引起猪腹泻的病毒分离鉴定 被引量：8

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作者 林庆燕 陈书琨 +14 位作者 孙洁 唐金明 陈兵 卢体康 刘建利 廖立珊 曾少灵 祁振强 阮周曦 吕建强 杨俊兴 曹琛福 张彩虹 花群义 秦智锋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第10期75-79,共5页

为了对近年来引起仔猪腹泻的主要病毒进行分离鉴定,进而为疫苗的研发奠定基础,自2011年开始,从华南地区猪场连续3年检测出多个引起猪腹泻症状的病毒。其中2011年采用MA-104细胞系从临床样品小肠内容物中分离到猪流行性腹泻病毒(PEDV)和... 为了对近年来引起仔猪腹泻的主要病毒进行分离鉴定,进而为疫苗的研发奠定基础,自2011年开始,从华南地区猪场连续3年检测出多个引起猪腹泻症状的病毒。其中2011年采用MA-104细胞系从临床样品小肠内容物中分离到猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA),临床样品为2种病毒的混合感染。2012年分离到PEDV、PRoVA和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)3种病毒,临床样品为3种病毒混合感染。2013年从临床样品中只分离到PEDV 1种病毒。通过在Vero-76传代细胞系中前3代加入胰酶和猪胰酶,自第4代仅加入胰酶的方法,成功克服了PEDV的细胞毒性,实现了连续传代,并在第8代出现了细胞病变(CPE)。通过采用IgY抗体对PEDV和PRoVA混合感染的MA-104细胞培养液连续中和和传代,成功分离纯化到猪轮状病毒A。对9个猪场的3年猪腹泻病毒性疾病流行病学调查表明,2011年—2013年主要是以PED流行为主。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 分离纯化 流行病学调查

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猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：15

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作者 李军 蔡良语 +9 位作者 陈兵 刘建利 孙洁 陈书琨 林庆燕 陶虹 吴绍强 卢体康 陈金顶 秦智锋 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期801-805,共5页

为对引起腹泻症状的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA) 3种病毒同时快速地鉴别检测,本研究对GenBank中登录的TGEV的S基因、PEDV的S基因、PRo VA的NSP基因进行序列分析,分别设计了针对3种病毒的特... 为对引起腹泻症状的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA) 3种病毒同时快速地鉴别检测,本研究对GenBank中登录的TGEV的S基因、PEDV的S基因、PRo VA的NSP基因进行序列分析,分别设计了针对3种病毒的特异性引物和用3种荧光基团标记的核酸探针,通过条件优化建立了针对这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能够特异性检测PEDV、TGEV和PRo VA,而与其它病原无交叉反应;对TGEV、PEDV和PRo VA的最低检测量分别为1.12拷贝/μL、39拷贝/μL和25拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于5%;该方法与商品化的试剂盒检测结果符合率达100%。该方法快速、敏感,检测结果准确可靠,为猪病毒性腹泻疾病的流行病学调查和分子生物学快速诊断奠定了基础。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 猪流行性腹泻病毒 猪轮状病毒A 荧光定量RT-PCR检测 多重检测

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基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株 被引量：8

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作者 秦智锋 刘建利 +10 位作者 卢体康 林庆燕 吕建强 曹琛福 阮周曦 曾少灵 陈书琨 廖立珊 孙洁 张彩虹 花群义 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期719-723,共5页

为鉴别新城疫病毒(NDV)强毒株和弱毒株,本研究建立了基于新型锁核酸(LNA)探针的实时荧光RT-PCR检测方法(Duplex LNA rRT-PCR)。该方法针对NDVF基因裂解位点设计了两条新型LNA探针,通过对11株NDV株进行大将军脂duplex LNA rRT-PCR检测方... 为鉴别新城疫病毒(NDV)强毒株和弱毒株,本研究建立了基于新型锁核酸(LNA)探针的实时荧光RT-PCR检测方法(Duplex LNA rRT-PCR)。该方法针对NDVF基因裂解位点设计了两条新型LNA探针,通过对11株NDV株进行大将军脂duplex LNA rRT-PCR检测方法检测,验证该方法的特异性;通过对副粘病毒I型(APMV-1)和NDV中强毒株(vNDV)不同浓度病毒液进行检测,确定该方法的灵敏度,并与TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法进行比较。结果显示本研究所建立的方法对11株NDV检测的特异性为100%(11/11),优于TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法(10/11);所建立的duplex LNA rRT-PCR方法检测中强毒株F48E9和弱毒株LaSota的灵敏度分别为10个EID50和0.1个EID50,比美国农业部推荐的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法低10倍。本研究利用新型LNA探针技术,建立了鉴别NDV中强毒株与弱毒株的duplex LNA rRT-PCR检测方法,可以特异性检测NDV并有效区分中强毒株与弱毒株,适合用于鸡场和进出境动物产品中NDV的快速检测。 展开更多

关键词 新城疫病毒 中强毒株 弱毒株 LNA RT-PCR 鉴别检测

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非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立 被引量：20

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作者 曾少灵 花群义 +10 位作者 张彩虹 曹琛福 秦智锋 阮周曦 杨俊兴 卢体康 吕建强 孙洁 陈兵 林庆燕 杨云庆 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第10期6-10,共5页

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白基因vp73的序列,设计一对特异性检测引物,扩增片段251 bp,建立了检测ASFV的PCR方法。与OIE推荐使用的2组PCR引物进行比对试验,结果表明,3组引物的检测特异性相当,但本研究设计的引物灵敏度... 根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白基因vp73的序列,设计一对特异性检测引物,扩增片段251 bp,建立了检测ASFV的PCR方法。与OIE推荐使用的2组PCR引物进行比对试验,结果表明,3组引物的检测特异性相当,但本研究设计的引物灵敏度至少高出100倍。表明所建立的PCR方法能敏感、快速地检测非洲猪瘟病毒。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 聚合酶链反应 检测

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非洲猪瘟病毒VP73蛋白在昆虫细胞中的表达与间接ELISA方法的建立 被引量：17

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作者 曾少灵 廖立珊 +11 位作者 唐金明 杨俊兴 阮周曦 张彩虹 曹琛福 吕建强 秦智锋 林庆燕 孙洁 叶弈优 谢晓露 花群义 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第1期1-6,共6页

为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(iELISA),利用杆状病毒表达载体pFastBac HTA在昆虫细胞Sf9中表达非洲猪瘟病毒的VP73蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测显示重组蛋白大小约65ku,能与ASFV标准阳性血清发生特异性结合... 为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(iELISA),利用杆状病毒表达载体pFastBac HTA在昆虫细胞Sf9中表达非洲猪瘟病毒的VP73蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测显示重组蛋白大小约65ku,能与ASFV标准阳性血清发生特异性结合。以此重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测ASFV血清抗体的iELISA方法。表达的重组蛋白具有良好的特异性,为制备ASFV免疫血清学诊断检测试剂和疫苗提供了材料。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 VP73蛋白 间接ELISA

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美洲型猪蓝耳病病毒高致病性变异株RT-LAMP检测方法的建立 被引量：12

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作者 曾少灵 孙洁 +9 位作者 秦智锋 阮周曦 林庆燕 花群义 曹琛福 杨俊兴 吕建强 张彩虹 陈兵 陈书琨 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第12期22-27,共6页

设计两套反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,建立了检测美洲型猪蓝耳病病毒及其高致病性变异株的RT-LAMP方法。采用RT-LAMP方法与实时荧光RT-PCR方法检测58份病料,结果一致,但RT-LAMP方法的灵敏度大约高出10倍。RT-LAMP方法特异性良好... 设计两套反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,建立了检测美洲型猪蓝耳病病毒及其高致病性变异株的RT-LAMP方法。采用RT-LAMP方法与实时荧光RT-PCR方法检测58份病料,结果一致,但RT-LAMP方法的灵敏度大约高出10倍。RT-LAMP方法特异性良好,检测猪瘟、伪狂犬病和细小病毒等均未出现交叉反应。结果表明,建立的美洲型猪蓝耳病病毒及其高致病性变异株RT-LAMP检测方法具有特异、灵敏、高效和简便的特点,在我国猪蓝耳病快速检测领域将有广阔的应用前景。 展开更多

关键词 RT-LAMP 猪蓝耳病 猪蓝耳病病毒高致病性变异株

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禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏性试验 被引量：5

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作者 秦智锋 吕建强 +8 位作者 肖性龙 张东林 李环玲 陈书琨 钟安清 黄运生 林庆燕 林镜中 刘胜利 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期336-340,共5页

为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度,通过测定已知鸡胚半数致死量(ELD50)的标准毒株的进行了定量。利用9～11日龄SPF鸡胚... 为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度,通过测定已知鸡胚半数致死量(ELD50)的标准毒株的进行了定量。利用9～11日龄SPF鸡胚,对深圳出入境检验检疫局保存的H5和H9亚型标准禽流感毒株进行了鸡胚半数致死量(ELD50)的测定,结果为H5亚型禽流感毒株的半数致死量为10-7.75/0.2mL,H9亚型禽流感毒株的半数致死量为10-8.5/0.2mL。用所研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型标准禽流感毒株原液进行10倍连续稀释,进行实时荧光RT-PCR灵敏度的测定,结果发现:试剂盒检测H5亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10-5倍稀释液,该稀释液含有281ELD50病毒量;检测H9亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10-8倍稀释液,该稀释液含有15.8ELD50病毒量。同时检测H5和H9时,试剂盒的灵敏度要比单独检测一个亚型时的灵敏度增加一个数量级。本灵敏度已经能够检测到感染鸡的喉拭子和(或)泄殖腔拭子所采集的病毒量,能够满足检验检疫的实际需要。 展开更多

关键词 禽流感病毒 鸡胚半数致死量 多重实时荧光RT-PCR 灵敏性试验

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4种动物虫媒病病毒多重RT-PCR检测方法的建立 被引量：5

8

作者 阮周曦 花群义 +6 位作者 杨俊兴 曾少灵 曹琛福 秦智锋 吕建强 林庆燕 周晓黎 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第2期25-31,共7页

分别设计和合成4对特异性引物,通过对反应条件的优化,初步建立了鉴别蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水疱性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)的多重RT-PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对... 分别设计和合成4对特异性引物,通过对反应条件的优化,初步建立了鉴别蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水疱性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)的多重RT-PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对引物可对同一样品中的VSV、BTV、EHDV和AKV进行特异性扩增,所扩增的目的片段的长度分别为301、351、537、250bp。建立的四重RT-PCR检测方法能够检测出10-7稀释的细胞培养病毒液,4种病毒之间没有发生交叉反应,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。所建立的多重RT-PCR方法可用于上述4种动物虫媒病病毒的快速鉴别诊断,在动物检疫、临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。 展开更多

关键词 蓝舌病病毒 鹿流行性出血病病毒 水疱性口炎病毒 赤羽病病毒 多重RT-PCR

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新城疫病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立 被引量：7

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作者 陈兵 胡运发 +12 位作者 孙洁 陈书琨 刘建利 曾少灵 曹琛福 张彩虹 阮周曦 林庆燕 吕建强 杨俊兴 花群义 卢体康 秦智锋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第7期11-14,共4页

新城疫是影响家禽养殖业的重大动物疫病,建立现场快速分子学检测方法是其防控关键。借助热裂解法抽提病毒RNA,在筛选出最佳核酸染料Calcein的基础上,建立新城疫病毒(NDV)实时荧光反转录环介导等温扩增(rRT-LAMP)检测法,并对该法进行特... 新城疫是影响家禽养殖业的重大动物疫病,建立现场快速分子学检测方法是其防控关键。借助热裂解法抽提病毒RNA,在筛选出最佳核酸染料Calcein的基础上,建立新城疫病毒(NDV)实时荧光反转录环介导等温扩增(rRT-LAMP)检测法,并对该法进行特异性、敏感性及准确性分析。试验结果显示,本试验所建立的NDV-rRT-LAMP方法可有效鉴别NDV,其敏感性可检测至50个基因拷贝,与国家标准实时荧光定量RT-PCR检测法一致;该法特异性强,与AIV、IBV等常见禽呼吸道传染病病原无交叉反应。小规模田间试验显示,该法用于NDV的普查监测,结果可靠。结果表明,建立的NDV-rRT-LAMP检测法可满足NDV现场快速分子检测需求。 展开更多

关键词 新城疫病毒 实时荧光反转录环介导等温扩增 现场检测

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鸡传染性法氏囊病病毒RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量：5

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作者 孙洁 卢体康 +13 位作者 曾少灵 杨俊兴 詹爱军 林庆燕 曹琛福 陈兵 廖立珊 阮周曦 陶虹 张彩虹 刘建利 花群义 吕建强 秦智锋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第12期6-10,共5页

鸡传染性法氏囊病(IBD)是危害我国养禽业的主要疫病之一,呈世界性分布,对养鸡业造成重大危害。在国际种禽贸易中,对IBDV检测是口岸检疫的主要对象之一。为了建立标准的鸡传染性法氏囊病病毒分子检测方法,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐... 鸡传染性法氏囊病(IBD)是危害我国养禽业的主要疫病之一,呈世界性分布,对养鸡业造成重大危害。在国际种禽贸易中,对IBDV检测是口岸检疫的主要对象之一。为了建立标准的鸡传染性法氏囊病病毒分子检测方法,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的带有通用引物和酶切位点的特异性引物,通过对6株不同毒株的反复试验,优化了针对A片段VP2基因的常规反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法 (IBDV-VP2(604)-RT-PCR)和针对B片段VP1基因的RT-PCR检测方法(IBDV-VP1(642)-RT-PCR);针对A片段VP2基因设计特异性引物和探针,建立了优化IBDV特异性实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)检测方法(IBDV-VP2-rRT-PCR)。将传染性法氏囊病疫苗-法倍灵(IBDV-BLEN)疫苗株进行系列稀释,两种RT-PCR检测方法的灵敏度均为10-3,而IBDV-VP2-rRT-PCR检测方法灵敏度为10-4。所建立的三种分子生物学检测方法特异,与其他家禽病毒无任何交叉反应。通过对自2007年以来18批221份田间样品检测表明,所建立的方法准确可靠,适合对鸡传染性法氏囊病病毒进行快速灵敏检测和监测。 展开更多

关键词 传染性法氏囊病 常规RT-PCR 实时荧光定量RT-PCR 快速检测

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小反刍兽疫病毒N蛋白B细胞表位预测、合成及间接ELISA方法的建立 被引量：5

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作者 曾少灵 阮周曦 +10 位作者 唐金明 廖立珊 孙洁 林庆燕 吕建强 叶奕优 祝贺 李希强 王红英 杨俊兴 花群义 《动物医学进展》 北大核心 2015年第8期40-44,共5页

基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法... 基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法,用于检测小反刍兽疫山羊临床血清样品,以对预测的B细胞抗原表位进行验证。结果显示,研制的间接ELISA敏感性为96.0%,特异性为96.25%,与进口标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.15%。结果表明,研制的间接ELISA方法适用于小反刍兽疫临床血清抗体的检测。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 N蛋白 B细胞表位 酶联免疫吸附试验

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猪流行性腹泻病毒分离鉴定与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：5

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作者 唐金明 陈书琨 +14 位作者 林庆燕 黄新亚 卢体康 孙洁 阮周曦 曾少灵 祁振强 吕建强 杨俊兴 曹琛福 张彩虹 刘建利 廖立珊 花群义 秦智锋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第8期31-35,共5页

采用Vero-76细胞系从临床样品小肠内容物中分离到1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),通过RT-PCR进行了鉴定。针对PEDV,参照保守的M基因序列设计了特异性引物和探针,建立了针对PEDV特异性的实时荧光定量RT-PCR检测方法(PEDV-rRT-PCR)。所建立的... 采用Vero-76细胞系从临床样品小肠内容物中分离到1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),通过RT-PCR进行了鉴定。针对PEDV,参照保守的M基因序列设计了特异性引物和探针,建立了针对PEDV特异性的实时荧光定量RT-PCR检测方法(PEDV-rRT-PCR)。所建立的方法特异性强,与传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪细小病毒等猪主要病原体无交叉反应;方法灵敏度高,检测灵敏度达到重组质粒10-8稀释度(约20cop);重复性好,组内变异系数≤0.26%。20份田间样品检测结果表明,所建立的PEDV-rRTPCR方法快速、灵敏,检测结果准确可靠,适合用于PEDV的快速检测和流行病学调查。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 病毒分离 实时荧光定量RT-PCR

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深圳出入境检验检疫局动检实验室禽流感检测情况与分析 被引量：4

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作者 秦智锋 范万红 +4 位作者 吕建强 林庆燕 陈书琨 曾少灵 毕英佐 《动物医学进展》 CSCD 2006年第1期108-110,共3页

通过深入分析深圳出入境检验检疫局动检实验室对禽流感开展的病原学检测方法和血清学检测方法,系统总结了目前动物检疫实验室禽流感检测与监测过程中常用的方法。在病原学检测方面,比较了鸡胚病毒分离鉴定方法、实时荧光PCR检测方法和... 通过深入分析深圳出入境检验检疫局动检实验室对禽流感开展的病原学检测方法和血清学检测方法,系统总结了目前动物检疫实验室禽流感检测与监测过程中常用的方法。在病原学检测方面,比较了鸡胚病毒分离鉴定方法、实时荧光PCR检测方法和乳胶凝集试验检测方法的优劣,提出了适合本实验室的病毒快速鉴定方法。鉴于生物安全的要求,对禽流感病毒检测采用施实时荧光RT-PCR,同时不断开展新的检测方法。在血清学检测方面,全面总结了在常规的HA和HI检测中的注意事项,并对近年来深圳出入境检验检疫局的血清学检测数据进行了分析。 展开更多

关键词 禽流感 抗原检测 抗体检测

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水疱性口炎病毒免提取核酸荧光定量PCR鉴别检测方法的建立 被引量：3

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作者 张彩虹 林彦星 +6 位作者 杨俊兴 曹琛福 吕建强 黄超华 祁振强 林庆燕 花群义 《动物医学进展》 北大核心 2018年第11期25-29,共5页

为建立可快速鉴别水疱性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)免提核酸的荧光定量PCR检测方法,根据VSV-IND和VSV-NJ两种血清型相对保守的L基因序列,设计2对特异性引物和2条探针,探针用不同的荧光基团进行标记。经过对各反应... 为建立可快速鉴别水疱性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)免提核酸的荧光定量PCR检测方法,根据VSV-IND和VSV-NJ两种血清型相对保守的L基因序列,设计2对特异性引物和2条探针,探针用不同的荧光基团进行标记。经过对各反应条件的优化,建立了直接从样品中鉴别VSV-IND和VSV-NJ的荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性和敏感性进行分析。结果显示,该直扩荧光定量PCR能准确鉴别VSV-IND和VSV-NJ,两者没有交叉反应现象,对其他几种相似病原的灭活抗原,如口蹄疫病毒(FMDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等检测均呈阴性。对10倍系列稀释的水疱性口炎灭活病毒液的检测敏感性可达10-5,与传统的荧光定量PCR的检测敏感性相当。该方法无需提取核酸,可在2h内完成对样品的检测,结果准确、快速、灵敏,为印第安纳型和新泽西型水疱性口炎病毒的特异性鉴别提供了一种切实可行的方法。 展开更多

关键词 水疱性口炎病毒 直扩荧光定量PCR 鉴别检测

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甲型H1N1(2009)流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价 被引量：2

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作者 秦智锋 张彩虹 +10 位作者 孙洁 刘建利 卢体康 阮周曦 林庆燕 吕建强 曹琛福 曾少灵 陈书琨 廖立珊 花群义 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期48-53,共6页

自甲型H1N1(2009)流感病毒于2009年在世界多个国家暴发流行后,许多国家的猪群中检测到该病毒的存在,因此建立快速准确的甲型H1N1流感病毒的检测方法成为迫切需求。本研究针对甲型H1N1(2009)流感病毒NA基因设计特异性引物和探针,建立甲型... 自甲型H1N1(2009)流感病毒于2009年在世界多个国家暴发流行后,许多国家的猪群中检测到该病毒的存在,因此建立快速准确的甲型H1N1流感病毒的检测方法成为迫切需求。本研究针对甲型H1N1(2009)流感病毒NA基因设计特异性引物和探针,建立甲型H1N1(2009)流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。并将该方法与WHO推荐美国CDC建立的检测方法和美国农业部推荐的检测方法进行比较。通过田间试验验证该方法在实际应用中的效果。结果表明:本研究建立的方法对检测甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的灵敏度达到10-6,与WHO推荐的A型流感病毒实时荧光PCR检测方法的灵敏度一致,并且高于美国农业部推荐方法的检测灵敏度(10-5);该方法特异性强,与经典型H1N1和其他亚型流感病毒株无任何交叉反应。与香港兽医化验所进行了检测比对,检测灵敏度和特异性完全一致。近3 800份的田间试验表明,所建立的方法准确可靠。本研究所建立检测方法快速灵敏,检测结果准确可靠,适合用于甲型H1N1(2009)流感病毒的分子生物学检测和监测。 展开更多

关键词 甲型H1N1(2009)流感病毒 实时荧光RT-PCR 快速检测

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PRRSV云南A06株ORF5和ORF7基因的克隆与序列分析 被引量：2

16

作者 曾少灵 林庆燕 +8 位作者 花群义 张彩虹 阮周曦 杨俊兴 孙洁 秦智锋 曹琛福 陈兵 吕建强 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第3期12-17,共6页

设计2对引物分别扩增PRRSV的ORF5和ORF7基因,对从云南某猪场分离到的毒株A06进行RT-PCR检测,得到2条特异性扩增带,克隆至pMD18-T载体并测序。将A06株的ORF5和ORF7基因及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR2332... 设计2对引物分别扩增PRRSV的ORF5和ORF7基因,对从云南某猪场分离到的毒株A06进行RT-PCR检测,得到2条特异性扩增带,克隆至pMD18-T载体并测序。将A06株的ORF5和ORF7基因及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR2332和7株中国分离的美洲型毒株相应基因进行核苷酸和氨基酸序列比对分析。结果显示,A06株属于美洲型,其ORF5和ORF7基因及推断氨基酸与我国2006年分离的4株HP-PRRSV代表株的相似性高达98%～99%,与欧洲型代表株LV的相似性只有56%～64%。分别构建了以上毒株ORF5和ORF7基因的亲缘关系图谱,反映了A06株ORF5和ORF7基因的进化位置,完成2个基因的遗传变异分析。 展开更多

关键词 PRRSV ORF5基因 ORF7基因 亲缘关系图谱

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因真核表达载体的构建及表达 被引量：2

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作者 廖立珊 曾少灵 +10 位作者 孙洁 杨俊兴 阮周曦 张彩虹 曹琛福 唐金明 叶奕优 吕建强 秦智锋 林庆燕 花群义 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第9期25-28,共4页

为进一步研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的结构、功能及免疫学特性,提取PRRSV云南分离株A06RNA,设计特异性引物扩增全长N基因,得到长度为372bp的目的片段,克隆至杆状病毒Bac-To-Bac表达载体pFastBac HTB中,转化大肠埃... 为进一步研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的结构、功能及免疫学特性,提取PRRSV云南分离株A06RNA,设计特异性引物扩增全长N基因,得到长度为372bp的目的片段,克隆至杆状病毒Bac-To-Bac表达载体pFastBac HTB中,转化大肠埃希菌DH10Bac进行同源重组,成功构建了含有N基因的真核表达载体,转染Sf9细胞,回收得到重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达产物17ku,与预期大小一致,能与PRRSV阳性血清产生特异性反应。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N基因 杆状病毒 表达

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单一引物标记LUX荧光RT-PCR鉴别BTV和EHDV 被引量：2

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作者 张彩虹 花群义 +7 位作者 阮周曦 杨俊兴 曾少灵 陶虹 陈兵 曹琛福 林庆燕 周晓黎 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第3期6-11,共6页

采用在线LUXTM专业软件,根据BTV-NS3基因序列和EHDV-NS3基因序列,通过特异性单一引物序列3′末端的荧光标记,分别设计出两对BTV和EHDV的LUX荧光PCR引物,并采用BLAST软件对各引物进行匹配性和特异性分析,根据分析结果选择合适的引物合成... 采用在线LUXTM专业软件,根据BTV-NS3基因序列和EHDV-NS3基因序列,通过特异性单一引物序列3′末端的荧光标记,分别设计出两对BTV和EHDV的LUX荧光PCR引物,并采用BLAST软件对各引物进行匹配性和特异性分析,根据分析结果选择合适的引物合成。经过各反应条件的优化和特异性、敏感性试验,并对BTV、EHDV、VSV、PPRV、BVDV、AKV的BHK-21细胞培养物和临床样品检测,与常规RT-PCR进行对比检测,建立了能同时鉴别检测BTV和EHDV的二重LUXTM荧光PCR方法。该二重LUXTM荧光PCR的BTV和EHDV各自引物只对相应的病毒呈阳性反应,两者没有交叉反应现象,对健康牛、羊和猪基因组DNA、BKH-21细胞对照,以及其他几种相似疾病如VSV、PPRV、BVDV、AKV均呈阴性反应。该法对病毒的细胞培养液鉴别检测敏感性可达1TCID50C以上,比常规RT-PCR敏感性提高10倍以上,从样品核酸纯化到完成二重LUXTM荧光PCR反应和熔解曲线分析,仅需3h,在进出口动物检验检疫中快速鉴别BTV和EHDV具有实际应用价值。 展开更多

关键词 LUX荧光RT-PCR 蓝舌病病毒 流行性出血病病毒

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鹿流行性出血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：2

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作者 郭莹洁 杨俊兴 +6 位作者 花群义 徐聪 林庆燕 阮周曦 陈兵 卢体康 詹爱军 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第3期14-17,共4页

为了更好的研究鹿流行性出血病病毒(EHDV)的生物学特性和建立EHDV免疫学检测方法,本研究用纯化的EHDV免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,获得了2株(1A5和8H6)能够稳定分泌抗EHDV单... 为了更好的研究鹿流行性出血病病毒(EHDV)的生物学特性和建立EHDV免疫学检测方法,本研究用纯化的EHDV免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,获得了2株(1A5和8H6)能够稳定分泌抗EHDV单抗的杂交瘤细胞株。其细胞培养上清效价分别为1∶256和1∶512,腹水效价分别为1∶1024000和1∶2048000;McAb 1 A5和8H6的相对亲和力分别为0.9mg/L和0.7mg/L。间接ELISA结果显示,2株单抗仅与EHDV反应,不与蓝舌病病毒、赤羽病病毒、水疱性口炎病毒、小反刍兽疫病毒和BHK细胞反应,表明2株单抗特异性良好。这2株单抗的获得为研究EHDV生物学特性和建立EHDV检测方法奠定了基础。 展开更多

关键词 鹿流行性出血病病毒 单克隆抗体 制备

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三种家禽病毒多重RT-LAMP检测方法的建立与应用 被引量：10

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作者 陈兵 孙洁 +11 位作者 陈书琨 曾少灵 林庆燕 刘建利 陶虹 曹琛福 阮周曦 吕建强 杨俊兴 吴绍强 卢体康 秦智锋 《上海畜牧兽医通讯》 2016年第1期2-5,共4页

LAMP检测方法由于具有扩增速度快、现场检测的潜力而备受关注。但目前的研究多是聚焦于单重LAMP扩增,只能进行单个目标的检测。本研究首次将禽流感、新城疫和传染性法氏囊三种病毒性疾病作为一个检测整体,建立了对三种疫病同时进行筛选... LAMP检测方法由于具有扩增速度快、现场检测的潜力而备受关注。但目前的研究多是聚焦于单重LAMP扩增,只能进行单个目标的检测。本研究首次将禽流感、新城疫和传染性法氏囊三种病毒性疾病作为一个检测整体,建立了对三种疫病同时进行筛选检测的多重RT-LAMP检测方法。本研究首先通过减少LAMP标准反应体系中的外引物来减少引物之间的相互干扰;其次以Calcein为核酸染料,建立了禽流感、新城疫和传染性法氏囊三种病毒实时荧光多重反转录环介导等温扩增(multiplex real-time reverse transcription-LAMP,mRT-LAMP)检测方法;三是对该法特异性、敏感性及准确性进行了评价。试验结果显示:所建立的mRT-LAMP检测方法可对AIV、NDV和IBDV同时进行筛选检测,灵敏度可达到10个基因拷贝,与单重LAMP检测的灵敏度相当;所建立的方法特异性强,与其他病原体无交叉反应;小规模田间试验显示该法可用于三种病毒的快速筛选检测,结果准确可靠。结果表明:本实验建立的mRT-LAMP检测法可满足三种家禽病毒的快速筛选检测需求,具有一定的应用价值。 展开更多

关键词 多重检测 RT-LAMP检测

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