)分型和葡萄球菌盒式染色体mec(staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec)分型。方法·以spa基因和SCCmec基因元件作为靶向测序的2个目标区域(region of interest,ROI),设计4种CRISPR RNA(crRNA),使其构成的Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)能够靶向切割2个ROI两侧的序列;针对每种crRNA设计42 bp的模拟靶标DNA。通过Cas9 RNP切割效率测试,筛选合适的crRNA,优化切割体系,选择切割反应时间和Cas9 RNP合成温度。提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)菌株基因组DNA,末端去磷酸化,在切割后的ROI两侧末端加上dA尾,与测序接头连接后利用纳米孔机器进行测序。对测序结果数据的质量值进行分析,并将测得的核酸序列分别与mecA、spa和SCCmec数据库进行比对,根据比对结果判断样本中是否含有金黄色葡萄球菌,是否为MRSA,并同时获得其spa分型和SCCmec分型。结果·共设计出2组crRNA,经电泳图灰度分析,筛选出切割效率更高的一组用于后续实验。切割效率优化结果显示,Cas9 RNP与靶标DNA比例为1∶1,切割反应时间为15 min,Cas9 RNP合成温度为25℃时,Cas9 RNP切割效率可达87.41%。nCATS测序质量值集中在15(Q15)和20(Q20)之间,表明测序准确度约为99%。测序结果与mecA、spa和SCCmec数据库比对后得出菌株样本的spa分型为t2,并且是SCCmecⅡ型。相同菌株样本经PCR扩增后测序和多重PCR验证,结果均与nCATS结果一致。结论·利用nCATS技术能够实现金黄色葡萄球菌的快速检测,并能同时获得spa分型和SCCmec分型。
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关键词
金黄色葡萄球菌
纳米孔Cas9靶向测序
细菌分型
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题名
基于纳米孔Cas9靶向测序的金黄色葡萄球菌快速检测与分型
1
作者
潘抒凡
杨栋磊
王鹏飞
机构
上海交通大学医学院附属仁济医院
上海交通大学医学院分子医学研究院
出处
《上海交通大学学报(医学版)》
北大核心
2025年第6期774-783,共10页
基金
上海地方高水平大学创新团队项目(SHSMU-ZLCX20212602)。
文摘
目的·利用纳米孔Cas9靶向测序(nanopore Cas9-targeted sequencing,nCATS)技术实现金黄色葡萄球菌的快速检测,并同时进行葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,spa)分型和葡萄球菌盒式染色体mec(staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec)分型。方法·以spa基因和SCCmec基因元件作为靶向测序的2个目标区域(region of interest,ROI),设计4种CRISPR RNA(crRNA),使其构成的Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)能够靶向切割2个ROI两侧的序列;针对每种crRNA设计42 bp的模拟靶标DNA。通过Cas9 RNP切割效率测试,筛选合适的crRNA,优化切割体系,选择切割反应时间和Cas9 RNP合成温度。提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)菌株基因组DNA,末端去磷酸化,在切割后的ROI两侧末端加上dA尾,与测序接头连接后利用纳米孔机器进行测序。对测序结果数据的质量值进行分析,并将测得的核酸序列分别与mecA、spa和SCCmec数据库进行比对,根据比对结果判断样本中是否含有金黄色葡萄球菌,是否为MRSA,并同时获得其spa分型和SCCmec分型。结果·共设计出2组crRNA,经电泳图灰度分析,筛选出切割效率更高的一组用于后续实验。切割效率优化结果显示,Cas9 RNP与靶标DNA比例为1∶1,切割反应时间为15 min,Cas9 RNP合成温度为25℃时,Cas9 RNP切割效率可达87.41%。nCATS测序质量值集中在15(Q15)和20(Q20)之间,表明测序准确度约为99%。测序结果与mecA、spa和SCCmec数据库比对后得出菌株样本的spa分型为t2,并且是SCCmecⅡ型。相同菌株样本经PCR扩增后测序和多重PCR验证,结果均与nCATS结果一致。结论·利用nCATS技术能够实现金黄色葡萄球菌的快速检测,并能同时获得spa分型和SCCmec分型。
关键词
金黄色葡萄球菌
纳米孔Cas9靶向测序
细菌分型
Keywords
Staphylococcus aureus
nanopore Cas9-targeted sequencing(nCATS)
bacterial typing
分类号
R446.5 [医药卫生—诊断学]
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题名
作者
出处
发文年
被引量
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1
基于纳米孔Cas9靶向测序的金黄色葡萄球菌快速检测与分型
潘抒凡
杨栋磊
王鹏飞
《上海交通大学学报(医学版)》
北大核心
2025
0
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