目的探究肌醇缺乏环境下骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)/果蝇与秀丽隐杆线虫蛋白同源物(homologues of the drosophila protein,mothers against decapentaplegic and the caenorhabditis elegans protein,Smad)1/5/8通...目的探究肌醇缺乏环境下骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)/果蝇与秀丽隐杆线虫蛋白同源物(homologues of the drosophila protein,mothers against decapentaplegic and the caenorhabditis elegans protein,Smad)1/5/8通路对小鼠神经干细胞增殖的影响,进一步阐明胚胎神经发育异常的分子机制。方法选取NE-4C细胞系,分为对照组和0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、150和200 mmol/L肌醇处理组;应用肌醇合成酶抑制剂碳酸锂处理细胞,分为对照组和0.75、1、1.25、1.5、1.75、2和2.5 mmol/L碳酸锂处理组;用BMP信号通路抑制剂LDN-193189进行挽回实验,分别将细胞分为对照组和0.05、0.1、0.5、1、2、4和8μmol/L LDN-193189处理组;以及对照组、碳酸锂组、无肌醇组、碳酸锂+LDN-193189组和LDN-193189组,培养24 h,3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di-phenyltetrazolium bromide,MTT]法检测各组细胞活性;逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测BMP信号通路关键基因Bmp2、Bmp4、Smad1、Smad5、Smad8以及下游靶基因Runx家族转录因子2(Runx family transcription factor 2,Runx2)的表达情况;免疫印迹法及免疫荧光检测BMP/Smad1/5/8通路关键基因的表达及定位。统计学方法采用方差分析和Dunnett's t检验。结果①0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、150和200 mmol/L肌醇处理组与对照组细胞活性分别为(119.1±1.5)%、(101.7±2.6)%、(98.9±1.4)%、(101.5±1.2)%、(97.9±1.5)%、(97.5±1.0)%、(96.5±1.2)%、(97.8±1.1)%、(94.4±1.2)%、(92.9±1.9)%、(82.9±1.5)%、(63.6±1.7)%与(147.8±2.4)%,随着培养基中肌醇浓度增加,细胞增殖能力逐渐降低(P值均<0.01)。1、1.25、1.5、1.75、2和2.5 mmol/L碳酸锂处理组与对照组细胞活性分别为(119.8±1.6)%、(128.1±1.8)%、(138.5±2.2)%、(114.4±2.3)%、(111.0±1.9)%、(106.3±1.7)%与(99.5±1.6)%,碳酸锂显著促进细胞增殖(P值均<0.05),且浓度为1.5 mmol/L时细胞增殖作用最明显。②碳酸锂组、无肌醇组与对照组Bmp2(2.17±0.26、19.81±0.92与1.00±0.13)、Bmp4(1.97±0.18、4.23±0.31与1.00±0.27)、Smad1(1.91±0.15、4.10±0.25与1.00±0.37)、Smad5(1.94±0.20、2.88±0.27与1.00±0.28)、Smad8(1.62±0.14、3.20±0.18与1.00±0.13)及Runx2(1.79±0.13、5.31±0.49与1.00±0.21)的mRNA水平比较,碳酸锂组和无肌醇组基因表达增强(P值均<0.01)。③0.05、0.1、0.5、1、2、4和8μmol/L LDN-193189处理组与对照组细胞活性分别为(96.5±0.7)%、(80.4±1.6)%、(63.8±1.1)%、(56.9±1.8)%、(29.3±2.4)%、(4.6±0.2)%、(2.6±0.2)%与(99.4±1.0)%,LDN-193189抑制细胞增殖且具有剂量依赖性(P值均<0.001)。碳酸锂组、无肌醇组、碳酸锂+LDN-193189组、无肌醇+LDN-193189组、LDN-193189组与对照组细胞活性分别为(122.1±2.0)%、(144.7±2.7)%、(82.6±2.3)%、(66.6±2.0)%、(57.3±2.1)%与(101.2±2.2)%,LDN-193189能逆转碳酸锂或无肌醇诱导的细胞增殖(P值均<0.001)。④碳酸锂组、无肌醇组、碳酸锂+LDN-193189组、LDN-193189组与对照组磷酸化Smad1/5/8相对表达量分别为1.30±0.10、1.62±0.10、0.59±0.15、0.11±0.08与1.00±0.18,表明LDN-193189能逆转肌醇缺乏环境下磷酸化Smad1/5/8蛋白表达上调(P<0.01)。⑤免疫荧光结果显示,红色荧光标记的Runx2蛋白定位于细胞核,与对照组比较,碳酸锂组和无肌醇组Runx2表达增高,LDN-193189组几乎无表达,碳酸锂+LDN-193189组表达降低,LDN-193189能逆转肌醇缺乏环境下诱导的Runx2表达上调。碳酸锂组、无肌醇组、碳酸锂+LDN-193189组、LDN-193189组与对照组Runx2蛋白相对表达量分别为2.00±0.08、2.09±0.11、1.75±0.05、1.76±0.13与1.04±0.10,表明肌醇缺乏促进Runx2表达上调(P<0.01),LDN-193189逆转碳酸锂诱导的Runx2表达上调的作用不明显,但P值接近0.05(P=0.051)。结论肌醇缺乏环境会导致BMP/Smad1/5/8通路被异常激活,调控下游靶基因Runx2,可促进神经干细胞异常增殖。展开更多
